CC BY
20
ВестникВГУИМ/Proceedings of VSUET DOI: http://doi.org/10.20914/2310-1202-2021-3-106-114
ISSN 2226-910X E-ISSN 2310-1202 _Оригинальная статья/Research article
УДК 670
Open Access Available online at vestnik-vsuet.ru
Разработка продуцента комплексного ферментного препарата для переработки крахмалсодержащих отходов с фильтр-прессов _при производстве хлебопекарных дрожжей_
Сергей С. Перкин Галина П. Шуваева Екатерина М. Мотина Дмитрий А. Черенков Светлана Ф. Яковлева Ольга С. Корнеева
d.cherenkov@mail .ru
0000-0002-3505-2383 0000-0002-4294-8209 0000-0002-3433-2754 0000-0002-8564-8919 0000-0003-3686-9966 0000-0002-2863-0771
1 Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия Аннотация. Недостаточное использование передовых технологий с более эффективной переработкой сырья приводит к большому количеству производственных отходов при производстве хлебопекарных прессованных дрожжей. К отходам производства дрожжевой промышленности относятся: осадок после осветления мелассы (шлам), обездрожженная бражка, промывные воды и дрожжи в виде отхода на фильтр-прессах. Выход дрожжей в виде отхода на фильтр-прессах, которые могут использоваться на кормовые цели, составляет порядка 1,5 % к массе получаемых дрожжей, а основной компонент отходов - крахмал. Для его переработки авторами проведен скрининг микроорганизмов - продуцентов и выбран генетически компетентный штамм, способный к синтезу целевых ферментов (глюкоамилазы, а-амилазы, пуллуланазы) - Rhisopus tritici t1 (Rh. oryzae t1) с активностью, энзимов, соответственно, 100,0; 8,4 и 20,0 ФЕ/мл. Разработаны условия жидкофазного культивирования продуцента, обеспечивающие максимальный биосинтез целевых ферментов и получение комплексного ферментного препарата для переработки крахмалсодержащих отходов с фильтр-прессов при производстве хлебопекарных дрожжей. Отмечено, что лучшим источником углерода для продуцента Rhisopus tritici t1 являются крахмал, декстрин и мальтоза. Рациональный состав среды, обеспечивающий максимальные величины синтезируемых ферментов, включает, %:крахмал - 6,0, азотнокислый калий - 0,8, кукурузный экстракт - 0,85. Активности ферментов - глюкоамилазы, альфа-амилазы и пуллуланазы - увеличились к 96-120 часам культивирования, соответственно, на (%): 18,0; 19,0 и 50,0. Ключевые слова: ферментный препарат, дрожжи, глюкоамилаза, а-амилаза, пуллуланаза
Development of complex enzyme preparation producer for processing starch-containing waste from pressure-type filters in the production _of baker's yeast_
Sergey S. Perkin 1 Galina P. Shuvaeva 1 Ekaterina M. Motina 1 Dmitry A. Cherenkov 1 Svetlana F. Yakovleva 1 Olga S. Korneeva 1
d.cherenkov@mail .ru
0000-0002-3505-2383 0000-0002-4294-8209 0000-0002-3433-2754 0000-0002-8564-8919 0000-0003-3686-9966 0000-0002-2863-0771
1 Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19 Voronezh, 394036, Russia
Abstract. Lack of use of innovation technology with more efficient raw material processing leads to a large amount of industrial waste while producing bakery compressed yeast. Waste from the production of the yeast industry includes: setting after clarification of molasses (residuum), de-yeast wort, scourage and yeast in the form of waste on pressure-type filters. Yeast crop as waste on pressure-type filters that can be used for feed purposes is about 1,5% by weight of the produced yeast, and the main component of the waste is starch. For its processing the authors screened microorganisms-producers and selected a genetically competent stock culture capable of synthesizing target enzymes (glucoamylase, a-amylase, pullulanase) - Rhisopus tritici t1 (Rh. Oryzae t1) with activity of enzymes 100,0; 8,4 and 20,0 fU/ml, respectively. There have been conditions developed for the liquid-phase cultivation of the producer, that provide the maximum biosynthesis of target enzymes and the production of a complex enzyme preparation for processing starch-containing waste from pressure-type filters in the production of baker's yeast. It was noted that starch, dextrin and maltose are the best carbon sources for the producer of Rhisopus tritici t1. The rational composition of the medium, providing the maximum values of the synthesized enzymes, includes, %: starch - 6,0, potassium nitrate - 0,8, corn-steep extract - 0,85. Activity of enzymes - glucoamylase, alpha-amilase and pullulanase - increased in 96-120 hours of cultivation by 18,0%; 19,0% and 50,0%, respectively.
Keywords: enzyme preparation, yeast, glucoamylase, alpha-amilase, pullulanase
Для цитирования Перкин С.С., Шуваева Г.П., Мотина Е.М., Черенков Д.А., Яковлева С.Ф., Корнеева О.С. Разработка продуцента комплексного ферментного препарата для переработки крахмалсодержащих отходов с фильтр-прессов при производстве хлебопекарных дрожжей // Вестник ВГУИТ. 2021. Т. 83. № 3. С. 106-114. doi: 10.20914/2310-1202-2021-3-106-114
For citation
Perkin S.S., Shuvaeva G.P., Motina E.M., Cherenkov D.A., Yakovleva S.F., Korneeva O.S. Development of complex enzyme preparation producer for processing starch-containing waste from pressure-type filters in the production of baker's yeast. Vestnik VGUIT [Proceedings of VSUET]. 2021. vol. 83. no. 3. pp. 106-114. (in Russian). doi:10.20914/2310-1202-2021-3-106-114
© 2021, Перкин С.С. и др. / Perkin S.S. et al.
This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License
Перкин С.С. и др. ВестникВТУИТ, 2021, Т. 83, №. 3, С- 106-114 Введение
Современное отечественное производство хлебопекарных дрожжей обеспечивает потребности российского рынка на 90%.
Несмотря на технологические модернизации, которые провели большинство российских заводов, техническое состояние отрасли остается на относительно невысоком уровне [1]. Ввиду недостаточного финансирования, практически не используются передовые технологии, связанные с энергосбережением, с более эффективным использованием сырья, и, прежде всего, с рациональным использованием производственных отходов. Рост цен на основное сырьё, тепловые и энергетические, транспортные ресурсы, делает невозможным сокращение себестоимости продукта для дрожжевых заводов, отнимая, тем самым, у предприятия возможность увеличить прибыль, обеспечить техническую модернизацию и социальное развитие.
К отходам производства дрожжевой промышленности относятся: осадок после осветления мелассы (шлам), обездрожженная бражка, промывные воды и дрожжи в виде отхода на фильтр-прессах.
Выход дрожжей в виде отхода на фильтр-прессах, которые могут использоваться на кормовые цели, составляет порядка 1,5% к массе получаемых дрожжей. Химический состав крахмалсодержащего отхода на фильтр-прессах достаточно разнообразен (таблица 1).
Таблица 1.
Химический состав крахмалсодержащего отхода
Table 1.
Chemical composition of starch-containing waste
postßvestnik-vsuet. ru
Вещество | Material Содержание, % Content, %
Жиры | Fat 0,34
Белки | Protein 6,90
Углеводы (крахмал) Carbohydrates (starch) 83,10
Вода | Water 6,52
Зола|Ash 3,14
Как видно из данных, приведенных в таблице 1, основной компонент отходов -крахмал. Крахмал - главный резервный полисахарид растений. Как известно, его полисахарид-ная фракция состоит из 2-х компонентов: амилозы и амилопектина. Амилоза легко растворяется в теплой воде, образуя истинные растворы, которые неустойчивы и способны к самопроизвольному выпадению в осадок в виде кристаллов. Молекулярная масса колеблется в пределах 50-150 тыс. Каждая молекула содержит от 300 до 500 остатков молекулы глюкозы (рисунок 1).
6CH2OH 51-O.
4N
OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
O ...
~2
OH
a-1,4
Рисунок 1. Структурная формула молекулы амилозы Figure 1. Structural formula of amylose molecule
Амилопектин (рисунок 2) в отличие от амилозы трудно растворим в горячей воде. В раствор он переходит при температуре 120 °С, образуя стойкие, но вязкие растворы. Молекулярная масса колеблется в пределах от 100 000 до 1 000 000.
а-1,6
Рисунок 2. Структурная формула молекулы амилопектина
Figure 2. Structural formula of amylopectin molecule
В пищевой промышленности и природе крахмал подвергают интенсивным ферментативным превращениям. Основной реакцией при этом превращении является гидролиз крахмала амилазами. Продуцентами этих ферментов могут быть растения, животные и бактерии. Амилазы в растениях содержатся в семенах хлебных культур, у животных - в слюне и поджелудочной железе. Их синтезируют многие бактерии рода Bacillus, микромицеты родов Aspergillus, Rhizopus. Активные амилазы содержатся в солоде. По способу действия амилазы делятся на а-амилазу, ß -амилазу, глюко-амилазу, пуллуланазу.
а-Амилаза - декстринирующий фермент, превращающий молекулу крахмала в ее осколки. Она интенсивно разжижает крахмальный клейстер, действуя на глубинные а-1,4 -гликозидные связи без определенного порядка При этом образуются декстрины и небольшое количество мальтозы.
ß-Амилаза - осахаривающий фермент, гидролизует в крахмале каждую вторую а-1,4 - гликозидную связь, начиная с нередуци-рующего конца полисахаридной цепи. Продуктами реакции являются мальтоза небольшое количество высокомолекулярных декстринов, называемых ß -амило-декстринами.
CHOH
CHOH
O
O
Рет^т ЛЗ. еЬ аС. РгосееЛпр о/^ЗЦЕТ, 2021, уоС. 83, по. 3, рр.
Глюкоамилаза в отличие от а- и р-амилаз расщепляет в молекуле крахмала а-1,4- и а-1,6 -гликозидные связи, осуществляя полный гидролиз крахмала до глюкозы. а-Амилаза и Р-амилаза гидролизуют крахмал на 95%, 5% -остаточные конечные декстрины, которые содержат все а-1,6 - гликозидные связи.
Большинство разновидностей крахмала, важных в промышленном отношении, содержит 80% амилопектина, который лишь частично расщепляется в ходе ферментативного гидролиза. Под действием а-амилаз из него образуются производные декстринов, которые далее уже гидролизоваться не могут. Так как по точкам ветвления гидролиз под действием глюкоамилазы идет медленно, используют а-1,6 - гликозидазы, из них в промышленном масштабе - пуллуланазу.
Пуллуланаза (пуллулан-6-глюкано-гидролаза, К.Ф. 3.2.1.41) гидролизует а-1,6 -гликозидные связи в пуллулане, гликогене, амилопектине и предельных декстринах, образующихся при действии на амилопектин а- и Р-амилаз. Гидролиз происходит по эндо-типу, основной продукт расщепления пуллулана -мальтотриоза. При добавлении её в комплексе с а- и Р-амилазами крахмал полностью гидро-лизуется.
Все ферменты имеют различные физико-химические свойства. а-Амилаза неустойчива к активной кислотности среды, но термоустойчива; Р-амилаза кислотоустойчива, но термолабильна; глюкоамилаза обладает высокой термической и кислотной устойчивостью. Пуллуланаза отличается высокой термостабильностью: после нагревания при 100° С в течение 10 мин остается около 80% активности.
Существенное влияние на гидролиз крахмала оказывает концентрация Н - ионов.
В связи с вышеизложенным, цель настоящего исследования состояла в разработке генетически компетентного штамма, способного к синтезу целевых ферментов для гидролиза крахмалсодержащих отходов с фильтр-прессов при дрожжевом производстве.
Материалы и методы
Основным объектом исследований служила чистая культура Я^орш ШйС и (Rh. oryzae и), депонированная в коллекцию чистых культур кафедры биохимии и биотехнологии ВГУИТ (Воронеж).
Лиофилизированная культура Я^орш ШйС и хранилась в запаянных ампулах при температуре 4 - 5 °С.
106-114 [email protected]
Оживление лиофилизированной культуры продуцента проводилось согласно МУ 2.1.4.1057-01 [2]: оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикоснуться к нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывается трехслойной марлевой салфеткой, смоченной этиловым спиртом с массовой долей 70%, хорошо отжатой и обламывается пинцетом.
После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетка осторожно снимается и вместе с остатками стекла погружается в дезраствор. В ампулу вносится ~ 0,5 мл питательного бульона для регидратации. Содержимое ампулы перемешивается, переносится стерильной пастеровской пипеткой или шприцем в центр застывшей среды, равномерно распределяя в чашке (предварительно сусло-агар с массовой долей 2% расплавляли на водяной бане, охлаждали до 48 - 50 °С и разливали в чашки Петри, чтобы дно чашки было покрыто полностью).
После засева чашки переворачивали вверх дном и инкубировали в течение 4 - 6 суток в термостате при температуре (35 ± 1) °С. Выросшие колонии просматривали сначала невооруженным глазом, затем под микроскопом. Колонию извлекали стерильной петлей и переносили в заранее подготовленную чашку Петри с сусло-агаром (СА), распределяя культуру зигзагообразными штрихами по всей поверхности чашки. По истечении 4-6 суток дрожжи переносили на скосы с сусло-агаром.
В исследованиях использовали чистую культуру микромицета, выделенную методом Коха [3].
Глубинное культивирование продуцентов проводили в качалочных колбах емкостью 750 см3, содержащих по 200 см3 питательной среды, в течение 120 ч при температуре 34 - 36 °С.
Для выращивания использовали модифицированную питательную среду (г/л): глюкоза - 2; дрожжевой экстракт - 1; СаС03 - 0,4; MgSO4 - 0,1; КН2 РО4 - 0,2; мочевина - 0,1; соевая мука - 0,5; крахмал - 6,0; вода - остальное.
Среды стерилизовали в течение 40 минут при 0,8 МПа, охлаждали до 30 °С и засевали водной суспензией продуцента.
Влияние компонентов углеводного и азотного питания на биосинтез ферментов исследовали на питательной среде при замене источников углерода и азота испытуемым веществом в таком количестве, чтобы их содержание во всех опытах было одинаковым (0,1% по азоту).
Перкин С.С. и др. ЪестницЬТУИШ, 2021, Ж. 83, №. 3, С-
Различные значения величины рН среды устанавливали добавлением 1 моль HCl или №ОН.
Состав питательной среды и условия культивирования варьировали в зависимости от задач и условий эксперимента. Состав рациональной питательной среды был уточнен с помощью методов математического планирования эксперимента.
Активности глюкоамилазы, а-амилазы, пуллуланазы определяли общепринятыми методами [4].
Микроскопирование культур проводили с помощью светового микроскопа МБИ-3.
Величину рН определяли на потенциометре рН - 150 МА.
Эксперименты проводились в трех по-вторностях; погрешность измерений опытов не превышала установленную стандартом или используемой методикой. При необходимости, в экспериментах присутствовали контрольные опыты. Достоверность результатов исследований определяли с использованием метода вариационной статистики. Обсуждались достоверные результаты с различиями по уровню значимости q <0,05. Графическая обработка данных производилась в программе Microsoft Excel 2007.
Результаты и обсуждение
Для переработки крахмалсодержащего сырья был подобран штамм-продуцент, обладающий способностью к синтезу гликозидаз, наиболее полно гидролизующих крахмал: глюкоамилазы, а-амилазы и пуллуланазы.
Исходя из анализа научных и научно-технических источников литературы, с этой целью перспективно использовать мицелиальные грибы. Микромицеты имеют большой потенциал в области микробного синтеза, проявляя способность трансформировать различные природные полимеры под действием синтезируемых ими ферментов. В отличие от других микроорганизмов они содержат значительно меньше
Биосинтез ферментов -Biosynthesis of enzymes -
106-114 [email protected]
нуклеиновых кислот, пуринов, обладают широким набором ферментов, гидролизующих полисахариды до мономеров. Биологическая переработка органических отходов с использованием ферментов, синтезируемых мицелиальными грибами, является перспективным подходом к преобразованию питательных веществ в биопродукты.
В эксперименте исследовали чистые культуры, хранящиеся в музее чистых культур кафедры биохимии и биотехнологии ВГУИТ, и полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП Гос-НИИ Генетики.
Проведен скрининг 23 штаммов микро-мицетов различных таксономических групп. Лиофилизированные культуры оживляли и выделяли моноколонии (ЧК). Выделение ЧК грибов проводили чашечным методом на твердых агаризованных средах с использованием метода серийных разведений [3]. Посев на чашки Петри производили из суспензий с разведением 10 - 103. Чашки с посевами инкубировали в термостате при температуре 34-36 °С, так как этот температурный режим способствует выделению представителей группы термотолерантных микромицетов, применение которых в биотехнологиях имеет несомненное преимущество.
Микроорганизмы выращивали глубинным способом, используя среду Чапека, г: NaNO3 - 3, KH2 PO4 - 1, MgSO4x7H2 O - 0.5, KCl - 0,5, FeSO4x7H2O - 0,01, сахароза - 30, дистиллированная вода - 1000 мл. Большинство ферментов являются экстрацеллюларными продуктами и выделяются в окружающую клетки жидкую среду, при этом обычно в мицелии трехсуточной культуры остается не более 10 - 15% ферментов. Исходя из этого, активности синтезируемых ферментов определяли в фильтрате культуральной жидкостипосле отделения биомассы. Результаты скрининга представлены в таблице 2.
Таблица 2.
гликозидаз микромицетами
Table 2.
- glycosidases by micromycetes
Активность, ед/см3
Название продуцента Activity, u/cm3
Name of the producer глюкоамилазы а-амилазы глюкоамилазы
glucoamylases а-amylases glucoamylases
1 2 3 4
Aspergillus niger F-2092 55,0 4,5 18,0
Aspergillus niger F-1119 18,4 1,5 19,0
Aspergillus niger F-2259 27,2 1,8 16,0
Aspergillus awamori F-808 118,2 5,2 10,0
Aspergillus awamori F-2250 120,2 9,4 12,0
Aspergillus awamori ВУД Т-2 110,0 4,5 16,0
Perkjn S.S. et al. Proceedings of VSUET, 2021, voC 83, no. 3, pp. 106-114 [email protected]
Продолжение таблицы 2 | Continuation of table 2
1 2 3 4
Rhizopus oryzae F-495 35,2 4,8 9,0
Rhizopus oryzae F-497 30,0 4,1 6,0
Rhizopus oryzae F-596 5,4 0,5 10,0
Rhizopus oryzae F-593 15,0 1,8 7,0
Rhizopus oryzae F-605 10,3 1,2 6,0
Rhizopus microsporus var. chinensis F-1361 30,2 4,5 3,0
Rhizopus microsporus var. chinensis F-1062 50,4 6,9 8,0
Rhizopus microsporus var. chinensis F-1218 45,0 5,4 4,0
Rhizopus microsporus var. chinensis F-595 25,2 1,4 3.0
Rhizopus microsporus var. chinensis F-610 107,0 4,6 5.0
Rhizopus oryzae F-1217 62,2 9,4 17.0
Rhisopus tritici t1 (Rh. oryzae t1) 100,0 8,4 20,0
Trichoderma harzianum BKM F-4099D 95,2 5,7 5,0
Trichoderma harzianum 18 ВИЗР 39,0 4,0 3,0
Trichoderma reesei 25,7 2,1 8,6
Rhizopus stolonifer 59,8 5,9 6,0
Rhizopus nigricans 62,9 3,7 5,0
Rhisopus pygmaeus p1 110,0 6,3 4,6
Биосинтез гликозидаз может быть репрессирован или индуцирован различными аминокислотами. Влияние аминокислот на биосинтез ферментов Rh. oryzae t1 исследовалось на среде Чапека, куда вносилась аминокислота в количестве 0,2% по азоту. На фоне этой среды активность пуллуланазы была максимальной при внесении в среду Глю, Асп, у-Ами, Лиз, Орн, Вал, Ала. При внесении в среду Тир, Нор активность фермента была в 6-9 раз ниже, чем в контроле.
Внесение Глю в среду в момент засева и в первые часы культивирования стимулирует синтез фермента, внесение ее после 24-36 часов культивирования (в период активного синтеза пуллуланазы) не дает эффекта. При отсутствии Глю в первые часы роста микроорганизма сдвигает максимум накопления фермента к 60 часам. Количество биомассы не зависит от времени внесения Глю. На фоне среды с компонентным составом,%: крахмал - 6,0, БВК - 1,0, KCl - 0,6, MgSO4 - 0,05, (NHO2 HPO4 - 0,7 в качестве источников аминного азота использовались различные аминокислоты (0,2% по азоту). Активный синтез наблюдался в среде с Про, Глю. Количество биомассы снижалось вдвое. Это указывает на отсутствие корреляции между ростом и биосинтетической активностью.
На среде с Тре и Асп, продуцент синтезирует пуллуланазы с низкой активностью, при этом активно развивается и накапливается максимум биомассы. На максимальную активность пуллу-ланазы оказывает влияние вносимая в среду доза аминокислоты, так, для Глю - 0,005-0,010%, Орн - 0,005%.
Анализируя изменения аминокислотного пула штамма в сравнении с этим показателем при росте на варианте среды без внесения аминокислот, можно отметить общую закономерность: повышение содержания в клетках Глю, Ами, Ала, Лиз, Сер, Тре, Цис. Кроме того, в их мицелии обнаруживаются гидрофобные аминокислоты: Вал, Изо, Лей, Три, Фен.
Влияние вносимых в питательную среду углеводов на биосинтез пуллуланазы распределяется в следующий убывающий ряд: крахмал
- декстрин - мальтоза - сахароза - маннит - ра-финоза - лактоза - рамноза - фруктоза - сорбит
- арабиноза - инозит - глюкоза - галактоза -дульцит. Следует отметить, что глюкоза репрессировала синтез пуллуланазы на 70%. Катаболитная репрессия пуллуланазы наблюдается на средах с арабинозой, инозитом, галактозой и дульцитом.
Одна из задач, которую следовало решить в рамках достижения поставленной цели, была разработка условий культивирования продуцента, наиболее приближенным к оптимальным.
Оптимизацию условий культивирования проводили в три этапа.
1. Были выбраны управляемые факторы, существенно влияющие на синтез пуллуланазы. Применительно к грибам в качестве таких факторов чаще всего используются: продолжительность выращивания, влажность и состав питательной среды, температура выращивания. В литературе отсутствуют количественные оценки влияния указанных факторов на биосинтез фермента при глубинном культивировании продуцета Я^орш tritici и (ЯЪ. о^ае и), поэтому было проведено последовательное
Перкин С.С и др. ЪестницЬТУУМ, 2021, Ж. 83, №. 3, С- 106-114
определение частных оптимумов по каждому значимому фактору, поочередно варьируя отдельный фактор на фоне постоянства остальных.
В эксперименте установлено, что максимальный биосинтез ферментов, в том числе пуллуланазы, наблюдался при выращивании в продуцента течение 96-120 часов при температуре (35 + 1) °С
В качестве основных факторов, влияющих на рост микромицета, были выбраны: концентрация крахмала,% (x1), концентрация азотнокислого калия,% (x2), концентрация кукурузного экстракта,% (Х3). Критериями оценки влияния различных факторов на процесс биосинтеза амилаз служили активности глюкоамилазы и пуллуланазы. Для исследования применяли полный факторный эксперимент с использованием центрального композиционного рототабельного униформпланирования.
В результате обработки данных получены уравнения регрессии, адекватно описывающие процесс биосинтеза амилаз:
= 120,6 +3,65x1+2,75x2 - 1,72x3 - 2,8x21 -
post@vestnik-vsuet. ru
У1
1,9х22 - 1,9х2з
У2 = 6,6 - 0,59X1 + 1,95X2 - 0,18хз - 0,41X1X2 -0,89х21 - 0,19х22 - 0,29х2з
Определение оптимальных составов питательной среды проводили методом "Ридж-анализ". При наложении оптимальных составов питательных сред при биосинтезе амилаз, рациональной средой является,%:
- крахмал - 6,0,
- азотнокислый калий - 0,8,
- кукурузный экстракт - 0,85.
При таких значениях параметров активность амилаз достигала максимальных величин.
Динамика роста микроорганизма и биосинтеза им ферментов представлена на рисунках 3-6.
т, час | т, hour
Рисунок 3. Влияние времени культивирования на биосинтез ферментов (1 - глюкоамилаза, 2 - а-амилаза, 3 - пуллуланаза)
Figure 3. Cultivation time effect on biosynthesis of enzymes (1 - glucoamylase, 2 - а-amylase, 3 - pullulanase)
6
с 5
3
fl Л
3 я 4 с01
0 /1 2 3
1-е ГЛ
2
io ^ 1
0
h—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I
24 48 72 96 120 144 168
0
т, час | т, hour
Рисунок 4. Динамика накопления биомассы в зависимости от времени культивирования Figure 4. Dynamics of biomass amplification in dependence to cultivation time
Из рисунка 4 видно, что при культивировании продуцента на оптимизированной питательной среде активность глюкоамилазы; альфа-амилазы и пуллуланазы увеличилась, соответственно, на (%): 18,0; 19,0 и 50,0.
Из рисунка 5 следует, что развитие микроорганизма характеризуется непродолжительной лаг-фазой (до 24 часов), затем наступает экспоненциальная фаза роста, в которой интенсивно потребляются питательные вещества среды и увеличивается биомасса продуцента. К 96 часам рост прекращается, максимально снижается содержание редуцирующих веществ в среде.
Активный синтез ферментов заканчивается к 96 - 120 часам культивирования.
Характер кривой роста соответствовал изменению активной кислотности (рН) культу-ральной жидкости (рисунок 5) и изменению количества редуцирующих веществ питательной среды в зависимости от времени культивирования (рисунок 6).
5,5
3
0 24 48 72 96 120 144 168
т, час | т, hour
Рисунок 5. Изменение рН культурной жидкости в зависимости от времени культивирования
Figure 5. рН culture liquid change in dependence to cultivation time
Perkin S.S. et aL Proceedings ofVSUET, 2021, vol. 83, no. 3, pp. Максимальный рост и накопление биомассы продуцентом наблюдается к 48 - 96 часам культивирования. Биосинтез целевых ферментов -к 96-120 часам. 10 9
"е 8
ГЛ
7
S wf 6
о J2
И S 5 4 3 2 1 0
m
СМ
.S3
I
р
72 96 120 т, час | т, hour
168
Рисунок 6. Изменение количества редуцирующих веществ питательной среды в зависимости от времени культивирования
Figure 6. Amount change of reducing agents in the medium in dependence to cultivation time
Заключение
1. На основании анализа научной и научно-технической литературы по разрабатываемой проблеме и результатам собственных исследований проведен скрининг микроорганизмов - продуцентов и выбран генетически компетентный штамм, способный к синтезу целевых ферментов - Rhisopus tritici t1 (Rh. oryzae t1) с нативной активностью синтезируемых ферментов,
106-114 [email protected]
(ФЕ/мл): глюкоамилазы, а-амилазы и пуллуланазы, соответственно, 100,0; 8,4 и 20,0.
2. Разработаны условия жидкофазного культивирования продуцента, обеспечивающие максимальный биосинтез целевых ферментов и получение комплексного ферментного препарата для переработки крахмалсодержащих отходов с фильтр-прессов при производстве хлебопекарных дрожжей:
- анализируя изменения аминокислотного пула при росте штамма, установлено влияние вносимых в питательную среду углеводов на биосинтез пуллуланазы. Отмечено, что к лучшим источникам углерода можно отнести крахмал, дектрин и мальтозу. Глюкоза репрессировала синтез пуллуланазы на 70%. Катаболитная репрессия пуллуланазы наблюдалась на средах с арабинозой, инозитом, галактозой и дульцитом;
- рациональным составом среды, обеспечивающим максимальные величины синтезируемых ферментов, является, %, крахмал - 6,0, азотнокислый калий - 0,8, кукурузный экстракт - 0,85. Активности ферментов - глюкоамилазы; альфа-амилазы и пуллуланазы - увеличились, соответственно, на (%): 18,0; 19,0 и 50,0;
- изучение динамики роста микромицета на разработанной среде, включая анализ изменения рН и содержания редуцирующих веществ в культуральной жидкости, показало, что максимальный рост и накопление биомассы продуцентом наблюдается к 48 - 96 часам культивирования, биосинтез целевых ферментов - к 96-120 часам.
Литература
L Гаврилова А.Ю. Исследование параметров культивирования сухих хлебопекарных дрожжей из отходов сахарного производства свекловичной мелассы // Актуальные вопросы современной науки. 2017. С. 138-143.
2 Римарева Л.В., Серба Е.М., Соколова Е.Н., Борщева Ю.А. и др. Ферментные препараты и биокаталитические процессы в пищевой промышленности // Вопросы питания. 2017. Т. 86. №. 5.
3 Банницына Т.Е., Канарский А.В., Щербаков А.В., Чеботарь В.К. и др. Дрожжи в современной биотехнологии // Вестник Международной академии холода. 2016. №. 1.
4 Хатко З.Н., Стойкина А.А. Хлебопекарные дрожжи: характеристика и способы их активации // Новые технологии. 2016. №. 2.
5 Панкина И.А., Черникова Д.А. Хлебопекарные дрожжи: характеристика и изучение их физико-химических показателей // Проблемы конкурентоспособности потребительских товаров и продуктов питания. 2019. С. 241-244.
6 Джахонгирова Г.З., Саидходжаева М.А., Махмудова Д.Х., Касимова М.А. Ресурсосберегающий способ производства хлебопекарных дрожжей на основе рисовой мучки // Universum: технические науки. 2018. №. 3 (48).
Ребезов М.Б., Карпова Г.В., Зайнутдинов Р.Р. Анализ технологических моделей производства дрожжей // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Пищевые и биотехнологии. 2014. Т. 2. №. 2.
8 Крикунова Л.Н., Дубинина Е.В. Исследовние белкового комплекса возвратных отходов хлебопекарного производства // Технология и товароведение инновационных пищевых продуктов. 2018. №. 6. С. 63-66.
Луговая Н.П., Требухин И.В. Утилизация отходов дрожжевого производства // Научно-технический прогресс в сельскохозяйственном производстве. 2014. С. 193-196.
Волкова А.В., Александрова Е.Г. Биоконверсия биотинсодержащего растительного сырья в технологии производства дрожжей // Современные технологии: актуальные вопросы, достижения и инновации. 2020. С. 38-41.
11 Benabda О., Kasmi М., Kachouri F., Hamdi М. Valorization of the powdered bread waste hydrolysate as growth medium for baker yeast // Food and Bioproducts Processing. 2018. V. 109. P. 1-8. doi: 10.1016/j.fbp.2018.02.007
nepn&u C.C. u dp. Becmuu^BTyMM, 2021, T 83, №. 3, C. 106-114
post@vestnik-vsuet ru
12 Kefale A., Redi M., Asfaw A. Potential of bioethanol production and optimization test from agricultural waste: the case of wet coffee processing waste (pulp) // Int J Renew Energy Res. 2012. V. 2. №. 3. P. 446-450.
13 Haque M.A., Kachrimanidou V., Koutinas A., Lin C.S.K. Valorization of bakery waste for biocolorant and enzyme production by Monascus purpureus // Journal of biotechnology. 2016. V. 231. P. 55-64. doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.05.003
14 Pleissner D., Lau K.Y., Schneider R., Venus J. et al. Fatty acid feedstock preparation and lactic acid production as integrated processes in mixed restaurant food and bakery wastes treatment // Food Research International. 2015. V. 73. P. 52-61. doi: 10.1016/j.foodres.2014.11.048
1 i Oprea O.B., Gaceu L. Application of multiple criteria decision making (mcdm) in bakery industry. Study case: wastes and by-products // Bulletin of the Transilvania University of Brasov. Forestry, Wood Industry, Agricultural Food Engineering. Series II. 2016. V. 9. №. l.P. 89.
16 Akmirza I., Turker M., Alp K. Characterization and treatment of yeast production process emissions in a biofilter // Feb-fresenius environmental bulletin. 2018. P. 7099.
17 Turker M. Yeast biotechnology: Diversity and applications // Proceedings of 27th VH Yeast Conference. 2014. P. 1-26.
18 El-Zaher F.H.A., El-Din M.S., Fadel M. Perspectives for appropriating distilled yeast to be reused in bakery // International Journal of Academic Research. 2012. V. 4. №. 4. P. 11-16.
19 Rosan C.A., Bei M.F. Evaluation of the fermentative potential of some bakery yeasts // Analele Universitatii din Oradea, Fascicula: Ecotoxicologie, Zootehnie si Tehnologii de Industrie Alimentara. 2018. V. 17. №. A. P. 65-68.
20 Pleissner D., Lam W.C., Han W., Lau K.Y. et al. Fermentative polyhydroxybutyrate production from a novel feedstock derived from bakery waste // BioMed research international. 2014. doi: 10.1155/2014/819474
References
1 Gavrilova A.Yu. Investigation of the parameters of cultivation of dry baker's yeast from wastes of sugar production of beet molasses. Actual problems of modern science. 2017. pp. 138-143. (in Russian).
2 Rimareva L.V., Serba E.M., Sokolova E.N., Borshcheva Yu.A. et al. Enzyme preparations and biocatalytic processes in the food industry. Questions of nutrition. 2017. vol. 86. no. 5. (in Russian).
3 Bannitsyna T.E., Kanarskiy A.V., Shcherbakov A.V., Chebotar V.K. et al. Yeast in modern biotechnology. Bulletin of the International Academy of Cold. 2016. no. 1. (in Russian).
4 Hatko Z.N., Stoykina A.A. Bakery yeast: characteristics and methods of their activation. New technologies. 2016. no. 2. (in Russian).
5 Pankina I.A., Chernikova D.A. Bakery yeast: characteristics and study of their physical and chemical indicators. Problems of the competitiveness of consumer goods and food products. 2019. pp. 241-244. (in Russian).
6 Jakhongirova G.Z., Saidkhodzhaeva M.A., Makhmudova D.Kh., Kasimova M.A. Resource-saving method for the production of baker's yeast based on rice flour. Universum: technical sciences. 2018. no. 3 (48). (in Russian).
7 Rebezov M.B., Karpova G.V., Zainutdinov R.R. Analysis of technological models of yeast production. Bulletin of the South Ural State University. Series: Food and Biotechnology. 2014. vol. 2. no. 2. (in Russian).
8 Krikunova L.N., Dubinina E.V. Research of the protein complex of returnable wastes of bakery production. Technology and commodity science of innovative food products. 2018. no. 6. pp. 63-66. (in Russian).
9 Lugovaya N.P., Trebukhin I.V. Utilization of yeast production waste. Scientific and technical progress in agricultural production. 2014. pp. 193-196. (in Russian).
10 Volkova A.V., Alexandrova E.G. Bioconversion of biotin-containing plant raw materials in yeast production technology. Modern technologies: topical issues, achievements and innovations. 2020. pp. 38-41. (in Russian).
11 Benabda O., Kasmi M., Kachouri F., Hamdi M. Valorization of the powdered bread waste hydrolysate as growth medium for baker yeast. Food and Bioproducts Processing. 2018. vol. 109. pp. 1-8. doi: 10.1016/j.fbp.2018.02.007
12 Kefale A., Redi M., Asfaw A. Potential of bioethanol production and optimization test from agricultural waste: the case of wet coffee processing waste (pulp). Int J Renew Energy Res. 2012. vol. 2. no. 3. pp. 446-450.
13 Haque M.A., Kachrimanidou V., Koutinas A., Lin C.S.K. Valorization of bakery waste for biocolorant and enzyme production by Monascus purpureus. Journal of biotechnology. 2016. vol. 231. pp. 55-64. doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.05.003
14 Pleissner D., Lau K.Y., Schneider R., Venus J. et al. Fatty acid feedstock preparation and lactic acid production as integrated processes in mixed restaurant food and bakery wastes treatment. Food Research International. 2015. vol. 73. pp. 52-61. doi: 10.1016/j.foodres.2014.11.048
15 Oprea O.B., Gaceu L. Application of multiple criteria decision making (mcdm) in bakery industry. Study case: wastes and by-products. Bulletin of the Transilvania University of Brasov. Forestry, Wood Industry, Agricultural Food Engineering. Series II. 2016. vol. 9. no. 1. pp. 89.
16 Akmirza I., Turker M., Alp K. Characterization and treatment of yeast production process emissions in a biofilter. Feb-fresenius environmental bulletin. 2018. pp. 7099.
17 Turker M. Yeast biotechnology: Diversity and applications. Proceedings of 27th VH Yeast Conference. 2014. pp. 1-26.
18 El-Zaher F.H.A., El-Din M.S., Fadel M. Perspectives for appropriating distilled yeast to be reused in bakery. International Journal of Academic Research. 2012. vol. 4. no. 4. pp. 11-16.
19 Rosan C.A., Bei M.F. Evaluation of the fermentative potential of some bakery yeasts. Analele Universitatii din Oradea, Fascicula: Ecotoxicologie, Zootehnie si Tehnologii de Industrie Alimentara. 2018. vol. 17. no. A. pp. 65-68.
20 Pleissner D., Lam W.C., Han W., Lau K.Y. et al. Fermentative polyhydroxybutyrate production from a novel feedstock derived from bakery waste. BioMed research international. 2014. doi: 10.1155/2014/819474
PerÇjn S.S. et aL Proceedings ofVSUET, 2021, vol. 83, no. 3, pp. 106-114
post®vestnik-vsuet. ru
Сведения об авторах Сергей С. Перкин аспирант, кафедра биохимии и биотехнологии, Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия, 8.8.регкт(й)уа.ги
https://orcid.org/0000-0002-3505-2383 Галина П. Шуваева к.б.н., доцент, кафедра биохимии и биотехнологии, Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия, §рзЬиу(й!тш1.ш
https://orcid.org/0000-0002-4294-8209 Екатерина М. Мотина к.т.н., доцент, кафедра биохимии и биотехнологии, Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия, ето1та18(й!таП.га
https://orcid.org/0000-0002-3433-2754 Дмитрий А. Черенков д.б.н., профессор, кафедра биохимии и биотехнологии, Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия, ¿сЬегепкоу(й>тш1.ги
https://orcid.org/0000-0002-8564-8919 Светлана Ф. Яковлева к.т.н., доцент, кафедра биохимии и биотехнологии, Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия, 8УеИапа.уакоу1еуа.68(й)пш1.ги
https://orcid.org/0000-0003-3686-9966 Ольга С Корнеева д.б.н., профессор, кафедра биохимии и биотехнологии, Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия, когпееуа-о^авйуа.ги https://orcid.org/0000-0002-2863-0771
Вклад авторов
Все авторы в равной степени принимали участие в написании рукописи и несут ответственность за плагиат
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Information about authors Sergey S. Perkin graduate student, biochemistry and biotechnology department, Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19 Voronezh,
394036, Russia, s.s.perkin(S)ya.ru
https://orcid.org/0000-0002-3505-2383 Galina P. Shuvaeva Cand. Sci. (Bio.), associate professor, biochemistry and biotechnology department, Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19 Voronezh, 394036, Russia, gpshuv(S)mail.ru
https://orcid.org/0000-0002-4294-8209 Ekaterina M. Motina Cand. Sci. (Engin..), associate professor, Biochemistry and Biotechnology Department, Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19 Voronezh, 394036, Russia, emotinal8(S)mail.ru
https://orcid.org/0000-0002-3433-2754 Dmitry A. Cherenkov Dr. Sci. (Bio.), professor, biochemistry and biotechnology department, Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19 Voronezh, 394036, Russia, d.cherenkov(S!mail.ru
https://orcid.org/0000-0002-8564-8919 Svetlana F. Yakovleva Cand. Sci. (Engin.), associate professor, biochemistry and biotechnology department, Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19 Voronezh, 394036, Russia, svetlana.yakovleva.68(S)mail.ru
https://orcid.org/0000-0003-3686-9966 Olga S. Korneeva Dr. Sci. (Bio.), professor, biochemistry and biotechnology department, Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19, Voronezh, 394036, Russia, komeeva-olgas(S)ya.ru https://orcid.org/0000-0002-2863-0771
Contribution
All authors are equally involved in the writing of the manuscript and are responsible for plagiarism
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Поступила 20/07/2021_После редакции 09/08/2021_Принята в печать 30/08/2021
Received 20/07/2021_Accepted in revised 09/08/2021_Accepted 30/08/2021
