CC BY
72
Bernnux&TyWT/Proceedmgs of VSUET, № 4, 2016,
Оригинальная статья/Original article_
УДК 664.2:557.15
DOI: http://doi.org/10.20914/2310-1202-2016-4-238-244
Влияние композиций амилолитических ферментов на процесс низкотемпературной биоконверсии нативного крахмала
Николай Д. Лукин 1 vniik@arrisp.ru Александр А. Папахин 1 Зинаида М. Бородина 1 Валентина А. Гулакова
1 ВНИИ крахмалопродуктов, ул. Некрасова, 11, п. Красково, Московская обл. 140051, Россия
Реферат. Целью данной работы было исследование действия глюкоамилазы в процессе биоконверсии нативного крахмала в композиции с амилолитическими ферментами, оказывающими положительное влияние при биоконверсии предварительно клейстеризованного крахмала. Установлено, что при использовании в качестве катализатора процесса композиции глюкоамилазы с термостабильной бактериальной а-амилазой, в отличие от клейстеризованного крахмала, не наблюдается положительного эффекта. Выявлено позитивное влияние на процесс композиции глюкоамилазы (Asp. niger) с пуллуланазой (Bac. licheniformis) при дозировке последней 0,4-0,5 ед. ASPU/г СВ крахмала. В ходе исследований установлено, что оптимальная величина рН реакционной среды для композиции ферментов так же, как и для глюкоамилазы при действии на нативный крахмал, находится в пределах 3,0-3,5, в отличие от 4,0-4,5 для клейстеризованного крахмала. Результаты исследований показали, что снижение оптимума рН для действия глюкоамилазы в процессе биоконверсии натив-ного крахмала до 3,3-3,5 может быть обусловлено синергетическим действием НС1 и глюкоамилазы. Пуллуланаза (Bac. licheniformis) при самостоятельном действии на нативный крахмал сохраняет оптимум рН (4,2) для клейстеризованного крахмала, при снижении рН частично инактивируется. При дозировке 10 ед. ASPU/г СВ крахмала в заданных условиях пуллуланаза расщепляет не более 1% СВ крахмала с образованием глюкозы (~ 45%), мальтозы (~ 13%), мальтотриозы (~ 12%) и ВМС (~ 30%), что свидетельствует о способности испытуемой пуллуланазы, помимо а-1,6-гликозидных связей, расщеплять в крахмале и а-1,4 связи. На основании полученных данных установлено, что использование композиции глюкоамилазы с а-амилазой и/или пуллуланазой для низкотемпературной биоконверсии нативного крахмала неэффективно, в отличие от клейстеризованного крахмала.
Ключевые слова: низкотемпературная биоконверсия, нативный крахмал, синергетическое действие, композиция амилолитических
Influence of amylolytic enzymes compositions on the process of low _temperature bioconversion of native starch_
Nikolai D. Lukin 1 vniik@arrisp.ru Aleksandr A. Papakhin 1 Zinaida M. Borodina 1
_Valentina A. Gulakova 1_
1 All-Russian Research Institute for Starch Products, Nekrasov str., 11, Kraskovo, Moscow region, 140051, Russia
Summary. The aim of this work was to study the action of glucoamylase in the process of bioconversion of native starch in combination with amilolytic enzymes, that have a positive effect on the bioconversion of the pre-gelatinized starch. It was found that the use a composition of thermostable bacterial glucoamylase with а-amylase as catalyst, in contrast to the gelatinized starch, a positive effect is not observed. It was revealed a positive impact of composition the glucoamylase (Asp. niger) and pullulanase (Bac. licheniformis) with the dose of 0.4-0.5 units of ASPU/g DS of starch on the process. The studies revealed that the optimum рН of the reaction medium for the enzyme composition as well as of for glucoamylase at the action on native starch is in the range of 3.0-3.5, in contrast to the 4.0 to 4.5 for gelatinized starch. The results showed that the optimum рН decrease for the action of glucoamylase in the process of bioconversion of native starch to 3.3 and 3.5 may be due to the synergistic action of glucoamylase and НО. Pullulanase (Bac. licheniformis) retains the optimum рН (4,2) for gelatinized starch at independent action on native starch is partially inactivated while lowering рН. At a dose of 10 ASPU/g DS of starch under specified conditions pullulanase cleaves not more than 1% DS of starch at forming glucose (~ 45%), maltose (~ 13%), maltotriose (~ 12%) and HMS (~ 30%). That indicates to the ability of the test pullulanase in addition to the а-1,6-g1ycosidic linkages to break down starch and а-1,4 links. On the basis of the obtained data it is revealed that the use of the glucoamylase composition with а-amylase and/or pullulanase for low-temperature bioconversion of native starch, unlike gelatinized is ineffective. Keywords: low temperature bioconversion, native starch, synergistic effect, composition of amylolytic enzymes, glucoamylase
Введение
В настоящее время глубокая переработка крахмалсодержащего сырья и крахмала с получением продуктов высокого качества в широком ассортименте, конкурентоспособных и удовлетворяющих потребностям современного рынка, является одной из важнейших задач развития крахмалопаточной промышленности России.
Для цитирования Лукин Н. Д., Папахин А. А., Бородина З. М., Гулакова В. А. Влияние композиций амилолитических ферментов на процесс низкотемпературной биоконверсии нативного крахмала // Вестник ВГУИТ. 2016. № 4. С. 238-244. ёо1:10.20914/2310-1202-2016-4-238-244
238
Одним из актуальных направлений, ориентированных на разработку технологий переработки крахмала, способствующих расширению ассортимента крахмалопродуктов, востребованных в РФ, и их импортозамещению, является разработка новых эффективных методов модификации свойств нативного крахмала амилолитическими ферментами в процессе низкотемпературной биоконверсии в условиях, близких к промышленным.
For citation
Lukin N. D., Papakhin A. A., Borodina Z. M., Gulakova V. A. Influence of amylolytic enzymes compositions on the low temperature bioconversion process of native starch. Vestnik VSUET [Proceedings of VSUET]. 2016. no. 4. pp. 238-244. (in Russian). doi:10.20914/2310-1202-2016-4-238-244
QemwxßTyMT/Proatedmgs of VSUET, № 4, 2Q16
Во ВНИИ крахмалопродуктов проведены исследования действия амилолитических ферментов на нативный крахмал в гетерогенной водной среде при температуре ниже начальной точки его клейстеризации и концентрациях сухих веществ крахмала в субстрате, близких к промышленным [1, 2]. Установлено, что при действии глюкоамилазы на нативный крахмал наибольшую атакуемость проявляют зерновые крахмалы, в частности кукурузный крахмал, наименьшую - картофельный. При этом в реакционной среде образуются следующие продукты: глюкозный сироп высокой доброкачественности с глюкозным эквивалентом ГЭ 98,5-99,0% и оставшийся негидролизованным крахмал с поврежденными гранулами, физико-химические и структурные свойства которого довольно существенно отличаются от нативного крахмала и позволяют считать его фермента-тивно модифицированным пористым крахмалом.
Поскольку активность глюкоамилазы в процессе биоконверсии крахмала зависит от свойств субстрата, скорость реакции может быть повышена за счет предварительного механического воздействия на нативный крахмал [3, 4]. Процесс биоконверсии крахмала также можно интенсифицировать путем создания композиций основного фермента-катализатора с сопутствующими амилазами, обладающих синергетическим эффектом при совместном действии [5-7].
Цель работы - исследование действия глюкоамилазы в композиции с другими амило-литическими ферментами в процессе низкотемпературной биоконверсии нативного крахмала в гетерогенной среде.
Объекты и методы исследований
Объектами исследований являлись: испытуемые ферментные препараты, исходный нативный крахмал и продукт его гидролиза -жидкая фракция (первичный фильтрат + промои). Катализаторами процесса биоконверсии в составе композиций были выбраны коммерческие препараты амилолитических ферментов: очищенной глюкоамилазы Optidex L-400 (продуцент - Asp. niger), пуллуланазы Optimax L-1000 (продуцент - Bac. licheniformis), комплексный препарат глюкоамилазы и пуллу-ланзы Optimax 7525 HP и препарат термостабильной а-амилазы Spezyme XTRA (продуцент -Bac. licheniformis), предоставленные компанией Du Pont (США), как обладающие близкими оптимальными условиями действия на крахмал в процессе биоконверсии. Амилолитические активности испытуемых ферментных препаратов определяли методами, изложенными
в ГОСТ 54330-2011, пуллуланазную активность устанавливали по данным фирмы производителя. Количество и углеводный состав растворимых сухих веществ (СВ) крахмала определяли жидкостной хроматографией на анализаторе углеводов с рефрактометрическим датчиком фирмы Bischoff, модель 8120 и рефрактометре ИРФ-454Б2М. Результаты процесса биоконверсии оценивали путем определения степени растворения (СРК) и степени гидролиза крахмала (СГК) по разработанной во ВНИИ крахмалопродуктов методике [8].
Экспериментальные исследования проводились по ранее разработанной схеме, включающей следующие стадии:
— приготовление водной суспензии крахмала с концентрацией СВ = 32%, доведение рН до требуемого значения, установка колб на платформу термошейкера-инкубатора IKA KS 4000i (Германия);
— нагрев суспензии до 52 °С, внесение необходимых доз испытуемых ферментов, инкубирование приготовленной реакционной смеси при Т = 52 °С и постоянном перемешивании при 140 об/мин в течение 0-72 ч с периодическим отбором проб;
— разделение проб реакционной смеси путем вакуум-фильтрования на жидкую фракцию -фильтрат и твердую - осадок с последующей промывкой осадка дистиллированной водой при гидромодуле 1:4;
— смешивание фильтрата с промывными водами осадка;
— высушивание осадка при температуре 25-50 °С до воздушно сухого состояния.
Во всех опытах в процессе биоконверсии количественно определяли распределение сухих веществ исходного крахмала на указанные фракции.
Результаты процесса биоконверсии оценивали путем определения степени растворения (СРК) и степени гидролиза крахмала (СГК) согласно методике, разработанной в ВНИИК [7], по формулам:
СРК = WPcBl (Wnp х СВрс) (1)
где: Wpcb - масса СВ в водорастворимой фракции пробы, г; W^ - масса пробы, взятая на разделение, г; СВрс - массовая доля СВ в реакционной смеси опыта, %.
СГК= (СРКх ГЭ)/ 100 (2)
где: СРК - степень растворения крахмала, %; ГЭ - массовая доля редуцирующих веществ в пересчете на глюкозу в водорастворимой фракции, % - глюкозный эквивалент
в настоящей работе согласно ГОСТ Р 52060-2003 «Патока крахмальная. Приложение Д» рассчитывали по данным углеводного состава, определенного методом ВЭЖХ, по формуле:
ГЭ= твк= 1,000т,. + 0,580 т„„„ +
V3/
+ 0,395 m мтр +
0,180 т..
где: Шгл, Шмал, Шмтр, Швс - массовая доля Сахаров: глюкозы, мальтозы, мальтотриозы, высших Сахаров в пересчете на сухое вещество, %; 1,000; 0,580; 0,395; 0,180 - усредненное значение коэффициентов для пересчета массовой доли сахаров на глюкозу.
Количество и углеводный состав растворимых сухих веществ (СВ) крахмала определяли методом ВЭЖХ на анализаторе углеводов с рефрактометрическим датчиком фирмы Bischoff, модель 8120, и рефрактометре марки ATR фирмы Schmidt (Германия).
Для определения показателей величины рН, сухого вещества и др. использовали методы техно-химического контроля производства крахмала и крахмалопродуктов.
Все результаты представлены как среднее не менее трех повторностей экспериментов с обеспечением доверительной вероятности не менее 95%.
Обсуждение результатов исследований
Первый этап исследований посвящен изучению влияния величины рН реакционной среды на действие глюкоамилазы Optidex L-400 (продуцент - Asp. niger) в процессе биоконверсии при оптимальных параметрах температуры (52 °С) и концентрации суспензии нативного кукурузного крахмала (32%). Опыты проводили по разработанной схеме [2], для доведения рН суспензии крахмала использовали два варианта:
Таблица 1
Результаты действия очищенной глюкоамилазы на нативный крахмал в присутствии бактериальной
альфа-амилазы
Table 1
The effect of the purified glucoamylase on native starch in the presence of bacterial alpha-amylase
1 - доведение рН суспензии в пределах 3,0-5,5 осуществляли 16%-ным раствором HCl, 2 - использовали растворы ацетатных буферов с рН 3,0-5,5.
Результаты показали, что оптимальным значением рН для действия очищенной глюкоамилазы на нативный крахмал и в том, и в другом случае является величина рН 3,0-3,5, однако более эффективная динамика процесса наблюдается при доведении рН раствором НС1, обладающей каталитическими свойствами. Очевидно, что при одновременном действии глюкоамилазы и НС1 в процессе биоконверсии повышение степени гидролиза объясняется синергетическим действием двух катализаторов до определенного рН субстрата (3,0-3,5). Дальнейшее снижение рН вызывает снижение активности глюкоамилазы
Далее исследовали действие глюкоамилазы на нативный крахмал в композиции с бактериальной альфа-амилазой Spezyme XTRA (продуцент -Bac. licheniformis). Условия опытов: концентрация СВ в суспензии крахмала 32%, температура 52 °С, продолжительность биоконверсии 24 ч, величина рН субстрата 4,2 - оптимум для глюкоамилазы Optidex L-400 при действии на клейстеризованный крахмал и 3,3 - оптимум рН при биоконверсии нативного крахмала. Полученные результаты, представленные в таблице 1, показали, что при действии глюко-амилазы на нативный кукурузный крахмал в композиции с бактериальной альфа-амилазой наблюдается незначительное снижение степени растворения и гидролиза крахмала при увеличении дозировки альфа-амилазы по сравнению с контрольным опытом как при рН субстрата 4,2, так и при рН 3,3, что может быть следствием взаимного конкурентного ингибирования испытуемых ферментов.
№ рН субстрата Substrate рН Дозировка ферментов, ед./г CB Dosage of enzymes, DS unit/g CB фильтрата Filtrate DS CPK, % DSS ГЭ, % DE CTK, % DHS
^C GlS AC AS
1 2 3 4,2 4,2 4,2 12 12 12 0,3 0,б 0,9 13,5 13,2 13,1 34,1 33,9 33,7 99,4 99,3 99,3 33,9 33,7 33,5
4 3,3 12 0,3 15,3 41,0 99,3 40,7
5 3,3 12 0,б 15,0 39,5 99,3 39,2
б 3,3 12 0,9 15,0 39,4 99,3 39,1
7 3,3 12 - 1б,0 42,2 99,3 41,9
Следующая серия опытов проведена с целью изучения действия глюкоамилазы в композиции с пуллуланазой в оптимальных условиях (С = 32%, Т = 52 °С) и величине рН субстрата 4,2 и 3,3 ед. в течение 24 ч. В опытах использовали препараты глюкоамилазы Optidex L-400 и пуллуланазы Optimax L1000 компании Du Pont (США). Дозировка
глюкоамилазы составляла 12 ед. ГлС/г СВ, активность пуллуланазы варьировали в пределах 0,4-1,2 ед. Л8Ри/г СВ. Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о влиянии дозировки пуллуланазы на совместное действие ее с глюкоамилазой на нативный крахмал в процессе низкотемпературной биоконверсии.
Таблица 2
Влияние дозы пуллуланазы (Bac. licheniformis) на процесс биоконверсии нативного крахмала
в присутствии очищенной глюкоамилазы
Table 2
The influence of pullulanase (Bac. licheniformis) dose on the byconversion process of native starch
in the presence of purified glucoamylase
Дозировка ферментов Dosage of enzymes
№ п/п Глюкоамилаза, ед. ГлС/г Пуллуланаза, ед. ASPU/г СВ фильт- СРК, ГЭ, СГК,
СВ крахмала Glucoamylase, unit GlS/g of starch DS СВ крахмала Pullulanaza, unit of ASPU/g of starch DS рата,% Filtrate DS,% % DSS % DE % DHS
рН субстрата - 4,2 | Substrate рН - 4,2
1 12 0,4 13,9 35,6 99,2 35,3
2 12 0,8 13,6 34,0 99,2 33,7
3 12 1,2 13,0 32,3 99,2 32,0
4 12 - 13,9 33,7 99,3 33,5
рН субстрата - 3,3 Substrate рН - 3,3
5 12 0,4 16,8 41,7 99,2 41,4
6 12 0,8 16,4 40,8 99,2 40,5
7 12 1,2 15,6 38,9 99,2 38,6
8 12 - 16,0 38,5 99,2 38,2
При дозировке пуллуланазы 0,4 ед. Л8Ри/г СВ крахмала степень гидролиза превышает СГК контрольного опыта (без пуллуланазы) на 3,2%, что можно объяснить синергетическим действием композиции амилаз на нативный крахмал также, как на клейстеризованный [6, 7]. Однако увеличение дозировки пуллуланазы при заданных условиях приводит к снижению степени гидролиза. Исследования также показали, что для испытуемой композиции ферментов, так же как и для глюкоамилазы, оптимум рН находится в пределах 3,3-3,5.
Анализ данных по концентрации и углеводному составу растворимых СВ, полученных при биоконверсии крахмала в присутствии композиции глюкоамилазы с пуллуланазой в сравнении с таковыми, полученными ранее, при использовании одной глюкоамилазы в аналогичных условиях, показал, что эти показатели имеют практически равноценную зависимость от рН субстрата: содержание СВ фильтрата равномерно увеличивается в пределах
рН 4,5^3,3 и снижается при рН 3,0, вероятно, вследствие частичной инактивации глюкоами-лазы. На основании анализа сделан вывод о необходимости изучения действия пуллула-назы и используемой для доведения рН субстрата НС1 на нативный крахмал в процессе его низкотемпературной биоконверсии в заданных условиях.
Влияние НС1 на процесс биоконверсии нативного кукурузного крахмала при концентрации СВ в суспензии 32% и температуре инкубации 52 °С в течение 24 ч оценивали путем определения степени растворения крахмала (СРК), углеводного состава растворенных СВ и соответственно степени гидролиза (СГК), при варьировании рН исходной суспензии (рН - 6,4) в пределах 4,5-3,0 с интервалом 0,3 ед.
Результаты опытов, приведенные в таблице 3, показали, что снижение величины рН суспензии путем добавления раствора НС1 до 3,6 и ниже вызывает некоторое повышение растворимости крахмала.
Таблица 3
Влияние рН суспензии на степень растворения и гидролиза кукурузного крахмала (инкубирование при 52 °С в течение 24 ч)
Table 3
The influence of the suspension рН on the degree of solubility and hydrolysis of corn starch
(incubation at 52 °C for 24 h)
№ оп СВ крахмала, г DS of starch, g рН суспензии suspensions рН Раство-ри-мые СВ, г Soluble DS, g СРК, % DSS ГЭ, % DE СГК, % DHS Углеводный состав РСВ, % Carbohydrate composition SDS,%
Глюкоза glucose ВМС HMS
1 23,76 6,4 0,04 0,15 0,00 0,00 0,0 0,0
2 48,11 4,5 0,08 0,17 0,18 0,03 0,0 100,0
3 48,13 4,2 0,08 0,17 0,18 0,03 0,0 100,0
4 48,13 3,9 0,08 0,17 0,18 0,03 0,0 100,0
5 48,17 3,6 0,09 0,18 0,18 0,03 0,0 100,0
6 48,20 3,3 0,09 0,20 0,23 0,05 5,26 94,74
7 48,00 3,0 0,13 0,27 0,26 0,07 6,82 93,18
Анализ углеводного состава растворимых СВ (РСВ) показал, что в раствор переходят высокомолекулярные сахариды и только при рН 3,3 появляются следовые количества глюкозы, что указывает на частичное расщепление гранул.
Оптимальные условия действия испытуемой пуллуланазы (препарат Optimax L 1000, продуцент - Bac. licheniformis) на клейстеризованный крахмал по данным производителя находятся на уровне рН 4,0-4,5, также как и глюкоами-лазы Optidex L-400. Поскольку установлено, что оптимум действия испытуемой глюкоами-лазы на нативный крахмал находится в пределах рН 3,0-3,5, опыты по изучению действия пуллуланазы на нативный крахмал в процессе низкотемпературной биоконверсии проводили при варьировании рН 32% -ной суспензии в пре-
делах 4,5^3,3 с интервалом 0,3 ед. при температуре 52 °С и продолжительности инкубации 24 ч. Дозировка пуллуланазы составляла 10 ед. ASPU/г СВ крахмала. Действие пуллуланазы также оценивали по степени растворения крахмала, углеводному составу растворенных СВ и степени гидролиза.
Результаты проведенных опытов (таблица 4) показали, что в данных условиях процесса биоконверсии нативного кукурузного крахмала действие пуллуланазы при столь высокой дозировке (10 ед. ASPU/г СВ крахмала) вызывает растворение не более 1,0% СВ при оптимальном для фермента рН среды (4,2) при действии на клейстеризованный крахмал. При снижении рН степень растворения снижается очевидно в связи с частичной инактивацией фермента.
Таблица 4
Влияние рН суспензии на степень растворимости и гидролиза кукурузного крахмала
при действии пуллуланазы
Table 4
The influence of the suspension рН on the degree of solubility and hydrolysis of corn starch
under the action of pullulanase
№ оп. СВ крахмала, г DS of starch, g рН суспензии suspension рН Растворимые СВ, г Soluble DS, g СРК,% DSS,% Углеводный состав РСВ,% Carbohydrate composition RSV,% ГЭ,% DE,% СГК,% DHS,%
Г G М M МТ MT ВМС HMS
1 48,0 4,5 0,43 0,92 44,80 13,50 12,00 29,70 62,43 0,57
2 48,0 4,2 0,45 0,94 44,81 13,60 11,87 29,72 62,76 0,59
3 48,0 3,9 0,43 0,90 44,83 13,25 12,40 29,52 62,68 0,56
4 48,0 3,6 0,38 0,80 45,28 13,40 12,02 29,30 63,16 0,50
5 46,5 3,3 0,34 0,74 45,30 12,40 12,00 29,30 62,50 0,46
Результаты анализа углеводного состава растворенных СВ крахмала позволяют предположить, что испытуемая пуллуланаза (Bac. Licheniformis) наряду с а-1,6 - Д-гликозидными связями гидролизует и а-1,4 - Д-связи, на что указывает образование значительных количеств глюкозы (таблица 4) и относится к амилопуллуланазам-пуллуланазам II типа, гидролизующим наряду с а-1,6 - связями в пуллулане и разветвленных субстратах, а-1,4 - связи в полисахаридах, отличных от пуллулана (крахмал, амилопектин) [9-11].
Полученные данные и анализ большого числа публикаций работ отечественных и зарубежных исследователей посвященных проблеме получения, изучения свойств и применения пуллуланазы, свидетельствуют о важности проведения дальнейших исследований в направлении использования пуллуланазы в крахмалопаточной промышленности.
Заключение
Установлено, что при использовании в качестве катализатора процесса низкотемпературной биоконверсии нативного кукурузного крахмала композиции глюкоамилазы с термостабильной бактериальной альфа-амилазой, в отличие от клейстеризованного крахмала, не наблюдается позитивного эффекта. Данный факт обусловлен как несовместимостью оптимальных условий действия указанных ферментов, так и структурными свойствами нативного крахмала.
Проведенные исследования показали позитивное влияние на процесс биоконверсии нативного крахмала, аналогично действию на клейстеризованный крахмал, композиции
ЛИТЕРАТУРА
1 Лукин Н.Д., Бородина З.М., Лапидус Т.В., Маннова И.Г. и др. Исследование процесса биоконверсии нативного кукурузного крахмала с применением амилолитических ферментов // Достижения науки и техники АПК. 2011. №12. С. 74-76.
2 Лукин Н.Д., Бородина З.М., Папахин А.А., Шаталова О.В Исследование действия амилолитических ферментов на нативный крахмал различных видов в гетерогенной среде // Достижения науки и техники АПК. 2013. №10. С. 62-64.
3 Tamaki S., Hisamatsu М„ Teranishi К., Adaclii Т. et al. Structural change of maize starch granules by ball-mill treatment // Starch/Staike. 1998. V. 50. № 8. P. 342-348.
4 Шульман М.С. Механическая клейстериза-ция крахмала. М.: Пищепромиздат, 1961. 149 с.
5 Uthumporn U., Zaidul I.S.M., Karim А.А. Hydrolysis of granular starch at subgelatinization temperature using a mixture of amylolytic enzymes // Food and Bioproducts Processing. 2010. V. 88. P. 47-54.
глюкоамилазы (Asp. Niger) с пуллуланазой (Bac. Licheniformis) при дозировке последней 0,4 ед. ASPU/г СВ крахмала.
Выявлено, что оптимальная величина pH реакционной среды для композиции ферментов так же, как и для глюкоамилазы при действии на нативный крахмал, находится в пределах 3,0-3,5, в отличие от 4,0-4,5 для клейстеризованного крахмала. Снижение оптимума рН для действия глюкоамилазы в процессе биоконверсии нативного крахмала может быть обусловлено синергетическим действием HCl и глюкоамилазы.
Пуллуланаза (Bac. Licheniformis) при самостоятельном действии на нативный крахмал сохраняет оптимум рн (4,2) для клейстеризо-ванного крахмала, при снижении рн частично инактивируется. При дозировке 10 ед. ASPU/г СВ крахмала в заданных условиях пуллуланаза расщепляет не более 1% СВ крахмала с образованием глюкозы (~ 45%), мальтозы (~ 13%), мальтот-риозы (~ 12%) и ВМС (~ 30%) независимо от величины рН и продолжительности процесса, что свидетельствует о способности испытуемой пуллуланазы помимо а-1,6 - гликозидных связей расщеплять в крахмале и а-1,4 связи.
На основании полученных данных установлено, что использование композиции глюкоамилазы с а-амилазой и/или пуллуланазой для низкотемпературной биоконверсии натив-ного крахмала, в отличие от клейстеризованного, неэффективно. Невосприимчивость нативного крахмала к действию испытуемых амилаз в условиях процесса очевидно обусловлена как структурными свойствами гранул крахмала, так и свойствами фермента в заданных условиях процесса.
6 Arasaratnam V., Balasubramaniam K. Synergistic action of а-amylase and glucoamylase on raw corn // Starch/Starke. 1993. V. 45. № 6. P. 231-233.
7 Fujii M. Homma Т., Taniguchi M. Synergism a-amylase and glucoamylase on hydrolysis of native starch granules //Biotechnol. Bioeng. 1988. V. 32. № 7. P. 910-915.
8 Папахин A.A., Бородина 3.M., Лукин Н.Д., Гулакова В.А. и др. Методика оценки действия амилолитических ферментов на нативный крахмал // Хранение и переработка сельхозсырья. 2014. № 4. С. 14-17.
9 Hii S.L., Tan J.S., Ling Т.С. Ariff A.B. Pullu-lanase: role in starch hydrolysis and potential industrial application//Enzyme research. 2012. V. 2012. P. 14.
I ORou A., Messaoud E.B., Bejar S. Isolation and purification of an acidic pullulanase type II from newly isolated Bacillus sp. US149 // Enzyme and microbial technology. 2003. V. 33. № 5. P. 720-724.
II Ara K„ Saeki K„ Igarashi K„ Takaiwa M. et al. Purification and characterization of an alkaline amylopullu-lanase with both а-1,4 and а-1,6 hydrolytic activity from al-kalophilic Bacillus sp. KSM-1378 // Biochimica et Biophys-ica Acta. 1995. V. 1243. № 3. Р. 315-324.
REFERENCES
1 Lukin N.D., Borodina Z.M., Lapidus T.V., Mannova I.G. et al. Investigation of the process of bioconversion of native corn starch with the use of amylo-lytic enzymes. Dostizheniya nauki i tekhniki APK [Advances of science and technology of agriculture]. 2011, no. 12, pp. 74-76. (in Russian)
2 Lukin, N.D., Borodina Z.M., Papahin A.A., Shatalova O.V. et al. Study of the action of amylolytic enzymes on native starches of various types in a heterogeneous environment. Dostizheniya nauki i tekhniki APK [Advances of science and technology of agriculture]. 2013, no. 10, pp. 62-64. (in Russian)
3 Tamaki S., Hisamatsu M., Teranishi K., Adachi T., Yamada T. Structural change of maize starch granules by ball-mill treatment. Starch/Starke. 1998, vol. 50, no. 8, pp. 342-348.
4 Shul'man M.S. Mehanicheskaja klejsteri-zacija krahmala [Mechanical gelatinization of starch]. Moskow, Pishhepromizdat, 1961, 149 p.
5 Uthumporn U., Zaidul I.S. M., Karim A.A. Hydrolysis of granular starch at subgelatinization temperature using a mixture of amylolytic enzymes. Food and Bioproducts Processing. 2010, vol. 88, pp. 47-54.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Николай Д. Лукин д.т.н., зам. директора по научной работе, ВНИИ крахмалопродуктов, ул. Некрасова, 11, п. Красково, Московская обл. 140051, Россия, vniik@arrisp.ru Александр А. Папахин к.т.н., заведующий лабораторией, ВНИИ крахмалопродуктов, ул. Некрасова, 11, п. Красково, Московская обл. 140051, Россия Зинаида М. Бородина к.т.н., вед. науч. сотр., ВНИИ крахмалопродуктов, ул. Некрасова, 11, п. Красково, Московская обл. 140051, Россия
Валентина А. Гулакова ст. науч. сотр., ВНИИ крахмалопродуктов, ул. Некрасова, 11, п. Красково, Московская обл. 140051, Россия
КРИТЕРИЙ АВТОРСТВА
Николай Д. Лукин консультация в ходе исследования Александр А. Папахин написание рукописи, корректировка ее до подачи в редакцию, проведение экспериментов, несет ответственность за плагиат Зинаида М. Бородина обзор литературных источников по исследуемой проблеме, постановка и проведение экспериментов, обсуждение результатов Валентина А. Гулакова проведение экспериментов, обсуждение полученных результатов
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ПОСТУПИЛА 17.10.2016
ПРИНЯТА В ПЕЧАТЬ 10.11.2016
6 Arasaratnam V., Balasubramaniam K. Synergistic action of a-amylase and glucoamylase on raw corn. Starch/Starke. 1993, vol. 45, no. 6, pp. 231-233.
7 Fujii M., Homma T., Taniguchi M. Synergism a-amylase and glucoamylase on hydrolysis of native starch granules. Biotechnol. Bioeng. 1988, vol. 32, no. 7, pp. 910-915.
8 Papakhin A.A., Borodina Z.M., Lukin N.D., Gu-lakova V.A. et al. Methods of evaluation of the action of amylolytic enzymes on native starches. Khranenie i pere-rabotka sel'hozsyr'ya [Storage and processing of agricultural products]. 2014, no. 4, pp. 14-17. (in Russian)
9 Hii S.L., Tan J.S., Ling T.C. Ariff A.B. Pullu-lanase: role in starch hydrolysis and potential industrial application. Enzyme research, 2012, vol. 2012, 14 p.
10 Rou A., Messaoud E.B., Bejar S. Isolation and purification of an acidic pullulanase type II from newly isolated Bacillus sp. US149. Enzyme and microbial technology. 2003, vol. 33, no. 5, pp. 720-724.
11 Ara K. Saeki K., Igarashi K., Takaiwa M., Uemura T., Hagihara H., Kawai S., Ito S. Purification and characterization of an alkaline amylopullulanase with both a-1,4 and a-1,6 hydrolytic activity from al-kalophilic Bacillus sp. KSM-1378. Biochimica et Biophysica Acta. 1995, vol. 1243, no. 3, pp. 315-324.
INFORMATION ABOUT AUTHORS
Nikolai D. Lukin doctor of technical sciences, deputy director, All-Russian Research Institute for Starch Products, Nekrasov str., 11, Kraskovo, Moscow region, 140051, Russia, vniik@arrisp.ru Aleksandr A. Papakhin candidate of technical sciences, head of laboratory, All-Russian Research Institute for Starch Products, Nekrasov str., 11, Kraskovo, Moscow region, 140051, Russia Zinaida M. Borodina candidate of technical sciences, leading researcher, All-Russian Research Institute for Starch Products, Nekrasov str., 11, Kraskovo, Moscow region, 140051, Russia Valentina A. Gulakova senior researcher, All-Russian Research Institute for Starch Products, Nekrasov str., 11, Kraskovo, Moscow region, 140051, Russia
CONTRIBUTION
Nikolai D. Lukin consultation during the study Aleksandr A. Papakhin writing of the manuscript, corrected it before submission to the editor, experiments, responsible for the plagiarism
Zinaida M. Borodina review of the literature on an investigated problem, setting up and conducting experiments, discussion the results
Valentina A. Gulakova conducted an experiment, discussion the obtained results
CONFLICT OF INTEREST
The authors declare no conflict of interest.
RECEIVED 10.17.2016
ACCEPTED 11.10.2016
