CC BY
70
УДК 577.152.9
Л. Х. Халимова (к.т.н., доц.), Л. И. Закирова (студ.),
Н. И. Петухова (к. биол.н., доц.), В. В. Зорин (чл-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование деградации лигнина почвенными микромицетами — продуцентами лакказ
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: bio1@rusoil.net
L. Kh. Khalimova, L. I. Zakirova, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Research of lignin degradation by soil micromycetes - laccase producers
Ufa State Petrolium Technical Univercity
1, Kosmonavtov Str, 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: bio1@rusoil.net
Исследована возможность деградации лигнина опилок, лузги подсолнечника и соломы культивированием четырех штаммов почвенных мик-ромицетов П-1, В-1, К-2, Х-1 в условиях роста на оптимизированной среде Чапека. Показано, что деструкция лигнинов лузги исследуемыми грибами осуществляется на 15—32 %, лигнина соломы — на 12—24 % и опилок — на 8—15 % за 21 сут культивирования. При этом наибольшая конверсия лигнинов лузги (30—32 %) и соломы (20—24 %) наблюдалась у грибов К-2 и Х-1, лак-казная активность которых в целом коррелирует с уровнем конверсии лигнина этих материалов.
Ключевые слова: лакказа; лигнин; лигноцел-люлоза; лузга подсолнечника; микромицеты; опилки; солома.
В настоящее время уделяется большое внимание проблеме биоконверсии растительной биомассы, представляющей собой возобновляемый и легкодоступный источник сырья для микробиологического синтеза и производства биотоплив. Перспективным сырьем для микробиологической промышленности являются опилки древесины, лузга подсолнечника и солома злаковых сельскохозяйственных культур, в которых наряду с целлюлозой в значительных количествах присутствует лигнин — высокомолекулярный нерастворимый трехмерный неупорядоченный ароматический полимер, состоящий из фенил- и гидроксифе-нилпропановых структур, придающий гидро-фобность и жесткость каркасу клеточных стенок растений 1. Присутствие лигнина в растительном сырье придает ему устойчивость к биодеградации многими микроорганизмами и создает серьезную проблему для его использо-
Дата поступления 06.11.11
The possibility of sawdust, sunflower peeling and straw lignin degradation by four strains of soil micromycetes n-1, B-1, K-2, X-1 on optimized Czapek medium was searched. It has been shown that these fungi destruct peeling lignin on 15—32 %, straw lignin on 12—24 % and sawdust lignin — on 8—15 % during 21 days of cultivating. In these conditions the highest rate of peeling lignin (30— 32 %) and straw lignin (20—24 %) conversion was obtained by strains K-2 and X-1 which laccase activity correlates in general with lignin conversion level.
Key words: micromycetes; lignocelluloses; lignin; straw; sawdust; sunflower peeling; laccase.
вания в качестве субстрата в процессах микробиологического синтеза.
Одним из направлений в создании процессов биоконверсии лигнинсодержащих материалов в практически важные продукты является использование микроорганизмов, продуцирующих ферменты, способные деградировать лигнин.
Известно, что в природных условиях медленная деградация лигнина происходит благодаря внеклеточным ферментам бактерий, акти-номицетов, однако ведущая роль принадлежит грибам с их мощной окислительной и гидро-лазной ферментативной системой. Наиболее активными деструкторами лигнина являются высшие грибы 1-3, а также некоторые микромицеты 4-6, продуцирующие лакказы.
Лакказа (п-дифенол:кислород окидоре-дуктаза, ЕС 1.10.3.2), относящаяся к группе медьсодержащих фенол оксид аз, необходима для начальной атаки на полимерную молекулу
лигнина. Ее синтез у микроорганизмов индуцируется в присутствии лигнина. Так, внесение в среду культивирования природного лигнина, вызывает у базидиомицета ТтатвЬв$ Н1т$иЬа увеличение лакказной активности в десятки раз 5.
Целью настоящей работы являлось исследование деградации лигноцеллюлозных материалов (древесные опилки, лузга подсолнечника и солома злаковых) почвенными сапрофитными микромицетами (штаммы П-1, В-1, К-2, Х-1), у которых ранее была выявлена лакказная активность при культивировании на средах, содержащих соединения (пирокатехин, ремазол, резорцин), являющиеся индукторами и/или субстратами лакказ микроорга-
7
низмов 7.
В ходе жидкофазного культивирования грибов П-1, В-1, К-2, Х-1 на оптимизированной среде Чапека с лигноцеллюлозными субстратами в течение 21 сут наблюдали образование и рост грибного мицелия.
В процессе роста грибов была обнаружена лакказная активность культуральной жидкости, которую определяли по реакции окисления пирокатехина (10 мМ) в о-хинон 8. Максимальная лакказная активность проявлялась у исследуемых грибов в разное время, в период с 8-х по 18-е сутки роста (рис 1.). Для наиболее продуктивного по лакказе гриба К-2 наибольшая активность достигалась на 8-е сутки роста на соломе и лузге (рис.1).
солома лузга опилки
Рис. 1. Максимальная лакказная активность грибов П-1, В-1, К-2, Х-1 при росте на лигноцеллюлозных субстратах
В ходе исследования биодеградации лигноцеллюлозных материалов наибольшая конверсия лигнина наблюдалась при культивировании всех исследуемых грибов на лузге (15— 32 %) и соломе (12—24 %). Лигнин древесных опилок подвергался биодеградации в меньшей
степени, и в результате воздействия грибов его содержание снижалось на 8—15 % (рис.2).
Исследование деструкции лигнина лузги и соломы грибами К-2, Х-1 показало, что их лакказная активность в целом коррелирует с уровнем конверсии лигнина этих материалов (рис. 1 и 2). При этом наибольшая конверсия лигнинов лузги (30—32 %) и соломы (20—24 %) наблюдалась у грибов К-2 и Х-1.
35<
солома лузга опилки
Рис. 2. Конверсия лигнина лигноцеллюлозных материалов исследуемыми грибами за 21 сут роста на среде Чапека
В то же время относительно невысокая лакказная активность гриба В-1, и, как следствие, невысокий уровень деградации лигноцеллюлозных материалов (рис. 1 и 2, солома, опилки) оказываются прямо противоположными максимальному приросту биомассы этого гриба на лигноцеллюлозных субстратах (рис. 3, солома, лузга и опилки), что может быть обусловлено наличием активного комплекса целлюлозолитических ферментов гриба В-1. Аналогичные данные получены также для гриба П-1 (рис 3).
солома лузга опилки
Рис. 3. Прирост биомассы исследуемых грибов на лигноцеллюлозных материалах на среде Чапека
Таким образом, в результате культивирования микромицетов П-1, В-1, К-2, Х-1 на лиг-ноцеллюлозных материалах: лузга, опилки, солома были выявлены грибы К-2 и Х-1, растущие на этих субстратах и наиболее активно деградирующие лигнины лузги подсолнечника (30—32 %), соломы (20—24 %) и опилок (11-15%).
Экспериментальная часть
Деградацию лигниноцеллюлозных субстратов (соломы, лузги подсолнечника, опилок) осуществляли в условиях глубинного культивирования штаммов микромицетов П-1, В-1, К-2, Х-1 на оптимизированной жидкой среде Чапека следующего состава, (г/ л): сахароза - 20.0; (КН4)^04 - 3.0; К2НР04-3Н20 -1.0; MgS04•7H20 - 0.5; КС1 - 0.5; Ре504-7Н20 -0.01; CuS04•5H20 - 0.05; MnS04•5H20 -0.05; ZnS04-7Н20 - 0.001 9. Концентрация лигноцеллюлозных материалов в среде составляла 10%. В качестве контроля использовали среду того же состава без лигноцеллюлозы.
Стерильные среды (30 мл) инокулировали 10-ти суточной поверхностной культурой гриба, выращенной на агаризованной среде Чапека, которую вносили в виде агарового блока размером 1х1 см. Микроорганизмы культивировали в условиях перемешивания (180 об/мин) при температуре 22-23 оС в течение 21 сут.
Лакказную активность исследуемых микроорганизмов определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 410 нм в реакциях трансформации 10мМ пирокатехина фильтратом культуральной жидкости в 0.1М ацетатном буфере рН 5. За единицу условной лакказной активности принимали изменение
оптической плотности исследуемого раствора субстрата в течение 1 мин, отнесенную к 1 мл фильтрата культуральной жидкости 8.
Для анализа содержания лигнина использовали метод Класона в модификации Комарова 10. Конверсию лигнина оценивали по разности содержания лигнина в исходном лигноцел-люлозном образце и остаточным лигнином, полученным в результате обработки лигноцел-люлозного материала грибами в процессе их роста.
Литература
1. Кузнецов А. Е., Градова Н. Б. Научные основы экобиотехнологии.— М.: Мир, 2006.— 504 с.
2. Рабинович М. Л., Болобова А. В., Васильченко Л. Г. // Прикл. биохим. и микробиол.-2004.- Т. 40, №1.- С. 5.
3. Бабицкая В. Г., Щерба В. В.// Микробиол.-
1994.- Т. 63, №1.- C.27.
4. Кадималиев Д. А., Ревин В. В., Шутова В. В., Самуилов В. Д. // Прикл. биохим. и микробиол.- 2004.- Т.40, №1.- С.57.
5. Yuan H. L., Wsng J. S., Chen W. X. // Прикл. биохим. и микробиол.- 2006.- T.42, №l.-C. 59.
6. Кастельянос О. А., Синицын А. П., Власенко Е. Ю. // Прикл. биохим. и микробиол.-
1995.- Т.31, №3.- С.275.
7. Халимова Л. X., Шараева А. А., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2010.- Т.17, №5.- С.46.
8. Королева О. В., Явметдинов И. С., Шлеев С. В., Степанова Е. В., Гаврилова В. П. // Биохим.-2001.- Т.66, №6.- C.762.
9. Методы экспериментальной микологии / под ред. В. И. Билай.- Киев: Наукова думка, 1982.- 550 с
10. Оболенская А. В., Ельницкая З. П., Леонович А. А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы.- М.: изд-во Экология., 1991.- 320 с.
