CC BY
39
УДК 579.582.28
Л. Х. Халимова (к.т.н., доц.), Л. И. Закирова (студ.), Н. И. Петухова (к. биол.н., доц.), В. В. Зорин (чл-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование влияния условий культивирования микромицетов на их лакказную активность
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и химической технологии 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: biol@rusoil.net
L. Kh. Khalimova, L. I. Zakirova, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Research of influence of cultivation conditions of micromycetes on their laccase activity
Ufa State Petrolium Technical Univercity 1, Kosmonavtov Str, 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: bio1@rusoil.net
С целью интенсификации синтеза внеклеточных лакказ почвенными грибами К-2 и Л-4 была исследована их лакказная активность в процессе глубинного культивировании на питательных средах (Чапека-Докса, среде Королевой-Скоро-богатько, глюкозо-аммонийной среде с кукурузным экстрактом), а также осуществлена моди-фицикация среды Чапека-Докса путем обогащения ее биогенными добавками (дрожжевой экстракт) и микроэлементами, в том числе ионами Си2+. Показано, что при росте микроорганизмов на среде Королевой-Скоробогатько достигается наибольшая лакказная активность (не менее 70 ед /мл), а модифицированная среда Чапека-Докса обеспечивает лакказную активность культуральных жидкостей исследуемых грибов не менее 50 ед/мл.
Ключевые слова: микромицеты; лакказная активность; питательная среда.
Перспективными направлениями применения лакказ (п-дифенол:кислород-оксидоре-дуктаз, КФ 1.10.3.2) микроорганизмов является их использование для обесцвечивания красителей, обеззараживания и очистки сточных вод от ксенобиотиков, создания топливных ячеек, биосенсоров, в иммуноферментном анализе, в органическом синтезе, в пищевой промышленности и других отраслях 1-4. В ряде работ в качестве продуцентов лакказ для этих процессов 1-7 предлагается использовать высшие ксилотрофные грибы, а также почвенные микромицеты.
Ранее нами был выделен и изучен ряд почвенных микромицетов, синтезирующих лак-казы при культивировании на среде Чапека-Докса, содержащей 10 мкМ пирокатехина, среди которых наибольшую активность про-
Дата поступления 01.11.11
The activity of extracellular laccases of soil fungi Ë-4 and K-2 during the submerged cultivation on Czapek-Dox, Koroljova-Skorobogat'ko and glucose-ammonium with addition of corn extract media was researched for the purpose of the these enzymes synthesis intensification. Also the Czapek-Dox medium was modified by its enrichment with biogenic additions (yeast extract) and minor elements like Cu2+. It has been shown that the highest rate of laccase activity (no less than 70 units/ml) is obtained on Koroljova-Skorobogat'ko medium. The modified Czapek-Dox medium allowing laccase activity of culture fluid of the researched fungi no less than 50 units/ml is suggested.
Key words: micromycetes; laccase; nutrient medium.
явили штаммы К-2 и Л-4 8. В настоящей работе был осуществлен поиск более эффективной среды для синтеза лакказ этими микроорганизмами.
Важнейшим компонентом питательных сред для культивирования продуцентов фенол-оксидазных ферментов являются ионы меди, которые, как известно, входят в состав активного центра этих ферментов. Поэтому для культивирования высокоактивных продуцентов лакказы (например, базидиомицетов рода ТгатеЬе$, Сеггепа) используются питательные среды (глюкозо-аммонийная среда, среда Королевой-Скоробогатько) с повышенным содержанием ионов меди (50—250 мг/л Си504-5Н20) 9'10. Кроме того, такие питательные среды содержат кукурузный экстракт (10 г/л) или пептон (3 г/л), служащие источниками органического аммонийного азота и широкого спектра легкоусвояемых питательных ве-
ществ, в том числе свободных аминокислот, витаминов, микроэлементов, факторов роста 9'10.
В то же время в стандартной для культивирования грибов минеральной среде Чапека-Докса, в составе которой отсутствуют органические ростовые факторы, азот присутствует в виде нитрат-ионов, а ионы меди содержатся в следовых концентрациях, возможность сверхпродукции лакказ для культивируемых грибов ограничена .
В связи с этим с целью интенсификации синтеза лакказ грибами К-2 и Л-4 была исследована их лакказная активность при культивировании на альтернативных средах (среде Ко-ролевой-Скоробогатько, глюкозо-аммонийной среде с кукурузным экстрактом), а также осуществлена модифицикация среды Чапека-Док-са путем обогащения ее биогенными добавками (дрожжевой экстракт) и микроэлементами, в том числе ионами Си+2.
Культивирование грибов осуществляли глубинным способом при 28—30 оС в течение 15 сут. Лакказную активность культуральной жидкости определяли спектрофотометричес-ким методом в реакции окисления хромогенно-го субстрата — пирокатехина, образующего темноокрашенный продукт — о-хинон 10.
В результате исследования динамики лак-казной активности грибов Л-4 и К-2 в процессе культивирования было установлено ее увеличение на среде Королевой-Скоробогатько и модифицированной среде Чапека в 2—2.5 раза по сравнению со средами Чапека-Докса и глюкозо-аммонийной среде с кукурузным экстрактом. Наибольший уровень лакказной активности исследуемых грибов на среде Королевой-Скоробо-гатько составлял 68—71 ед/мл, а на модифицированной среде Чапека — 54—56 ед/мл (рис. 1).
Рис. 1. Максимальная лакказиая активность исследуемых грибов К-2 и Л-4 при выращивании на различных средах в присутствии индуктора: 1 — модифицированная среда Чапека; 2 — среда Королевой-Скоробогатько; 3 — среда Чапека-Докса; 4 — глю-козо-аммонийная среда с кукурузным экстрактом
Таким образом, для эффективного синте-3ä лакказ грибами Л-4 и К-2 наиболее перспективными являются среды (модифицированная среда Чапека-Докса, Королевой-Скоробогать-ко), содержащие ионы меди и органические добавки в виде пептона или дрожжевого экстракта, обеспечивающие выход внеклеточного фермента исследуемых грибов с активностью 50-70 ед/мл.
Экспериментальная часть
Грибы выращивали при температуре 28-30 оС методом глубинного культивирования в колбах на 250 мл, содержащих 50 мл среды, при перемешивании (150 об/мин) в течение 15 сут.
В качестве среды для культивирования грибов использовали:
- среду Чапека-Докса (сахароза — 10 г/л; NaNO3 — 3 г/л; KH2PÜ4-2H20 — 0.3 г/л; ZnSO4 — 0.04 г/л; MgSÜ4-7H20 — 0.25 г/л; KCL — 0.25 г/л; FeSÜ4-7H20 — 0.01 г/л);
- модифицированную среду Чапека-Док-са (сахароза — 10 г/л; NaNO3 — 3 г/л; KH2PÜ4-2H20 — 0.3 г/л; ZnSÜ4-7H20— 0.001 г/л; MgSO4-7H2O — 0.25 г/л; KCL — 0.25 г/л; FeSÜ4-7H20 — 0.001 г/л; MnSÜ4-5H20 — 0.05 г/л; CuSO4-5H2O — 0.05 г/л; дрожжевой экстракт — 0.2 г/л);
- глюкозо-аммонийную среду с кукурузным экстрактом (глюкоза — 20 г/л; (NH4)2SO4 — 2.5 г/л; мочевина — 0.7 г/л; KH2P04 — 0.6 г/л; K2HP04 — 0.6 г/л; MgSO4 — 0.5 г/л; кукурузный экстракт — 10 г/л);
- среду Королевой-Скоробогатько (глюкоза — 10 г/л; KH2PÜ4-2H20 — 0.6 г/л; K2HPÜ4-3H20 — 0.4 г/л; MgSO4-7H2O — 0.5 г/л; пептон — 3 г/л; CuSÜ4-5H20 — 0.25 г/л; CaCl2 — 0.5 г/л; ZnSÜ4-7H20 — 0.001 г/л; FeSÜ4-7H20 — 0.0005 г/л) 9-10.
^чальная кислотность сред составляла рH 6. Для индукции лакказной активности в среды вносили пирокатехин, в концентрации 10 мкМ. В среду Королевой-Скоробогатько сульфат меди вносили на третьи сутки роста грибов.
В качестве инокулята использовали агаровые блоки (1х1 см) грибных культур, выращенных на агаризованной среде Чапека-Докса.
Лакказную активность исследуемых микроорганизмов определяли спектрофотометри-ческим методом при длине волны 410 нм в реакциях трансформации 10 мМ пирокатехина c фильтратом культуральной жидкости в 0.1М ацетатном буфере рH 5 10. За единицу услов-
ной лакказной активности принимали изменение оптической плотности исследуемого раствора субстрата в течение 1 мин, отнесенное к 1 мл фильтрата культуральной жидкости.
Литература
1. Морозова О. В., Шумакович Г. П., Шлеев С. В., Ярополов А. И. // Прикл. биохим. микроби-ол.- 2007.- Т.43, №5.- С.583.
2. Call H. P., Mucke I. // J. Biotechnol.- 1997.-V.53.- P.163.
3. Hao O. J., Kim H., Chiang P. C. // Crit. Rev. Environ. Sci. Technol.- 1999.- V.30.- P.449.
4. Bumpus J. A. // Appl. Environ. Microbiol.-1989.- V.55.- P.154.
5. Roy-Arcand J., Archibald J. S. // Enzym. Microb. Technol.- 1991.- V.13.- P.194.
6. Александрова А. В., Медведева С. A. // Хим. раст. cbipM.- 1999, №2.- C.81.
7. Бабицкая В. Г., Щерба В. В. // Микробиол.-1994.- №1.- C.27.
8. Халимова Л. Х., Шараева А. А., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2010.- Т.17, №5.- С.46.
9. Методы экспериментальной микологии / под ред. Билай В. И.- Киев: Наук. дум.- 1982.550 с.
10. Koroljova-Scorobogat'ko O., Stepanova E., Gav-rilova V., Morozova O., Lubimova N., Dzchafarova A., Yaropolov A., Makoweev A. // J. Biotech. Appl. Biochem.- 1998.- V.28, №1.-P. 47
