Скрининг микроорганизмов с целлюлазной и лакказной активностью Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 577.152.9; 577.154

Л. Х. Халимова (к. техн. н., доц.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), Т. С. Ногина (студ.), Л. М. Султанова (ст. преп.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)

S < I» I »

Скрининг микроорганизмов с целлюлазнои и лакказнои

активностью

Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: bio2@rusoil.net

L. H. Khalimova, N. I. Petukhova, T. S. Nogina, L. M. Sultanova, V. V. Zorin

Screening of microorganisms with cellulase and laccase activity

Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; рh. (347)2 431935; е-mail: bio@rusoil.net

Исследована целлюлазная и лакказная активность грибов, способных расти на лигноцеллю-лозных растительных материалах (древесных опилках, лузге подсолнечника, шишках хвойных деревьев). Выявлены культуры грибов, одновременно продуцирующие внеклеточные лак-казы и целлюлазы.

Ключевые слова: целлюлазная и лакказная активность; грибные продуценты; скрининг.

Вопросы ферментативной переработки целлюлозы рассматриваются в глобальном масштабе в связи с необходимостью защиты окружающей среды от загрязнения целлюлозо-содержащими отходами производств. В первую очередь, это касается образующейся в огромных масштабах лигнифицированной целлюлозы, которой богата одревесневшая растительная ткань, представляющая собой систему взаимопроникающих полимеров — целлюлозы и лигнина

Особенно актуальными являются процессы биоконверсии лигнифицированной целлюлозы — дешевого возобновляемого источника сырья для получения биотоплив второго поколения (биоэтанола, биобутанола, микробиоди-зеля) 2.

Для интенсификации этих процессов требуются недорогие эффективные ферментные

3

препараты лакказ, окисляющих лигнин а также целлюлаз, способных осуществлять глубокую деструкцию кристаллической целлюлозы 2.

С целью поиска продуцентов таких ферментов была исследована целлюлазная и лак-казная активность 14 культур мицелиальных

Дата поступления 08.12.09

The cellulase and laccase activity of fungi, which are able to grow on lignocellulose-containing vegetable material (sawdust, sunflower husk, strobiles) was researched. The cultures of fungi prodused extracellular laccase and cellulase simultaneously were found.

Key words: cellulase and laccase activity; fungal producers; screening.

грибов, способных расти на лигноцеллюлоз-ных материалах (древесных опилках, лузге подсолнечника, шишках хвойных деревьев).

Исследование способности препаратов внеклеточных ферментов грибов осуществлять гидролиз карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) показало, что большинство из них проявляет КМЦ-целлюлазную активность (рис. 1). Наиболее эффективно гидролизовали субстрат препараты грибов АИЗ-5 и АИЗ-12.

При исследовании лакказной активности внеклеточных препаратов ферментов в процессе окисления модельного субстрата (пирокатехина) было обнаружено, что все грибы синтезируют лакказы (рис. 2). Наибольшую окислительную активность показали культуры АИЗ-14 и АИЗ-21.

Сравнение результатов тестирования цел-люлазной и лакказной активности наиболее активных препаратов грибов показывает, что грибы АИЗ-14 и АИЗ-21 — продуценты лакказ практически не синтезируют целлюлазы. В то же время, грибы АИЗ-5 и АИЗ-12 являются продуцентами не только целлюлаз, но и ферментов с лакказной активностью. При этом лакказная активность данных микроорганизмов лишь на 30% меньше, чем у наиболее активного гриба АИЗ-12.

л н о о X ю X н и

CÖ «

eö X

!3

ч 2 ч ч

(U

3

Sä

X л

4

(U

н К о о к н

о

100 9080 7060 50 4030 2010 0

1

И

es m

rn vo о oo ON о

es m

rn vo о oo on

rooooooooooooooooo

о ^

CS CS

00 00

К К

< <

Рис. 1. Относительные значения целлюлолитической активности препаратов внеклеточных ферментов исследуемых грибов.

Sä

х

SS

и и

eö Ч

Sä

к л

ч

(U

н К о о к н

о

л н о о X ю К н и

CÖ

100 90807060 50 40 302010 0

оо

К

<

(Nm^mvOt^OOC^O

nnnnnnnn

к к к к к к к к

<<<<<<<<

es m

rn vo о oo c^ о i

'—'—'—'—1 '—<N <N

oooooooooooooooooooooooo

к к к к к к к к к к к к

Рис. 2. Относительная лакказная активность исследуемых грибов.

Таким образом, найдены новые штаммы грибов, продуцирующие внеклеточные ферменты с лакказной и целлюлазной активностью, представляющие интерес для создания методов переработки лигноцеллюлозной биомассы в сырье для производства биотоплив второго поколения с использованием существующих биотехнологий.

Материалы и методы

Выделение грибных культур и выращивание проводили на питательных средах: среда Чапека (г/л): сахароза — 20.0; NaNO3 — 2.0 K2HPO4 - 1.0; MgS04-7H20 - 0.5; KCl - 0.5 FeS04-7H20 - 0.1; CaC03 - 3.0; агар - 20.0 среда Гетчинсона (г/л): NaN03 - 2.5; K2HP04 -1.0; MgS047H20 - 0.3; NaCl - 0.1; FeCl3 -0.01; CaCl2 - 0.1 в присутствии 2-5 % древесно-растительного материала 1.

Целлюлолитическую активность микроорганизмов определяли по скорости образования редуцирующих сахаров 4. За единицу целлю-лолитической активности исследуемого гриба принимали количество фермента, образующее 1 микромоль восстанавливающих сахаров в реакции гидролиза 1% Ыа-КМЦ в 0.1 М ацетатном буфере за 1 мин в пересчете на 1 мг вносимого белка.

Лакказную активность определяли спект-рофотометрически при 410 нм, используя в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствор пирокатехина в 0.1М Ыа-ацетатном буфере рН 5.0) согласно 5. За условную единицу лакказной активности принимали увеличение оптической плотности 1 мл реакционной смеси за 1 мин, пересчитанную на 1 мг вносимого белка. Белок оценивали методом Лоури 6.

Литература

1. Проблемы биоконверсии растительного сырья / отв. ред. Г. К. Скрябин.— М:Наука.— 1986.— 296 с.

2. Скомаровский А. А., Марков А. В., Гусаков А.

B., Кондратьева Е. Г., Окунев О. Н., Беккаре-вич А. О., Матыс В. Ю., Синицын А. П. // Прикл. биох. микробиол.— 2006.— Т. 42, №6.-

C. 674.

3. Ревин В. В., Кадималиев Д. А., Шутова В. В., Самуилов В. Д. // Прикл. биохим. микроби-ол.- 2002.- Т. 38, № 5.- С. 529.

4. Целлюлазы микроорганизмов /Отв. ред В. Л. Кретович.- М: Наука.- 1981.- 213 с.

5. Королева О. В., Явметдинов И. С., Шлеев С. В., Степанова Е. В., Гаврилова В. П. // Биохимия.- 2001.- Т. 66, №6.- С. 762.

6. Практикум по биохимии /под ред. С. Е. Северина, Г. А. Соловьевой М: Изд-во МГУ.-1989.- 509 с.

Работа выполнена при поддержке аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы), проект №2.1.2/5048 «Создание научных основ хемо-, регио- и энантионаправленной биотрансформации органических соединений и биоокисления сульфидов металлов»