CC BY
61
УДК 577.152
Л. Х. Халимова (к.т.н., доц.), А. В. Шараева (асп.), С. Ю.Соколова (студ.), Н. И. Петухова (к.биол. н., доц.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование влияния индукторов на синтез лакказ мицелиальными грибами
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, е-mail: bio1@rusoil.net
L. Kh. Khalimova, A. V. Sharaeva, S. Yu. Sokolova, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
The search of inductors' influence on the synthesis of laccases by mycelial fungi
Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str., 450062, Ufa, Russia; рh. (3472) 431935, е-mail: bio@rusoil.net
Исследовано влияние ремазола, пирокатехина, резорцина, ионов Mn2+ на синтез лакказ мицелиальными грибами при глубинном культивировании на среде Чапека. Показано, что уровень лакказной активности возрастает в 2—6 раз у всех исследуемых микромицетов при использовании в качестве индуктора пирокатехина или ремазола в концентрации 10 мкМ. Резорцин не оказывает существенного влияния на синтез лакказы. Внесение хлорида марганца в среду совместно с пирокатехином увеличивает лакказ-ную активность гриба Fusarium sp. АИЗ-12 в 8 раз.
Ключевые слова: индукторы; лакказа; микро-мицеты; пирокатехин; ремазол.
The influence of remazol, pyrocatechol, resor-cinol, Mn2+ ions on the synthesis of laccases by mycelial fungi in submerged cultivation in the Czapek's medium was searched. It has been shown, that the addition of 10 |iM remazol or pyrocatechol as an inductor allows to increase the level of laccase activity of all micromycetes in 2— 6 times. Resorcinol doesn't show any considerable effect on the laccase synthesis. The joint addition of manganese chloride and pyrocatechol increases the laccase activity of strain Fusarium sp. AH3-12 in 8 times.
Key words: inductors; laccase; micromycetes; pyrocatechol; remazol.
Лакказа (КФ 1.10.3.2, п-дифенол:кисло-род оксидоредуктаза), принадлежащая к группе медьсодержащих оксидаз, катализирует окисление лигниносодержащих материалов, различных ароматических соединений (гваякола, пирокатехина, п-фенилендиамина,
n-крезола, гидрохинона, резорцина и др.), а также некоторых неорганических ионов (Mn2+; Mo(CN) 6 4- ; Fe (CN) 6 4- ; Os(CN)
6
Wo(CN) 6 4- ),
с одновременным восстановлением кислорода воздуха до воды 1-3.
О
Н2О
- субстрато
субстратв
О
Н2О
медиаторокис
медиаторВоСС
субстрато
субстратВ
лакказа
Дата поступления 20.10.10
Редокс-медиаторы (диаммониевая соль 2,2'-азино-бмс-(этилбензотиазолин-6-сульфо-новой) кислоты (ABTS), 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилоксил (ТМПО), октоцианомолиб-дат и октациановольфрамат калия и др.) значительно расширяяют субстратную специфичность л акказ. B присутствии медиаторов лакказы способны окислять нефенольные соединения различной природы.
Уникальные свойства лакказ позволяют использовать их в различных биотехнологиях, в частности, для получения биосвязующего агента, заменяющего фенол-формальдегидные смолы в производстве древесно-волокнистых плит, для экологически чистого отбеливания тканей и бумажной массы, для удаления следов кислорода в продуктах питания с целью увеличения срока хранения, для биодеградации ксенобиотиков, в том числе отравляющих веществ, для производства биосенсоров, для диагностики в иммуноферментном анализе и др.4-6 На основе лакказ могут быть созданы долговечные миниатюрные источники энергии для имплантантов в живые организмы, не требующие периодической дозаправки, а также катоды для восстановления молекулярного кислорода.3' 4 Особый интерес вызывает перспектива применения лакказ в органическом синтезе для получения биологически активных
7-13
веществ и электропроводящих полимеров (например, полианилина), обладающих исключительными свойствами в сравнении с низ-
14
комолекулярными полупроводниками.
Наиболее изученными продуцентами лак-каз являются базидиомицетовые грибы. Вместе с тем недавно было показано, что продуцентами лакказ с новыми практически важными свойствами могут служить мицелиальные грибы, принадлежащие к аскомицетам и дейтеро-мицетам.15' 16
Для повышения выхода лакказ при глубинном культивировании продуцентов используют органические или неорганические индукторы, стимулирующие синтез фермента на
5' 17
транскрипционном уровне.
Ранее нами были найдены новые продуценты лакказ из числа мицелиальных грибов рода Fusarium (штаммы АИЗ-12 и Л4),
а также неидентифицированный гриб АИЗ-1, которые показали высокую лакказную активность на плотной среде Чапека, содержащей 1 мкМ пирокатехина.18 В настоящей работе исследован синтез лакказ этими микрорганизмами в условиях глубинного культивирования на среде
Чаиека с различными индукторами (пирокатехином, ремазолом, резорцином и хлоридом марганца).
При исследовании динамики лакказной активности грибов в процессе роста на среде, содержащей 10 мкМ пирокатехина, было обнаружено, что максимальная окислительная активность во всех вариантах достигается на 6 сутки культивирования микроорганизмов (рис. 1). При этом в случае культур Л-4 и АИЗ-1 наблюдался менее выраженный дополнительный пик активности на 4 сутки, что указывает на наличие у этих грибов нескольких изоферментов с лакказной активностью 1
-АИЗ-12
-АИЗ-1
-Л-4
4 6 Время, сут
10
12
Рис. 1. Динамика лакказной активности грибов при росте на среде Чапека, содержащей пирокатехин (10 мкМ)
Сравнение значений окислительной активности шестисуточных культуральных жидкостей гриба Л4, полученных как в присутствии, так и в отсутствие в среде пирокатехина, показало, что это соединение является эффективным индуктором синтеза лакказы, увеличивающим в 5 раз активность продуцента (рис. 2).
При исследовании влияния альтернативных потенциальных индукторов на лакказную активность шестисуточного гриба Л4 было обнаружено, что ремазол является еще более активным индуктором, тогда как резорцин и ионы марганца практически не стимулируют синтез лакказы. Аналогичные исследования, выполненные с шестисуточной культурой гриба АИЗ-1, показали, что синтез его лакказы индуцируется всеми исследуемыми соединениями (рис. 3). Наибольший эффект вызывают, так же, как и в случае гриба Л4, пирокатехин и ремазол, увеличивающие лакказную активность гриба АИЗ-1 в 6 раз.
и л"
¡3 30Н о х ю х н и
ей §
X
¡3 10
и и
ей
20
1
3
4
5
Варианты
Рис. 2. Влияние индукторов на синтез лакказы грибом Л4:
1 — контроль; 2 — пирокатехин (10 мкМ); 3 — ремазол (10 мкМ); 4 — резорцин (10 мкМ); 5 — МпС12 (100 мкМ).
и
л" н о о X ю к н и
ей
5
X
и и
ей
20
16
12
Варианты
Рис. 3. Влияние индукторов на синтез лакказы грибом АИЗ-1:
1 — контроль; 2 — пирокатехин (10 мкМ); 3 — ремазол (10 мкМ) ; 4 — резорцин (10 мкМ); 5 — МпС12 (100 мкМ).
25
и
£ 20 о о х
« 15
н и
ей
« 10
сЗ
х
и и
ей
■
Шш || 1.1.
4
Варианты
Рис. 4. Влияние индукторов на синтез лакказы грибом АИЗ-12: 1 — контроль; 2 — пирокатехин (10 мкМ); 3 — ремазол (10 мкМ) ; 4 — резорцин (10 мкМ); 5 — МпС12 (100 мкМ); 6 — пирокатехин (10 мкМ) и МпС12 (100 мкМ); 7 - ремазол (10 мкМ) и МпС12 (100 мкМ).
8
4
0
3
7
В случае гриба АИЗ-12 только пирокатехин вызывал существенное увеличение лакказ-ной активности (в 5 раз), тогда как остальные соединения оказались малоэффективными (рис. 4). Вместе с тем было обнаружено, что совместное внесение пирокатехина и хлорида марганца в среду приводит к наибольшему эффекту: увеличивает лакказную активность гриба в 8 раз. Суммарное действие резорцина и хлорида марганца также существенно увеличивают лакказную активность гриба, но менее значительно, чем пирокатехин.
Полученные результаты показывают, что пирокатехин, ремазол и ионы Mn2+ эффективно индуцируют синтез лакказ у исследуемых мицелиальных грибов.
Экспериментальная часть
Культивирование грибов осуществляли на жидкой питательной среде Чапека (сахароза — 10 г/л, (NH4)2 SO4 - 3 г/л, K2HPO4 - 1 г/л, MgSO4 - 0.5 г/л, KCl - 0.5 г/л FeSO4 -0.01 г/л). Органические индукторы лакказ (пирокатехин; ремазол и резорцин) вносили в среду в концентрации 10 мкМ. Неорганический индуктор лакказ МпС12 добавляли в среду в концентрации 100 мкМ. Микроорганизмы выращивали при температуре 30 оС на качалке (180 об/мин) в течение 12 сут.
Для определения внеклеточной лакказной активности из культуральной жидкости удаляли клетки грибов центрифугированием в течение 5 мин при 5000 об / мин. Лакказную активность супернатантов определяли спектрофото-метрически при X = 410 нм, используя в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствор пирокатехина в 0.1М Na-ацетатном буфере рН 5. За единицу активности лакказы (ед.) принимали увеличение оптической плотности реакционной смеси за 1 мин 5.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Литература
Морозова О. В., Шумакович Г. П., Шлеев С. В., Ярополов А. И. // Прикл. биохимия и микробиология.- 2007.- Т. 43, № 5.- С. 583. Baldrian P. // FEMS Microbial. Rev.- 2006.-V. 30.- 215.
Sharma K. K., Kuhad R. C. // Indian J. Microbiol.- 2008.- V. 48.- P. 309.
Industrial. Biotechnol.- 2005.- V.1.-
Xu F. P. 38.
Горбатова О. H., Королева О. В., Ландесман Е. О., Степанова Е. В., Жердев А. В. // Прикл. биохимия и микробиология.— 2006.— Т. 42, № 4.-С. 468.
Горошина Е. С., Русинова Т. В., Бирюков В. В., Морозова О. В., Шлеев С. В., Ярополов А. И. // Прикл. биохимия и микробиология.-2006.- Т. 42, № 6.- С. 638.
7. Riva S. // Trends Biotechnol.- 2006.- V. 24, N.5.- Р. 219.
8. Burton S.G. // Curr. Org. Chem.- 2003.-V. 7.- C. 1317.
9. Mikolasch A., Hammer E., Jonas U., Popowski K., Stielow A., Schauer F. // Tetrahedron.-2002.- V. 58.- C. 7589.
10. Mikolasch A., Matthies A., Lalk M., Schauer F. // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2008.- V. 80.- P. 389.
11. Nicotra S., Intra A., Ottolina G., Riva S., Danieli B. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2004.-V. 15.- P. 2927.
12. Nicotra S., Cramarossa M. R., Mucci A., Pagnoni U.M., Riva S., Forti L. // Tetrahedron.-2004.- V. 60.- P. 595.
13. Ciecholewski S., Hammer E., Mandra K., Bose G., Nguyen V.T.H., Langer P., Schauer F. // Tetrahedron.- 2005.- V. 61.- P. 4615.
14. Karamyshev A. V., Shleev S. V., Koroleva O. V., Yaropolov A. I.,. Sakharov I. Yu // Enzym. Microbial Technol.- 2003.- V.- 33.- P. 556.
15. Hernandez Fernaud J. R., Carnicero A., Perestelo F., Hernandez Cutuli M., Arias E., M. A. Falcon // Enzym. Microbial Technol.- 2006.- V.38.-Р. 40.
16. Tetsch L., Bend J., Holker U. // Antonie van Leeuwenhoek.- 2006.- V. 90.- P. 183.
17. Gnanamania A., Jayaprakashvel M., Arulmani M., Sadulla S. // Enzym. Microbial. Technol.-2006.- V. 38.- P. 1017.
18. Халимова Л. X., Петухова H. И., Ногина Т. С., Султанова Л. М., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2009.- Т. 16, №4.- С. 68.
