CC BY
72
УДК 579.66:547.94
А. А. Шараева (асп.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), Л. Х. Халимова (к.т.н., доц.), И. Г. Шакиров (студ.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
ВЛИЯНИЕ ГЛИЦЕРИНА НА РОСТ И ОКИСЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ТРУТОВОГО ГРИБА - ПРОДУЦЕНТА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ОКСИДОРЕДУКТАЗ
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (347) 2431935, e-mail: biocatnp@yandex.ru
A. A. Sharaeva, N. I. Petukhova, L. Kh. Khalimova, I. G. Shakirov, V. V. Zorin
EFFECT OF GLYCEROL ON GROWTH AND OXIDATIVE ACTIVITY OF POLYPORE FUNGUS - EXTRACELLULAR OXIDOREDUCTASES PRODUCER
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: biocatNP@yandex.ru
Исследовано влияние глицерина на рост и окислительную активность внеклеточных ферментов, синтезируемых культурой трутового гриба Готез ^тепЬапеж Э-1 в процессе поверхностного культивирования на модифицированной среде Королевой-Скоробогатько с лузгой подсолнечной. Показано, что глицерин в концентрации 1—3 % увеличивает в 1.6—1.7 выход грибной биомассы. В фильтратах культуральной жидкости обнаружены ферменты, способные окислять пирокатехин. Выявлены три максимума окислительной активности (на 2, 7 и 16 сутки культивирования), что указывает на способность гриба синтезировать не менее трех ферментов, окисляющих пирокатехин. При высоких концентрациях глицерина (3%) в среде окислительная активность фильтратов существенно снижается. В тоже время на среде с 1% глицерина наблюдается значительное увеличение окислительной активности двух- и семису-точных фильтратов культуральной жидкости.
Ключевые слова: базидиомицеты; биотехнология; лакказы; оксидоредуктазы.
The effect of glycerol on growth and oxidative activity of extracellular enzymes produced by polypore fungus Fomes fomentaricus E-1 during the surface cultivation on modified medium of Korolyova-Skorobogat'ko with sunflower husk was studied. It is shown that addition of glycerol in concentration 1—3 % leads to 1.6—1.7-fold increase in the yield of fungal biomass. In cultural broth filtrates the enzymes capable to oxidize pyrocatechol were found. Three maximums of oxidative activity (on the 2nd, 7th and 16th days of cultivation) were determined as indication on presence of three different pyrocatechol-oxidizing enzymes. At high concentration of glycerol (3%) in medium oxidative activity of enzymes significantly decreases. However on medium with 1% glycerol the significant increase of oxidative activity is observed in cultural broth filtrate on 2nd and 7th days of cultivation.
Key words: basidiomycetes; biotechnology; laccase; oxidoreductase.
Трутовые грибы способны продуцировать внеклеточные оксидоредуктазы, участвующие в деградации лигнина: лигнинпероксидазу (ЕС 1.11.1.14), марганецзависимую перокси-дазу (МпР, ЕС 1.11.1.13) и лакказу (п-дифе-нол: кислород оксидоредуктазу, ЕС 1.10.3.2) 1-3. Эти ферменты играют важнейшую роль в деградации растительных остатков и могут быть использованы в различных областях промышленности, в частности, при производстве современных экологически чистых древесноволокнистых плит, в синтезе лекарственных веществ, электропроводящих полимеров и красителей,
Дата поступления 18.05.14
отбеливания тканей, при приготовлении пищевых продуктов длительного хранения, для биодеградации ксенобиотиков, в том числе отравляющих веществ, изготовления биосенсоров 1,4-11.
Перспективными продуцентами внеклеточных оксидоредуктаз являются грибы ¥оте$ fОтепЬапет, на основе которых в последние годы разрабатываются эффективные методы биосинтеза лакказ при культивировании на доступных средах 3,12,13.
В настоящей работе с целью создания биокатализаторов для синтеза фармакозначимых соединений на основе плодового тела ¥оте$ fотепЬапет, растущего на ясене, получена
мицелиальная культура Э-1 и исследована ее способность расти и секретировать внеклеточные ферменты, окисляющие пирокатехин — модельный субстрат для определения фенолок-сидазной (лакказной) активности при поверхностном культивировании на жидких средах.
Для культивирования гриба использовали модифицированную среду Королевой-Скоро-богатько (КС) 14, содержащую ионы меди, необходимые для индукции лакказ у грибов Fomes fomentaricus 12, в которую вместо глюкозы вносили глицерин, как менее дорогостоящий источник углерода 15. Кроме того, в среду также добавляли лузгу подсолнечную — отход производства подсолнечного масла, поскольку недавно было показано, что ионы меди в присутствии лигноцеллюлозы могут оказывать си-нергетический эффект на индукцию синтеза лак-каз у базидиомицетных грибов 16. В качестве контроля использовали среду без глицерина.
В результате исследования было обнаружено, что культура Fomes fomentaricus Э-1 способна расти даже в отсутствие глицерина (рис. 1). Вероятно, пептон и лигноцеллюлоза лузги подсолнечной, а также содержащиеся в ней белковые и липидные примеси (до 5—7 % 17) частично выступают в качестве источника углерода. Однако внесение глицерина в концентрации 1—2 % существенно (в 1.6—1.7 раза) увеличивает выход грибной биомассы. Дальнейшее увеличение концентрации глицерина (до 3%) в среде нецелесообразно, поскольку его стимулирующий эффект снижается.
1,4
^ 1,2 +-
С?
Л i
£ 0,8
§ 0,6 -I— Ч
s
§ 0,4 -j— w
0,2
0
Рис. 2. Рост гриба Fomes fomentaricus Э-1 на модифицированной среде КС с глицерином (1%) и лузгой подсолнечной, 25 оС, 21 сут
При исследовании окисления пирокатехина в присутствии фильтратов культуральной жидкости было установлено, что гриб способен продуцировать внеклеточные фенолокси-дазы в процессе роста на модифицированной среде КС с лузгой и глицерином. В результате анализа динамики оксидазной активности внеклеточных ферментов, синтезируемых культурой трутового гриба в процессе поверхностного культивировании на среде, содержащей 1% глицерина, выявлены три максимума окислительной активности (на 2, 7—8 и 14—16 сут культивирования), что указывает на способность гриба синтезировать не менее трех ферментов, окисляющих пирокатехин (рис. 3).
1,2
s 0,8
g 0,6
я
X
а 0,4
Варианты
Рис. 1. Влияние глицерина на выход биомассы гриба FomesОте^аНсш Э-1 в процессе поверхностного культивирования на модифицированной среде КС с лузгой подсолнечной (2%), 25 оС, 21 сут:
1 — без глицерина (контроль); 2 — 1% глицерина; 3 — 2% глицерина; 4 — 3% глицерина.
Показано, что при оптимальных концентрациях глицерина в среде гриб образует обильный мицелий (рис. 1). Наибольший выход биомассы гриба через 21 сут культивирования составляет 1.3 г (асб) на 50 мл среды (рис. 2).
О 0,2
4 6 8 10 12 14
Время культивирования, сутки
Рис. 3. Динамика оксидазной активности внеклеточных ферментов, синтезируемых культурой Fomes Оте^апсшЭ-1 в процессе поверхностного культивирования на среде, содержащей 1% глицерина
Обнаружено, что на среде с 1% глицерина наблюдается значительное увеличение окислительной активности двух- и семисуточных фильтратов культуральной жидкости по сравнению с контрольным вариантом без глицерина (рис. 4). Дальнейшее увеличение содержания глицерина в среде приводит к снижению окислительной активности этих препаратов.
В то же время окислительная активность четырнадцатисуточных фильтратов культураль-
0
ной жидкости практически не зависит от содержания глицерина в среде в области концентраций 1—2 %. Однако при более высоком содержании глицерина (3%) она существенно снижается по сравнению с контролем без глицерина (рис. 4).
1,2 -
0 -I-1-1-1-1-1-
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
сут —0—7суг % 16 сут
Рис. 4. Влияние глицерина на оксидазную активность внеклеточных ферментов, синтезируемых культурой Fomes fomentaricus Э-1 в процессе поверхностного культивирования на модифицированной среде КС с лузгой подсолнечной
Таким образом, полученные результаты показывают, что глицерин в концентрации 1% может быть использован как добавка к питательной среде для культивирования Fomes fomentaricus Э-1 с целью интенсификации роста гриба и синтеза внеклеточных фенолоксидаз.
Экспериментальная часть
Чистую культуру гриба получали культивированием материала плодового тела Fomes fomentaricus на агаризованном сусле.
Поверхностное культивирование гриба на жидких средах осуществляли при температуре 22—25 оС в конических колбах объемом 250 мл, содержащих 50 мл жидкой среды, в стационарных условиях (без перемешивания). Ис-
Литература
1. Куликова Н. А., Кляйн О. И., Степанова Е. В., Королева О. В. // Прикладная биохимия и микробиология.- 2011.- Т.47, №6.- С.619.
2. Elisashvili V., Kachlishvili E. // Journal of Biotechnology.- 2009. - V. 144. - P.37.
3. Elisashvili V., Kachlishvili E., Tsiklauri N., Metre-veli E., Khardziani T., Agathos S. N. // World J. Microbiol Biotechnol.- 2009.- V.25.- P.331.
4.
5.
6.
пользовали модифицированную среду Короле-вой-Скоробогатько 14, в которую в качестве источника углерода вместо глюкозы вносили глицерин в различных концентрациях (г/л): глицерин - 10, 20 или 30; KH2PO4 - 0.6, MgSO4-7H2O - 0.5, CuSO4-7H2O - 0.25, CaCl2 - 0.5, ZnSO4 - 0.001, FeSO4 - 0.005, пептон - 3; вода водопроводная. Кроме того, в среду вносили лузгу подсолнечную (1 г лузги на 50 мл среды) в качестве индуктора синтеза лигнинокисляющих ферментов. Контролем служила среда без глицерина.
Для засева среды использовали культуру гриба, полученную на агаризованной овсяной среде (овес - 120 г, вода водопроводная - 1 л) в чашке Петри. Питательные среды инокули-ровали блоком диаметром 15 мм, вырезанным из зоны роста колонии на агаризованном сусле.
В процессе культивирования гриба периодически отбирали пробы культуральной жидкости объемом 3 мл для исследования экстра-целлюлярной оксидазной активности.
Определение оксидазной активности проводили спектрофотометрически по скорости окисления пирокатехина (10 мМ) в 0.1 М ацетатном буфере рН 5 в присутствии фильтрата культуральной жидкости. Измерение оптической плотности реакционной смеси осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 410 нм. За единицу оксидазной активности принимали изменение оптической плотности реакционной смеси за 1 мин в пересчете на 1 мл культурального фильтрата.
Количество высушенной при 100 оС биомассы, полученной в процессе культивирования гриба в течение 21 сут, оценивали весовым методом.
References
1. Kulikova N. A., Klyain O. I., Stepanova Е. V., Ko-rolyova О. V. Ispol'zovanie bazidial'nykh gribov v tehnologiyakh pererabotki i utilizatsii tekhno-gennykh otkhodov: fundamental'nye i prikladnye aspekty [Using basidiomycetes in recycling waste and disposal of technological: fundamental and applied aspects]. Prikladnaya biokhimiya i mikro-biologiya [Applied biochemistry and microbiology Journal], 2011, v.47, no.6, pp.619-634. Elisashvili V., Kachlishvili E. [Physiological regulation of laccase and manganese peroxidase production by white-rot Basidiomycetes]. Journal of Biotechnology. 2009, v. 144, pp. 37-42.
Elisashvili V., Kachlishvili E., Tsiklauri N., Met-reveli E., Khardziani T., Agathos S.N. [Lignocellulose-degrading enzyme production by white-rot Basidiomycetes isolated from the forests of Georgia]. World J. Microbiol. Biotechnol. 2009, v. 25, pp. 331-339.
Couto S.R., Herrera J.L.T. [Industrial and biotechnological applications of laccases: a review]. Biotechnology Advances. 2006, v.24, pp. 500-513.
Couto S. R., Herrera J. L.T. // Biotechnology Advances.- 2006.- V.24.- P.500. Горбатова О. Н., Королева О. В., Ландесман Е. О., Степанова Е. В., Жердев А. В. // Прикл. биохимия и микробиология.- 2006.- Т.42, №4.- С.468.
Горшина Е. С., Русинова Т. В., Бирюков В. В., Морозова О. В., Шлеев С. В., Ярополов А. И. // Прикл. биохимия и микробиология.-2006.- Т.42, №6.- С.638.
2
3
4
7. Riva S. // Trends Biotechnol.- 2006.- V.24, №5.- Р.219.
8. Burton S. G. // Curr. Org. Chem.- 2003.-V.7.- C.1317.
9. Mikolasch A., Matthies A., Lalk M., Schauer F. // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2008.- V.80.-P.389.
10. Nicotra S., Intra A., Ottolina G., Riva S., Danieli B. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2004.-V.15.- P.2927.
11. Karamyshev A. V., Shleev S. V., Koroleva O. V., Yaropolov A. I., Sakharov I. Yu // Enzym. Microbial Technol.- 2003.- V.33.- P.556.
12. Neifar M., Jaouani A., Ellouze-Ghorbel1 R., Ellouze-Chaabouni S., Penninckx M. J. // Letters in Applied Microbiology.- 2009.-V.49.- P.73.
13. Songulashvili G., Elisashvili V., Wasser S. P Nevo E., Radar Y. // Enzyme Microb Technol. 2007.- V.41.- P.57.
14. Koroljova-Scorobogat'ko O., Stepanova E., Gavrilova V., Morozova O., Lubimova N., Dzchafarova A., Yaropolov A., Makoweev A. // J. Biotech. Appl. Biochem.- 1998.- V.28, №1.-Р.47.
15. Зорин В. В., Петухова Н. И., Шахмаев Р. Н. // Российский химический журнал. ЖВХО им. Д. И. Менделеева.- 2011.- V.55, №1.-С.77.
16. Kahraman S. S., Gurdal I. H. // Bioresource Technology.- 2002.- V.82.- P.215.
17. Степычева Н. В., Макаров С. В., Кучеренко П. Н. // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева).- 2011.- Т. LV, №1.- С.31.
_ 8.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Gorbatova O.N., Korolyova O.V., Landesman E.O., Stepanova E.V., Zherdev A.V. Induktsiya biosinteza lakkazy kak sposob uvelicheniya potentsiala detoksifikatsii bazidiomitsetami [Increase of the detoxification potential of basidiomycetes by induction of laccase biosynthesis]. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya [Applied biochemistry and microbiology Journal], 2006, v. 42, no. 4, pp. 468-474. Gorshina E.S., Rusinova T.V., Biryukov V.V., Morozova O.V., Shleev S.V., Yaropolov A.I. Dinamika oksidaznoi aktivnosti v protsesse kul'tivirovaniya bazidial'nykh gribov roda TrametesFR [The dynamics of oxidase activity during cultivation of basidiomycetes from the genus Trametes FR]. Prikladnaya biokhimiya i mikro-biologiya [Applied biochemistry and microbiology Journal], 2006, v. 42, no. 6, pp. 638-644. Riva S. [Laccases: blue enzymes for green chemistry]. Trends Biotechnol, 2006. V. 24, no.5. Pp. 219-226. Burton S.G. [Laccases and Phenol Oxidases in Organic Synthesis — a review]. Curr, Org, Chem, 2003, v. 7, pp. 1317-1331.
Mikolasch A., Matthies A., Lalk M., Schauer F., [Laccase-induced C—N coupling of substituted p-hydroquinones with p-aminobenzoic acid in comparison with known chemical routes]. Appl, Microbiol, Biotechnol, 2008, v. 80, pp. 389-397. Nicotra S., Intra A., Ottolina G., Riva S., Danieli B. [Laccase-mediated oxidation of the steroid hormone 17b-estradiol in organic solvents]. Tetrahedron: Asymmetry, 2004, v. 15, pp. 2927-2931. Karamyshev A.V., Shleev S.V., Koroleva O.V., Yaropolov A.I., Sakharov I.Yu. [Laccase-cataly-zed synthesis of conducting polyaniline]. Enzym, Microbial Technol, 2003, v. 33, pp. 556-564. Neifar M., Jaouani A., Ellouze-Ghorbel R., Ellouze-Chaabouni S., Penninckx M.J. [Effect of culturing processes and copper addition on laccase production by the white-rot fungus Fomes fomentarius MUCL 35117]. Letters in Applied Microbiology, 2009, v.49, pp. 73-78. Songulashvili G., Elisashvili V., Wasser S.P., Nevo E., Radar Y. [Basidiomycetes laccase and manganese peroxidase activity in submerged fermentation of food industry wastes]. Enzyme Microb Technol, 2007, v.41, pp. 57-61. Korolyova-Scorobogat'ko O., Stepanova E., Gavri-lova V., Morozova O., Lubimova N., Dzhafarova A., Yaropolov A., Makoveev A., [Purification and Characterization of the Constitutive form of Laccase from the Basidiomycete Coriolus hirsutus and effect of Inducers on Laccase Synthesis]. J, Biotech, Appl, Biochem, 1998, v.28, no. 1, pp. 47-54. Zorin V.V., Petukhova N.I., Shakhmaev R.N., Perspektivnye napravleniya utilizatsii glitserin-soderzhaschikh otkhodov v proizvodstve biodi-zel'nogo topliva [Future directions of disposal glycerol containing waste for biodiesel production]. Rossiiskii khimicheskii zhurnal [Russian chemical journal], 2011, v.55, no. 1, pp. 77-88. Kahraman S.S., Gurdal I.H., [Effect of synthetic and natural culture media on laccase production by white rot fungi]. Bioresource Technology, 2002, v. 82, pp. 215-217.
Stepycheva N.V., Makarov S.V., Kucherenko P.N. Vtorichnye material'nye resursy maslodobyvayu-schikh proizvodstv [Secondary material resources of oil industry]. Rossiiskii khimicheskii zhurnal [Russian chemical journal], 2011, v. LV, no. 1, pp. 31-37.
6
7
9
