CC BY
44
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ..
53
УДК 616-006.446.8-092.4:616-091.818:616.155.34:576.385.5
Н.И. Гринева, Т.В. Ахлынина, Л.П. Герасимова, Т.Е. Манакова, Д.А. Шмаров, Т.Г. Сарычева, Т.В. Боровкова,
Н.М. Найденова, Г.П. Саркисян, А.М. Тимофеев, Л.Ю. Колосова, Т.И. Колошейнова, Л.Г. Ковалева, А.Г. Туркина РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ Ph+ КЛЕТОК ОТ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ БОЛЬНЫХ ХМЛ В СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЕ:
ТРИ ТИПА Ph+ КЛЕТОК ПРИ ХМЛ.
Ph+ КЛЕТКИ С ВЫСОКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ ПРОЛИФЕРАЦИИ
Гематологический научный центр РАМН, Москва
Контактная информация:
Гринева Нина Ивановна, д-р хим. наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории генной инженерии адрес: 125167, Москва, Новозыковский проезд, д. 4а; тел. +7(499)-615-31-02 e-mail: nigrin27 @mail. ru
Статья поступила 19.06.2009, принята к печати 20.10.2009.
Резюме
Разработан кинетический подход к детальному исследованию индивидуальных особенностей пролиферации и дифференцировки Ph+ клеток в культуре. С помощью анализа скоростей пролиферации и дифференцировки Ph+ клеток в суспензионной культуре обнаружены три типа Ph+ клеток от разных больных ХМЛ с различиями в пролиферации и дифференцировке (созревании), заключающиеся в разных скоростях накопления пролиферирующих незрелых Ph+клеток, P; клеток, созревающих без деления, D. Соотношения скоростей накопления клеток P и D отражают эффективность пролиферации и дифференцировки Ph+клеток. Эффективность и скорость пролиферации наибольшая у Ph+клеток 1 типа (P/D > 1), а у Ph+клеток 2 типа при скорости созревания большей, чем скорость пролиферации, эффективность пролиферации наоборот наименьшая (P/D < 1). По длительности эти условия (~7 суток) сопоставимы с циклом дифференцировки гемопоэтических клеток. Для Ph+клеток 3 типа за тот же период времени происходит неоднократное чередование преимущества пролиферации (накопления клеток Р) и созревания (накопления клеток D). Пролиферация и дифференцировка Ph+клеток 1 типа изучена детально. Эти Ph+ клетки выделены из костного мозга или периферической крови больных ХМЛ в фазе акселерации, при бласт-ном кризе, в хронической фазе с активной прогрессией и составляют пятую часть исследованных Ph+клеток. Ph+клетки 1 типа пролиферируют с повышенной эффективностью - индексом P/D > 1-2 ^ 20 и долей Ph+клеток в фазах S+G2/M клеточного цикла > 20-45%. Пролиферация и дифференцировка Ph+ клеток 1 типа приводит к повышенному образованию миелоцитов, промиелоцитов и/или бластов при низком содержании нейтрофилов, созревающих без деления. Чем ниже содержание нейтрофилов, созревающих без деления, и чем выше их апоптоз, тем выше эффективность пролиферации, тем серьезнее прогрессия ХМЛ, из ПК и КМ которых выделены Ph+клетки.
Ключевые слова: культивирование гемопоэтических Ph+клеток, хронический миелолейкоз, Филадельфийская хромосома, апоптоз in vitro, эффективность пролиферации и дифференцировки Ph+клеток.
N.I. Grineva, T.V. Akhynina, L.P. Gerasimova, T.E. Manakova, D.A. Schmarov, N.G. Sarycheva,T.V. Borovkova,
N.M. Naydenova, G.P. Sarkisyan, A.M. Tumofeev, L.Yu. Kolosova, T.I. Kolosheynova, L.G. Kovaleva, A.G. Turkina THE ALTERATION IN PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF Ph+ CELLS DERIVED FROM PATIENTS WITH CML:
THREE TYPES OF CML Ph+ CELLS.
Ph+ CELLS WITH HIGH PROLIFERATIVE EFFICIENCY.
Hematology Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
We have developed the new approach to investigate the individual peculiarities of Ph+cell proliferation and differentiation in the culture derived from patients with CML at different CML phases. Three types of CML Ph+ cells have been detected based on the studying of cell proliferation and differentiation rates: P cells; CML Ph+cells accumulated as a result of prolifreaton of non-maturated cells; D cells, CML Ph+cells maturated without dividing. Index P/D, reflects the efficiency of cell differentiation with and without cell proliferation. The type 1 cells were characterized by high P/D (> 1); the type 2 cells were characterized by lower P/D (<1) at the same time we observed that these cells maturation are speeded parallel with the reducing of cell proliferation rate. Proliferation and differentiation period of time both of 1 and 2 Ph+cells types, ~ 7 days, is comparable with the differentiation cycle of hematopoietic cells. The type 3 cells were characterized by repeated interchanges in cell proliferation (P) and differentiation (D). Proliferation and differentiation of type 1 Ph+cells were studied in detail. These cells were isolated from th+e bone marrow of CML patients or from the periferal blood at the acceleration phase, blast crisis or chronic phase. These Ph+cells account to fifth part of cells analysed. We have postulated that the type 1 Ph+cells proliferate with P/D > 1-2 ^ 20, the number of cells at the S+G2/M phases of cell cycle was > 20-45 %. Here, we show that proliferation and differentiation of type 1 Ph+cells lead to accumulation of myelocytes, promyelocytes or/and blasts against the background of the low content of neutrophiles that were matuatred without dividing. Based on the obtained data we conclude, if the accumulation of neutrophiles, maturating without dividing is reduced parallel with the increasing of their apoptotic index the significant progression in CML patients is observed.
Key words: cultivation of hematopoietic Ph+leukocytes, chronic myeloid leukemia, Ph+ chromosoma, cell proliferation and differentiation in culture, apoptosis in vitro, Ph cells in culture, Ph+cell distribution in the cell cycle phases.
54
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ..
Введение
Хронический миелолейкоз является миело-пролиферативным заболеванием, связанным с хромосомной транслокацией t(9;22)(q34;q11) в гемопо-этической полипотентной стволовой клетке и образованием Филадельфийской хромосомы с онкогеном bcr/abl [25; 28; 40]. Ph+клетки содержат онкоген bcr/abl и его онкобелок - тирозинкиназу р210 и участвуют в патогенезе ХМЛ. При прогрессии ХМЛ из хронической фазы в фазу акселерации и бластный криз моноклональное заболевание переходит в поликлональное с дополнительными хромосомными аномалиями или без таковых [1; 7]. По диагностике и отношению к терапии у разных больных наблюдаются различия в течении ХМЛ.
Современные представления о роли хромосомных транслокаций, онкогена bcr/abl и его мутаций в клеточных и молекулярных механизмах широко и весьма успешно исследованы на примере многочисленных клеточных линий и лейкозов [25; 27-29; 36-39; 43]. Клеточные механизмы патогенеза ХМЛ также подробно изучались, но многое остается неясным [17-20; 27-29; 37-43].
Давно известно свойство клеток костного мозга и периферической крови ХМЛ пролиферировать в суспензионных культурах. По увеличению клеточно-сти и включению 3Н-тимидина по мере культивирования обнаружено усиление пролиферации незрелых клеток вначале, а затем ее уменьшение до уровня пролиферации при гемопоэзе в норме. Обнаружена зависимость активности пролиферации от стадий ХМЛ. Отмечено, что активность пролиферации при БК ХМЛ уменьшается [21-23; 30; 31; 33-35; 45; 47]. При ХМЛ гемопоэтических пролиферирующих незрелых клеток образуется меньше, а нейтрофилов, созревающих без деления, наоборот больше, чем в норме [21; 58; 59]. Стволовые Ph клетки пролиферируют менее активно, чем стволовые клетки доноров, а более зрелые Ph+клетки накапливаются наоборот более активно [20; 57; 58]. На этом основании в ряде работ предполагается, что причиной ХМЛ служит дисбаланс самоподдержания (self-renewal) стволовых клеток и пролиферации миелоидных клеток-пред-шественников с созреванием их поздних потомков, а не пролиферация Ph+клеток под действием тирозин-киназы р210 Ъсг/ abl [21; 56-59], как это принято в настоящее время.
Очевидно, что не все особенности клеточной и молекулярной регуляции Ph+клеток при ХМЛ ясны, хотя способность онкогена bcr/abl и тирозинки-назы p210 определять туморогенные свойства, повышать жизнеспособность, активировать пролиферацию и блокировать апоптоз в линиях Ph+клеток детально изучалась [16-18; 25; 29; 41; 43; 49; 50].
Для культур первичных Ph+клеток от больных ХМЛ соотношения активации пролиферации и ингибирования апоптоза более сложные, чем для клеточных линий. С одной стороны экспрессия bcr/abl и p210 необходимы для обеих функций и реализуют их одновременно. С другой стороны первая активность ведет к апоптозу, если она не сбалансирована антиапоптотическими сигналами. Несогласованность данных объясняют тонкими различиями в регуляции клеточных линий и первичных Ph+клеток [22; 23; 27; 54; 57].
В работе [25] исследована роль разных мутантов р210 в клеточной пролиферации, туморогенно-сти и апоптозе Ph+ клеток, полученных трансфекцией генно-инженерными конструктами с различными мутациями в онкогене bcr/abl.
Показано, что функции p210 - активации пролиферации и ингибирования апоптоза проявляются раздельно и обязаны разным мутациям в bcr/abl, в том числе - отвечающим за разные изменения путей сигнальной трансдукции [28; 31; 52]. Оказалось, что изменения в соотношении активации пролиферации и блокирования апоптоза может смещать их баланс в разных направлениях и в разной степени в зависимости от мутаций в онкогене bcr/abl.
Для Ph+клеток от больных ХМЛ такие свойства не изучены по причине отсутствия удобных моделей и подходов, хотя мутации в bcr/abl активно исследуются и используются для диагностики и выбора терапии ХМЛ гливеком и его аналогами [16; 19; 20; 29; 49-51; 55].
Целью данной работы является изучение клеточных и молекулярных механизмов пролиферации и дифференцировки индивидуальных Ph+клеток многих больных ХМЛ в культуре. В поисках подходов к оценке особенностей Ph+клеток от ХМЛ в качестве одной из задач исследовалась кинетика ПД в суспензионной культуре Ph+клеток - мононуклеа-ров, выделенных из ПК и КМ от 23 больных ХМЛ до начала лечения, а также при ХФ, ФА и БК ХМЛ. Для этого использована разработа+нная ранее методика исследования ПД образца Ph+клеток [3; 9], где показано, что ПД Ph+ клеток ХМЛ в культуре протекает аналогично схеме усиленного миелопоэза ХМЛ in vivo и что с помощью кинетики можно определить эффективность ПД, влияние ростовых факторов, экспрессию ряда дифференцировочных антигенов и bcr/abl. В данной работе также изучалась кинетика апоптоза и распределения Ph+ клеток в фазах клеточного цикла в сравнении с характером их ПД.
Материалы и методы
Использованы материалы: гепарин (Flow, Англия); Limphoprep, среда альфа-МЕМ (MP Biomedical, США); DePc, Hepes, Трис, PBS, эмбриональная бычья сыворотка (ЭБС), цитрат Na , лау-рилсаркозил (ICN, США); краситель трипановый синий, L-глутамин и 2-меркаптоэтанол (Serva, Германия), пенициллин и стрептомицин (ОАО «Биохимик», Саранск, Россия); Г-КСФ (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Франция); PBS (10мМ фосфатный буфер + 0,13 М NaCl + 2,7 мМ KCl, pH 7,4) таблетирован-ный, НПЦ «Эко-сервис», Россия.
Исследовали Ph+мононуклеары, выделенные из ПК и КМ от больных ХМЛ в ХФ до лечения и в процессе лечения в ХФ, ФА и БК ХМЛ. Характеристики Ph+ клеток и больных ХМЛ, из ПК и КМ которых получены мононуклеары, даны в табл. 1-3. При ХМЛ в мононуклеарах содержится ~ 90 % клеток миелоидного ростка: гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов (лейкоцитов), также и некоторое количество клеток-предшественников всех ростков кроветворения (бластов). По определению при ХМЛ продукция миелоидных Ph+клеток превалирует [1; 7]. В качестве Ph+мононуклеаров в основном фактически представлены Ph+лейкоциты (~ 95 %) и в их составе гранулоциты (70-90%). И+менно их ПД анализировали в данной работе. В Ph+клетках определены типы мРНК bcr/abl: b3a2, b2a2 или e1a2 с помощью метода RT-PCR как указано в источниках [3; 8].
Ph+ мононуклеары из ПК и КМ получали, отбирая 10-15 мл крови из вены или 1-2 мл КМ из заднего гребешка подвздошной кости больного на разных стадиях ХМЛ, во флакон с гепарином (50 ед/мл), наслаивали на лимфопреп или фиколл с плотностью 1,077 или 1,119 г/см3 в отдельных случаях (табл. 4).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ..
55
Фракцию Ph+клеток выделяли центрифугированием 30 мин при 1500 об/мин и отбирали легкую фракцию. Выделенные клетки дважды промывали буфером PBS, pH 6,8, затем а-МЕМ средой.
Ph+клетки суспендировали в а-МЕМ среде и получали фракцию Ph+ лейкоцитов, содержащих клетки-предшественники (бласты), лимфоциты, грануло-циты и моноциты, а также некоторое количество созревающих нейтрофилов. Гранулоциты и часть зрелых нейтрофилов при ХМЛ имеют низкую плавучую плотность и в отличие от нормальных нейтрофилов полностью не отделяются от мононуклеаров в градиенте плотности 1, 077 лимфопрепа и фиколла. Полученные Ph+клетки исследовали при культивировании в суспензионной культуре.
Содержание живых и мертвых клеток анализировали трижды на мазках, окрашенных 0,2% трипановым синим по Романовскому с подсчетом клеток в камере Горяева.
Культивирование Ph+ клеток проводили аналогично [3]. 2^8*10 клеток/мл культивировали в суспензии с а-МЕМ средой, содержащей 20 % эмбриональной телячьей сыворотки ЭТС, 2 мМ L-глютамина, 10-4 М 2-меркаптоэтанола, 100 ед/мл пенициллина и 50 ед/мл стрептомицина, 25 мМ HEPES-NaOH, pH 7,2-7,4 в 25 см2 пластиковом матрасе 2-3 ч, затем неадгезирован-ные клетки центрифугировали 7 мин при 1 500 об/мин разбавляли до концентрации 0,8^1,4*106 клеток/мл той же средой, переносили в 24-ячеечные или 96-ячеечные платы по 12 ячеек на каждую пробу и инкубировали при 37 °С в условиях абсолютной влажности и 5 % содержания СО2 в течение 2 ч без ЭТС. Затем добавляли ЭТС до 10-20 %, и клетки культивировали 6-14 суток, отбирая пробы целыми ячейками.
Каждая точка выполнялась трижды. В отдельных случаях Ph+лейкоциты культивировали после
2-часовой синхронизации Ph+ клеток в отсутствии ЭТС. Для этого Ph+клетки отмывали от ЭТС центрифугированием в суспензии в среде а-МЕМ, выдерживали и через 2 ч добавляли ЭТС и далее культивировали, как указано выше.
В отбираемых пробах анализировали число живых и погибших клеток, морфологический состав клеток на мазках в трех зонах по 100 клеток в каждой по методу Романовского и идентифицировали морфологию клеток по Абрамову [2] и определяли содержание каждого вида клеток в пробе. По содержанию клеток вычисляли концентрацию каждого вида клеток в пробах в расчете на 10 клеток/мл. Кинетические кривые накопления и расходования субпопуляций Ph+лейкоцитов, гранулоцитов, а также суммы пролиферирующих клеток, P (бластов, промиелоцитов и миелоцитов) и суммы нейтрофилов, созревающих без деления, клеток D - метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов строили на основании изменения концентраций этих клеток. Кривые отражали скорость образования одного вида дифференцирующихся клеток (накопления) с последовательным или параллельным его превращением (расходованием) в следующую субпопуляцию, известную для данной дифференциров-ки, что ведет к падению скорости накопления клеток, т.е.к их расходованию.
Средняя ошибка определения ±5 ^ 11 %. В пробах также анализировали апоптоз и распределение клеток по фазам клеточного цикла с помощью цитофлуо+риметрии.
Ph хромосому в клетках ПК и КМ от больных идентифицировали в лаборатории кариологии ГНЦ РАМН цитогенетическим методом для 100 % митозов или методом FISH.
В Ph+клетках от каждого больного идентифицировали типы мРНК bcr/abl: b3a2, b2a2 или e1a2 методом RT-PCR как указано в статьях [3; 8].
Цитофлуориметрический анализ кинетических кривых апоптоза и распределения Ph+клеток в фазах клеточного цикла при культивировании Ph+клеток. Пробы Ph+клеток (по 5 000) после выделения из КМ и ПК в градиенте плотности и пробы, отобранные в процессе культивирования, центрифугировали 7 мин при 2 000 об/мин и 4 °С, промывали буфером PBS и по каплям фиксировали охлажденным 70%-ным этанолом в течение 30 мин при 4 С. Перед измерением полученную взвесь промывали PBS, центрифугировали и осадок инкубировали в 0,5 мл PBS, содержащего 5 мкг/мл пропидий иодида и 50 мкг/мл рибонуклеазы А, в течение 30 мин при комнатой температуре в темноте [13; 15]. Измерения проводили в проточном флуориметре EPICS-XL. Клетки гранулоцитарного гейта анализировали с помощью прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния и одновременно регистрировали флуоресценцию FL2 пика по амплитуде и площади импульса (это позволяло отсекать слипшиеся клетки, конгломераты и обрывки клеток) в линейном и логарифмическом масштабе, определяя клетки в апоптозе. К клеткам, вышедшим в апоптоз, относили FL2-H частицы с гиподиплоидным набором ДНК, располагающиеся в виде пика влево от пика клеток с диплоидным набором ДНК (уменьшение размера клеток не более 2 порядков). Долю гранулоцитов, находящихся в апоптозе, определяли для клеток, анализируемых в гранулоцитарном гейте, где отсутствуют обрывки клеток. В тех же пробах Ph+клеток получали ДНК-гистограммы и в них анализировали распределение клеток по фазам клеточного цикла (S, G2/M, Gj/0), проверяя отсутствие пика C8, указывающего на тетраплоидные клетки. Для анализа ДНК-гистограмм использована разработанная нами ранее специальная программа компьютерной обработки данных. В основу был положен алгоритм, разработанный для асинхронных пролиферирующих клеточных популяций (SFIT-метод) [26].
Кинетические кривые пролиферации и гибели Ph+ лейкоцитов, которые при ХМЛ составляют основу мононуклеаров, получали согласно концентрации живых и мертвых клеток, которую и вычисляли по доле клеток, определяемой как указано выше, и отнесенных к 106 клеток/мл. О скорости пролиферации лейкоцитов и гранулоцитов судили по кинетическим кривым их накопления и расходования во времени. Получали кинетические кривые, означающие, что параллельно образованию (накоплению) клеток соответствующей морфологии протекает превращение их в следующие субпопуляции (расходование СЯ нейтрофилов указывает на их гибель).
Кинетические кривые дифференцировки Ph+лей-коцитов и их субпопуляций:
— миелоидных клеток,
— лимфоцитов,
— гранулоцитов
— бластов,
— промиелоцитов,
— миелоцитов,
— метамиелоцитов,
— ПЯ сегментоядерных нейтрофилов.
Строили вычисляя концентрацию соответствующих клеток в пробах умножением их доли, определяемой по морфологии на мазках, в пересчете на 106 клеток/мл.
Морфологию на мазках определяли, как указано выше.
56
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ..
Состав клеток на мазках анализировали в трех зонах по 100 клеток в каждой зоне. Ошибка определения ± 5^11%.
Отметим, что кроме морфологии Ph+клетки от ХМЛ № 1.1 и № 2.6 идентифицировали по экспрессии антигенов CD с набором моноклональных антител как указано в работе [9], где и приведены результаты идентификации и кинетики экспрессии антигенов. Результаты согласуются с данными, полученными при анализе морфологии клеток по содержанию и кинетике.
Кинетические кривые индексов эффективности P/D при культивировании определяли как изменение соотношения скоростей накопления и расходования суммы пролиферирующих клеток, P [незрелые] ([бласты, промиелоциты, миелоциты]), и суммы нейтрофилов, созревающих без деления, D [условно зрелые], эквивалентное соотношению концентрации клеток P и D на том основании, что
Vp Kp [P]t Kp x x [P]
X ,
где
Vd Kd [D]t Kd [D]
VP и VD - скорости накопления клеток P и D, KP и KD константы скоростей, [P] и [D] концентрации клеток;
KP/ KD = К - константа удельной эффективности ПД.
Результаты и обсуждение
Первой задачей данной работы являлось изучение различий в пролиферации и дифференцировке в культуре гемопоэтических Ph+ клеток - мононуклеа-ров, выделенных от больных ХМЛ в разных фазах и, предположительно различающихся элементами структуры и функций bcr/abl онкогена, его мРНК и тиро-зинкиназой р2Ш. Для этого были получены кинетические кривые ПД З7 образцов Ph+клеток, выделенных из КМ и ПК 2З больных в разных фазах ХМЛ при культивировании в одинаковых условиях. Ph+ мо-нонуклеары при ХМЛ содержат клетки-предшественники всех ростков кроветворения: миелоидные клетки, лимфоциты и примесь созревающих нейтро-филов, содержание которых изменяется при культивировании. При ПД в качестве Ph+клеток в составе мононуклеаров анализировали Ph+лейкоциты и Ph+грану-лоциты, которые составляют основное содержание Ph+клеток ХМЛ. Характеристика Ph+клеток, рассматриваемых в данном сообщении, и их источников
- больных ХМЛ дана в табл. і-З.
В пробах клеток по ходу культивирования определены кинетические кривые пролиферации Ph лейкоцитов и их гибели в культуре, дифференцировки субпопуляций Ph+лейкоцитов (миелоидных клеток, гранулоцитов, лимфоцитов, моноцитов) и субпопуляций Ph+ гранулоцитов (бластов, промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов, палочкоядерных и СЯ нейтрофилов.
Полученные кривые представляли зависимости скоростей образования и превращения каждого вида клеток одних субпопуляций в следующие субпопуляции при дальнейшей ПД. Характер кривых указывает на скорость образования (накопления) данного вида клеток и их последовательно-параллельные превращения (расходование) в следующий вид - субпопуляцию или гибель клеток, что характерно для ПД. Рассматривались скорости дифференцировки отдельных субпопуляций и суммы клеток, дифференцирующихся одновременно с делением, отвечающих за пролиферацию, и отдельно суммы клеток, созревающих (дифференцирующихся) без деления, характеризующих созревание.
Типы Ph+клеток от больных ХМЛ
Как известно, при миелопоэзе вначале пролиферируют с одновременной дифференцировкой незрелые гемопоэтические клетки-предшественники (и Ph+ клетки в частности). Затем без деления созревают нейтрофилы [14]. Таким образом, кинетические кривые ПД суммы пролиферирующих, - незрелых Ph+клеток P (миелоидные клетки-предшественники, бласты, промиелоциты и миелоциты), и гранулоци-тов, созревающих без деления, D (ММ, ПЯ и СЯ нейтрофилы, условно зрелые), отражают два ключевых этапа ПД: генетической регуляции ПД при пролиферации с дифференцировкой и созревании (диф-ференцировке) без деления клеток. Из табл. 1-З и рис. 1-4 видно, что кинетические кривые клеток P и D от разных ХМЛ заметно отличаются либо большей скоростью пролиферации, т. е. накопления клеток P (и, следовательно, их концентраций) по сравнению со скоростью созревания клеток D.
— 1 тип: [нз] > [з]), либо наоборот большей скоростью созревания, т. е. накопления клеток D по сравнению со скоростью пролиферации
- (2 тип: [з] > [нз]).
Это означает, что скорос+ть пролиферации больше скорости созревания у Ph+клеток 1 типа, и наоборот скорость созревания выше скорости пролиферации у Ph+клеток 2 типа. По длительности ПД Ph клеток 1 и 2 типа (без изменения преимущества скоростей пролиферации или созревания) сопоставимы с циклом дифференцировки функционирующего клона гемопоэтических клеток ~7 сут [1G; 11; 45].
В З-й группе клеток за тот же период времени наблюдается неоднократное чередование этапов то с преимуществом скорости пролиферации, то этапа созревания с преимуществом уже скорости созревания над пролиферацией (З тип). При этом чередование их скоростей, естественно, сопровождается чередованием концентраций клеток P>D с D>P, что видно по пересечению кривых накопления клеток P и D, которые приводятся в последующих публикациях. Соотношение скоростей двух процессов обычно соответствует их эффективности относительно друг друга и в данном случае индексу эффективности P/D. Отсюда различия в Ph+клетках от индивидуальных больных ХМЛ связаны с различиями в относительных скоростях их пролиферации и созревания и, следовательно, с различиями в регуляции их ПД. Для ПД разных типов Ph+клеток соответственно изменяется соотношение скоростей пролиферации и созревания - эффективность ПД и величиш индексов эффективности P2D1>1, P/D2<1 и при P/Ds - чередование P/D1>1 с P/D2<1 и так далее. Отношение содержания P и D клеток в отдельных пробах ПК и КМ гемопоэтических клеток ранее известно как индекс созревания [7]. По результатам исследования ПД в суспензионной культуре Ph+клеток З4 образцов из ПК и КМ от 2З больных ХМЛ (см. табл.1-З) этим данным отвечают три типа Ph+клеток. Пятая часть изученных в этом сообщении Ph+клеток (от разных больных ХМЛ в р+азных фазах болезни) относится к i типу, четверть Ph клеток составляет 2 тип и немногим более половины - З тип с чередованием пролиферации и созревания. Кинетика ПД трех типов Ph клеток была исследована в деталях и сопоставлена с распределением Ph+клеток в фазах клеточного цикла, характеристикой апоптоза и транскрипции bcr/abl гена. Кинетические кривые скоростей накопления и расходования Ph+клеток от разных больных ХМЛ здесь и в следующих статьях выявляют общие черты и различия в ПД клеток при ХМЛ, известные и неочевидные. Здесь обсуждаются результаты исследования Ph+клеток 1 типа с высокой эффективностью пролиферации.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ..
57
Ph+клетки 1 типа с высокой эффективностью пролиферации
ПД Ph+клеток 1 типа происходит при повышенной эффективности P/D и при длительном преимуществе пролиферации Ph+клеток над дифферен-цировкой Ph клеток, созревающих без деления. Из рис.1-4, табл.1 и 4 видно, что ПД Ph+ клетки l-го типа культивируются в течение ~6-14 сут и эффективность их пролиферации составляет P/D1>1-2^20. Пятая часть изученных в этом сообщении Ph+ клеток (от разных больных ХМЛ в разных фазах болезни, табл.1) пролиферирует и дифференцируется в условиях 1 типа ПД c превышением скорости и концентрации пролиферирующих клеток над клетками, дифференцирующимися без деления: при [нз] > [з].
К общим чертам ПД Ph+ мононуклеаров из ПК и КМ разных больных ХМЛ, обнаруженных в данной работе, относится в первую очередь способность Ph+клеток пролиферировать и дифференцироваться в одних и тех же условиях суспензионной культуры с прохождением одного-двух циклов ПД в соответствии с ПД гемопоэтических клеток [1; 7; 14; 45]. Ph+ клетки в среде с ЭТС в отсутствии факторов и ци-токинов, будучи изолированными от регуляции клеточного окружения in vivo, пролиферировали и дифференцировались по известной для ХМЛ in vivo схеме со значительно усиленным миелопоэзом и накоплением миелоидных клеток, что мы ранее наблюдали на примере ПД Ph+клеток одном больного ХМЛ [3]. Это свойство Ph клеток трех типов, вероятно, определяется наследованием и воспроизведением в культуре функций генетических элементов исходных клеток от больных ХМЛ с особенностями их регуляции онкогеном bcr/abl и р210 тирозинкиназой.
Кинетические кривые ПД Ph+лейкоцитов 1 типа в культуре и их субпопуляций, как и Ph+клетки 2 и 3 типа, показывают общий характер образования (накопления) и последующего превращения (расходования) клеток на следующих этапах ПД. Видно, что пролиферация Ph+лейкоцитов от ХФ и ФА ХМЛ про-тек+ает с образованием максимума пролиферации Ph+ лейкоцитов на 1-4 сут. Их концентрация возрастает в 1,2-4 раза и затем понижается в течение следующих 4-7 сут. Далее на 6-9 сут. кривые роста проходят некоторый минимум (иногда виден только перегиб), затем концентрация клеток возрастает (вторая активация пролиферации) и снова падает (табл. 1 и рисунки). Один цикл ПД в культуре занимает ~7 сут., о чем можно судить по времени между первой и второй активацией (ускорением) пролиферации клеток (рис. 1-3; 5). Первая активация пролиферации наблюдается на 1-3 сут.; вторая активация наступает после значительной гибели закончивших дифференцировку Ph+ клеток на ~ 6-S сут. и уменьшении концентрации всех Ph+клеток на порядок (рис. 1-4) и более [3; 9]. Интервал между 1 и 2 активациями ПД совпадает со временем жизни популяции гранулоцитов в норме [10; 11; 14; 45]. Исключение составляют клетки от больного БК ХМЛ (табл. 4). Их рост в культуре практически не активируется; скорость их пролиферации и концентрация клеток только уменьшается. Даже небольшое накопление зрелых (как результат ПД или как примесь в исходных мононуклеарах, выделенных на фиколле 1,077 или 1,119) уменьшает гибель клеток и индекс P/D. Из табл.1, 4 и рис.1-4 видно, что значения P/D Ph+клеток разных больных варьируют от 1-2 до 4 или от 4 до 20, а через 6 сут. культивирования P/D не превышает 1-2 и 1-4 соответственно. Исключение составляют Ph+лейкоциты при БК ХМЛ. На 1-4 сут. культивирования индекс P/D заметно падает: до
0,8-2,5 или 1-6 соответственно (табл. 1, 4; рис 1-2; 4).
Скорость достижения максимальной концентрации Ph+клеток от разных ХМЛ варьирует от 1 до 7 сут. Для Ph+клеток № 1.2, 1.3 и 1.5 максимумы накопления Ph+клеток по времени совпадают с максимальной эффективностью - индексом P/D (табл. 1). Эти результаты согласуются с исследованиями кинетики пролиферации лейкоцитов от больных в культуре и с клиническими данными об изменении лейкоцитоза при переходе от ХФ к ФА и БК ХМЛ [19-23; 33-35; 45; 47].
Распределение Ph+клеток в фазах клеточного цикла и доля апоптоза в характеристике пролиферации. Кроме кинетики ПД также исследовали кинетику распределения клеток по фазам клеточного цикла и апоптоза, определяемого цитофлуореметрически с пропидий йодидом, а также гибели клеток, анализируемой по окрашиванию трипановым синим (рис. 1-4). Отметим, что апоптоз из-за быстрой гибели клеток, выходящих в апоптоз (~ 6-12 ч), выявляет гибель клеток на момент определения. С трипановым синим видно накопление погибших клеток за 3-5 сут. На рис. 2 видно, что активный апоптоз (рис. 2) и общая гибель клеток (рис. 1-4) способствуют 1 типу ПД, повышая индекс эф фективности P/D.
При Пд Ph клеток из ПК ХМЛ № 1.2, имеющих невысокие значения P/D (1,2-1,S), доля Ph+ клеток в фазах клеточного цикла S + G2/M (клетки пролиферирующего пула) увеличивается с 20 до 45% с максимумом на 3 сут. (рис. 2б) и падает к 6 сут. При этом наблюдается апоптоз нейтрофилов, созревающих без деления и накапливающихся на 3-5 сут. Высокие значения P/D характерны для Ph+клеток от ХМЛ в фазе акселерации или БК № 1.3 и 1.4 (рис. 3; табл. 4) и ХФ ХМЛ, довольно быстро достигающей БК (ХМЛ № 1.1, рис. 1 и табл. 1), Индекс P/D при первой активации пролиферации Ph+клеток №1.1 на 1 сут. достигает 12 (рис. 1).
Максимумы пролиферации соответствуют максимальной доле их пролиферирующего пула в S+G2/M фазах клеточного цикла и максимальной эффективности P/D. Они также зависят от скорости накопления и гибели зрелых Ph+клеток. При этом кинетические кривые накопления Ph+лейкоцитов и распределения Ph+клеток по фазам клеточного цикла хорошо согласуются по характеру и скорости достижения максимумов (рис. 2а-б). Одина+ковое увеличение в 3 раза пула пролиферирующих Ph+клеток в фазах S+G2/M и накопления Ph лейкоцитов свидетельствует об активной пролиферации в 1 цикле дифференцировки. Та же активность пролиферации видна на кривой роста числа Ph+лейкоцитов. Максимум P/D = 12 для клеток № 1.1 наблюдается на 1 сут. культивирования, а максимальное накопление Ph+миелоцитов, которые составляют здесь основное содержание Ph+клеток, достигается на
3-7 сут. (рис. 1).
Максимальные значения P/D Ph+клеток от БК ХМЛ № 1.4 достигает 20 при практическом отсутствии нейтрофилов, созревающих без деления (табл. 4). Увеличение P/D (от 1-3 до 9-13 за 7 сут.) соответствует завершению ПД Ph+клеток от больного ФА ХМЛ №
1.3 (рис. 3). К концу 1-2 циклов дифференцировки гибель и апоптоз клеток увеличивается от 5 до 60 %. На рис. 2 б видно повышение доли клеток в S+G2/M фазах клеточного цикла и доли апоптоза. При этом максимум накопления СЯ понижается на 3 и 4 сут. Повышение доли клеток в S+G2/M фазах по скорости соответствует накоплению Ph+лейкоцитов и их компонентов на кинетических кривых ПД Ph+ лейкоцитов как и повышению индексов P/D. Это означает, что 1 тип ПД реализуют Ph+ клетки с высоким индексом эффективности пролиферации P/D при низком содержании нейтрофилов, созревающих без деления.
Эффективность пролиферации и дифференцировки РИ+клеток 1 типа в культуре Р/0>1. Скорость накопления и концентрация пролиферирующих незрелых клеток, Р, больше, чем клеток, созревающих без деления, Б (условно зрелых). Концентрация |нз| > |з|.__________________________________________________________________________
п/п Образцы мононуклеаров, выделенных из ПК или КМ больных ХМЛ Показатели эффективности P/D в процессе пролиферации и дифференцировки Итоги наблюдения больного. Длительность и вид эффективного лечения
№ образца ПК или КМ, № рис. или табл. Диагноз при отборе пробы Тип bcr/abl РНК. Лейкоцитоз Х109/ л; %бластов Продолжительность этапа Р/Б>1, сут. P/D*** [нз]/[з]’ [Бласты]/ [Миелоциты] до прогрессии ХМЛ
1 1.1 ПК Рис. 1 ХФ b3a2 L115; бласты 3% 14 сут. 12-4 4-1 2—0,1 0,1—0,3 9 мес. до миелоидного БК; реаферон цитозар, ПХТ**, гливек; %бластов снижен с 34 до 16 %; 2 РИ+ хромосомы. Летальный исход
2 3 1.2 КМ ПК, Рис. 2 ХФ б 3 ас 3 ты 2 a2 сг 8 сут. до 8 сут. 1,2—1,6 2,4-1 0,3—3 0,1—0,3 3,5 г от резистентности до краткой ПКГР+: Реаферон, гливек 400; далее по н/вр гливек 600. ГОМ* до отбора пробы
4 5 1.3 КМ ПК, Рис. 3 ФА b2a2 бласты 17% > 8 сут. 3—9 1—13 >0,1 >0,1 Резистентность ко всему; саркомати-зация, экстрамедулярное поражение лимфоузлов; БК летальный исход. До отбора пробы ПХТ**
6 1.4 ПК, Табл. 4 БК лимфо идного типа b2a2 бласты 30% > 6 сут. >20-2 10—0,4 Лимфоидный БК, ПХТ; 6 месяцев ХФ, 3 месяца БК; летальный исход. До отбора пробы ПХТ**
7 1.5 ПК, Рис. 4 ХФ b3a2 L 175 бласты 5% до 8 сут. 1,2—2,5 -0,5 -0,3 ХФ; 7 лет ГОМ*, гливек; БЦГ0++ ПКГР+ до н/вр. ГОМ* до отбора пробы
Лечение: *гидроксимочевина; **полихимиотерапия; +полная клинико-гематологическая ремиссия; ++большой цитогенетический ответ. ***Для значений P/D указан интервал изменений по ходу кинетической кривой.
Эффективность пролиферации и дифференцировки РИ+клеток 2 типа в культуре Р/О < 1.
Скорость накопления и концентрация нейтрофилов, созревающих без деления , Б, больше, чем пролиферирующих незрелых клеток, Р. Концентрация |з| >[нз1.__
№ п/п Образцы мононуклеаров, выделенных из ПК или КМ больных ХМЛ Показатели эффективности P/D в процессе пролиферации и дифференцировки Итоги наблюдения больного. Длительность и вид эффективного лечения до прогрессии ХМЛ
№ образца ПК или КМ Диагноз при отборе пробы Bcr/abl РНК, Лейкоцитоз х109/ л; % бластов Продолжительность этапа Р/О<1, сут. P/D*** [нз]/[з]’ [Бласты]/ [Миелоциты]
1 2.1 ПК ХФ b3a2 L 188-145 > 6 сут. 0,3-0,8 0-0,06 ХФ; ~ 3 г без лечения, 2,5 г в ПКГР +; Полиплоидия с Ph+ хромосомой; гливек-800 н/вр. ГОМ* до отбора пробы
2 2.2 КМ ХФ b3a2 > 5 сут. 0,8-1,5 0,03-0,21 Данных нет. По кинетике ПД* начало правого сдвига СЯ. ГОМ* 4 суток до отбора пробы
3 2.3 ПК ХФ b3a2 ~6 сут. 0,4-1,0 0,15 Клинических данных нет, по кинетике ПДх ранняя стадия ХФ
4 2.4 ПК ХФ, 2 группа риска типа L165 ~7 сут. 0,3-1, 2 0,06 6 лет реоферон, ПКГР+ и БЦГО++, Аллергия: гливек, снова реоферон и АНШ7 н/вр. До отбора пробы реаферон
5 2.5 ПК ХФ b2a2 До 7 сут. 0,5-1,1 0,1-0,2 Клинических данных нет. По значениям P/D пролиферативный потенциал приближается к 1 типу
6 7 2.6 ПК КМ ХФ b3a2 >9 сут. 0,2-1,0 0,3-1,0 (2) 0,03-0,14 Клинических данных нет. По значениям P/D пролиферативный потенциал в ПК на 2 этапе ПД* приближается к 1 типу
8 9 2.7 ПК КМ ХФ b2a2 ~4-6 сут. 0,4-1,5 1,5 0,05-0,19 Дата анализа март 1999 г Наблюдение 0,5 года. Резистентен к реаферону; нет ПКГР+.
Лечение:
*гидроксилмочевина;
**полихимиотерапия; +полная клинико-гематологическая ремиссия; ++большой цитогенетический ответ. ПДх - пролиферация и дифференцировка. ***Для значений P/D указан интервал изменений по ходу кинетической кривой.
Эффективность пролиферации и дифференцировки РИ+клеток 3 типа в культуре, протекающей с чередованием: этапов Р/Б>1 на Р/Б< 1, скоростей накопления и концентраций пролиферирующих незрелых клеток, Р, и нейтрофилов, созревающих без деления, Б.
Частота чередования этапов |нз| > [з]—» Гзі > Гнз]—» Гнз] > |з1 от 0,5 до 6 суток ^__________________________________________
№ п/п Образцы мононуклеаров, выделенных из ПК или КМ больных ХМЛ Показатели эффективности P/D в процессе ПДх Итоги наблюдения больного. Длительность и вид эффективного лечения до прогрессии ХМЛ
№ образца ПК или КМ Диагноз при отборе пробы L-Лейкоцитоз х109/ л; % бластов P/D*** [нз]/[з] [Бласты]/ [Миелоциты]
1 3.1 КМ ХФ e1a2 1-2,5 0,1—0,2 Клинических данных нет. По кинетике выход в ФА и 1 тип РИ+ клеток
2 3.2 ПК ФА b3a2 L 144, Tp.692 1,2—1,5 0,03—0,25 2 г по н/ в ГОМ*; гливек. По кинетике ПД* 3 тип РИ+клеток.
3 4 3.3 КМ ПК ХФ b3a2 L 194 12-0,5 1,5—1,0 0,2—0,6 0,6—0,3 7 лет; ХФ 2,2 года ГОМ, интерферон; ФА, гливек; ПКГР+ Выход во 2 тип ПДх с высоким % СЯ в ПК.
5 3.4 КМ ХФ b2a2 0,4 —1,6 0,03—0,1 2 г по н/время, ГОМ* и гливек 800. Проба после лечения ГОМ*
6 3.5 КМ ХФ, 2 группа риска L 165 0,3—3,5 0,2—0,6 6 лет; реаферон, гливек, снова реаферон и АН 107; ПКГР и БЦГО; ФА или БК? Проба после реаферона
7 3.6 КМ ХФ b3a2 1,5—0,4 0,03—0,14 7 лет ХФ Гидреа, гливек; ПКГР, БЦГО. До отбора пробы 4 сут. ГОМ*
8 3.7 КМ ПК ХФ b2a2 2,5—0,7 1,4—2 0,1 0,5 Клинических данных нет; По кинетике ранняя стадия ХФ и выход во 2 тип с высоким %СЯ
9 10 3.8 КМ ПК ХФ b3a2 L 136, Тр.298 0,4—4 0,4 0,3 0,3 5 лет; ГОМ*, гливек 400 -4 г. Обнаруживается 0,11% РИ+ хромосомы. ПКГР, БЦГО. Проба после лечения ГОМ*
11 3.9 КМ ХФ b3a2 1,1 0,13 Нет данных. По кинетике ПДх начальная стадия ХФ
12 3.10 ПК ФА b3a2 L 258-14, Тр.880 0,7—1,4 0,02 2 г. гливек 800, высокая экспрессия Ь3а2; ПКГР. Наблюдается ингибирование СЯ. Проба после лечения ГОМ*
13 14 3.11 ПК КМ ХФ, 1 группа риска b3a2 L 120 0,3—1,6 0,8—1,0 <0,08 Ингибирование пролиферации миелоцитов и апоптоза СЯ нейтрофилами. Проба после 6 суток лечения ГОМ*
15 3.12 КМ ХФ b3a2 1,5—0,4—0,7 0,25 5 лет; ГОМ*, гливек 1,5 г. Проба после 7 сут лечения ГОМ*
16 3.13ПК ХФ b2a2 0,5—2,4 0,14 Нет данных
17 3.14 КМ ХФ Ph+ нет хромосомы 0,7—1,3 0,11 Нет данных По кинетике ПДх предполагается начальная стадия ХФ
Лечение: *гидроксилмочевина; **полихимиотерапия; +полная клинико-гематологическая ремиссия; ++большой цитогенетический ответ. ПДх - пролиферация и дифференцировка. ***Для значений P/D указан интервал изменений по ходу кинетической кривой.
Культивирование в течение 6 сут. РИ' мононуклеаров, гранулоцитов и их составляющих, выделенных из ПК ХМЛ № 1.4 в фазе лимфоидного бластного криза, %
РИ+клетки ПК исходная Мононуклеары: выделены из ПК в градиенте плотности фиколла 1,077, % Клетки: выделены из ПК в градиенте плотности фиколла 1,119, %
Время культивирования, сут. 0 0 3 6 0 3 6
РИ+лейкоциты живые 100±4,0 100±4,0* 50±2,6 45±2,5 100±5 79±4,5 36±2
РИ+лейкоциты погибшие - 22±1,3 45,2±2 47,1±2,3 11±0,6 21,3±1,2 44,7±2,3
Гранулоциты: I 1-6 58±3,0 48±2,5** - 28±1,5 48±2,6 - 31±1,6
1. Бласты 16±1,5 43±2,2 - 13±0,7 25±1,2 - 5±0,5
2. Промиелоциты - 0 - 9±0,1 0 - 19±1
3. Миелоциты 2±0,1 3±0,15 - 2±0,1 4±0,2 - 3±0, 2
4. Метамиелоциты 0 0 - 2±0,1 4±0,2 - 0
5. Палочкоядерные 22±1,1 0 2±0,1 9±0,6 - 0
6. Сегментоядерные 18±0,9 0 - 0 4±0,2 - 4±0,2
Лимфоциты 24±1,7 49±2,5 - 58±2,9 44±2,2 - 51±2,6
Гранулоциты незрелые 18±1,0 46±2,4 - 24±1,4 29±1,5 - 24±1,3
Нейтрофилы зрелые 40±2,1 0,2±0,1 - 4±0,2 17±0,8 - 4±0,3
Р/О 0,45 >20 - 6 1,7 - 6
*начальная концентрация лейкоцитов 1*106 клеток /мл; **начальная концентрация гранулоцитов 0,43* 106 клеток/мл.
Рис. 1. Кинетические кривые пролиферации и дифференцировки Ph+клеток (мононуклеаров) из ПК больного ХМЛ в хронической фазе № 1.1:
Кривые отражают скорости накопления и расходования Ph+лейкоцитов, гранулоцитов и их субпопуляций: Ph+лейкоцитов (а), гранулоцитов и их субпопуляций (б), сумма пролиферирующих клеток, Р [нз], и клеток, созревающих без деления, D [з] (в); индекс эффективности P/D - как соотношение скоростей накопления пролиферирующих, P, и созревающих, D, клеток (в); К клеткам P относили миелоидные клетки-предшественники, бласты, промиелоциты и миелоциты; к клеткам D - метамиелоциты, палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы (ММ, ПЯ и СЯ) соответственно.
Концентрация клеток 10ьЛулл Концентрация клеток xJO 6Лил
Рост и гибель Ph+лейкоцитов КМ
Апоптоз и расределение клеток КМ по фазам
Время, сутки —=—Живые клетки —х — Мертвые клетки
Дифференцировка гранулоцитов КМ
Время, сут
Время, сутки
-апоптоз
-G2/M
-Лейкоциты
-Миелоциты
■Гранулоциты ■Лимфоциты
Индекс РЮ, КМ
Рис. 2. Кинетические кривые пролиферации и дифференцировки Ph+клеток из КМ (а-д) больного в хронической фазе ХМЛ № 1.2:
Пролиферация Ph+клеток из КМ и ПК и их гибель (а), апоптоз и распределение по фазам клеточного цикла Ph+клеток из КМ (б), дифференцировка лейкоцитов (в), гранулоцитов и их субпопуляций (г); индексы эффективности P/D и кривые накопления и расходования клеток P и D (д).
Время, сутки
Время, сутки
-Миелоциты ■Бласты
■ Се гменто ядерные
■ Метамиелоциты
■ Палочко ядерные
■ Промиелоциты
■ Незрелые ‘РЮ (н/з)
-Зрелые
Концентрация клеток х10 6Лиш I I Концентрация клеток х 10 6Лууш
1.5
1,2
0,9
0,6
0,3
о
Рост и гибель Ph+лейкоцитов ПК н КМ %
60
50
40
30
20
10
о
3 10
Время, сут ■ Ph+лейкоциты, КМ —;— лейкоциты П К ■мертвые, КМ,% —о—мертвые ПК,%
Дифференцировка ^
гранулоцитов ПК
Время, сут
■ Миелоциты —•—Сепулентоядерные
■ Палочкоядерные —о—Метамиелоциты
■ Промиелоциты —♦— Бласты
Индекс РЮ КМ
РЮ
О
i=;
Р
■lj
iTj
Э-
§
Время, сут
■миелоциты —•—Бласты
■метамиелоциты —•—сепулентоядерные ■промиелоциты —о—пало>-коядерные
Индекс РЮ ПК
РЮ
18
15
12
9
6
3
О
Время, сут
■незрелые ■Бласты
-зрелые -РЮ (н/з)
-незрелые
■РЮ
Время, сут
-й—зрелые
Рис. 3. Кинетические кривые пролиферации и гибели Ph+ лейкоцитов из КМ и ПК ХМЛ № 1.3 в фазе акселерации (а), дифференцировки Ph+гра-нулоцитов КМ, ПК и их субпопуляций (б; г), а также индексов P/D и клеток P и D (в; д). Ph+клетки из КМ (а-в) и из ПК (а; г; ж).
Концентрация клеток х10 'Vrui.n
Рост н гибель j
Ph+лейкоцитов ПК
Дифференцировка
Время, сут ■живые —х—мертвые ■гранулоциты Лимфоциты
х
Р
0
ОС
И
I
S
X
Индекс Р/D ПК
■Бласты
■Миелоциты
■Палочкоядерные
с.
?
о
х
Р
0
ос
§
<П
г
2.5 2
1.5 1
0,5
0
Время, сут
—■—Промиелоциты —;—метамиелоциты —•—Се гменто ядерньк
Время, сут
'Бласты —:
-зрелые —I
незрелые РЮ (н/з)
Рис. 4. Кинетические кривые роста концентрации Ph+клеток из ПК от больного в ХФ ХМЛ № 1.5 и их гибели (а), дифференцировки гранулоцитов и их субпопуляций (б); индекса P/D и клеток P и D (в)
66
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ..
Очевидно, чем выше эффективность пролиферации P/D и скорость пролиферации, тем выше пролиферативный потенциал Ph клеток, тем ниже накопление СЯ при созревании. Эти параметры определяют преимущество пролиферации над созреванием при ПД Ph клеток 1 типа.
Полученные результаты согласуются с известными данными об активной пролиферации клеток из КМ и ПК ХМЛ. Активацию пролиферации клеток к культуре ранее наблюдали в присутствие факторов роста [3; 12; 21; 27; 30; 31; 45]. По совокупности литературных данных и наших результатов эффективность пролиферации (индекс P/D) Ph+ клеток 1 типа зависят от фазы ХМЛ, от распределения Ph+клеток в фазах S+G2/M клеточного цикла, скорости и степени апоптоза.
Кинетика дифференцировки Ph+клеток 1 типа представлена кинетическими кривыми накопления и расходования Ph+ лейкоцитов (их составляющих гра-нулоцитов, моноцитов и лимфоцитов), а также кинетическими кривыми субпопуляций гранулоцитов: бластов, промиелоцитов, миелоцитов, ММ, ПЯ и СЯ нейтрофилов (рис. 1б-в; 2в-г; 3б-д; 4б; табл. 1). При ХМЛ Ph+лейкоциты содержат 70-90 % миелоидных клеток [1; 7], что согласуется с кинетическими данными дифференцировки Ph+ клеток в культуре здесь и в [3]. В кинетических кривых Ph+гранулоцитов 1 типа видно пониженное содержание зрелых клеток; иногда они почти отсутствуют, особенно СЯ ней-трофилы при ФА и БК ХМЛ. При ПД Ph+клеток от ХФ ХМЛ СЯ накапливаются до концентрации не выше 2*105 клеток/мл (рис. 2г; табл. 4); в случаях рис.1б; 3в-г; 4б концентрация СЯ на порядок ниже. За накоплением нейтрофилов следует заметное увеличение доли апоптоза гранулоцитов (рис. 2б-г).
Из Ph+клеток ХФ и ФА ХМЛ наибольшего накопления достигают миелоциты (рис. 1-3; 5), а при БК повышено содержание бластов и промиелоцитов (табл. 4). Это вполне согласуется с данными [48] об основном содержании миелоцитов в миело-идных клетках при ХФ ХМЛ. Из клинических исследований при прогрессии ХМЛ хорошо известен сдвиг в сторону образования незрелых клеток («сдвиг влево», «бластный сдвиг») с характерным повышением содержания в первую очередь миелоцитов, далее промиелоцитов и миелобластов, а также низкое содержание ПЯ и СЯ нейтрофилов при ФА и БК ХМЛ [1; 7; 48]. Отметим, что по кинетическим кривым ПД Ph+клеток 1 типа из ПК ХФ ХМЛ № 1.1 (рис. 1) обнаружены свойства близкие БК миелоидного типа; клинически БК миелоидного типа у этого больного был выявлен на полгода позже.
Любопытно, что Ph+ клетки, полученные от БК ХМЛ № 1.4 (табл. 4), пролиферируют в культуре менее активно, чем клетки, полученные от ХФ ХМЛ (табл. 1; рис. 2; 4). При культивировании Ph+лейкоцитов № 1.3 от ХФ ХМЛ клеточность возрастает в 1,25 раза (рис. 3), а для Ph+лейкоцитов от ХМЛ БК № 1.4 она только уменьшается (табл. 4). В обоих случаях видно очень низкое накопление ПЯ и СЯ нейтрофи-лов и почти полное их расходование по ходу ПД. В случае ХФ ХМЛ (рис. 3) еще сохраняется высокая концентрация миелоцитов, а при БК ХМЛ (табл. 4) гранулоциты уже на 79 % состоят из промиелоцитов и бластов и содержат только 7 % миелоцитов. Накоп-лен+ие зрелых нейтрофилов тормозит пролиферацию Ph+клеток 1 типа, а их гибель повышает эффективность пролиферации. Отметим, что в исходной ПК ХМЛ № 1.4, содержащей ~ 40 % ПЯ и СЯ нейтрофи-лов, индекс P/D равен 0,45. В мононуклеарах из этой ПК в отсутствии нейтрофилов P/D достигает 20.
Итак, при ПД Ph+клеток 1 типа протекает эффективная пролиферация, которая зависит от индивидуального источника Ph+клеток с их онкогеном bcr/abl, от вида и содержания в них клеток-предшествен-ников, а также стадий ХМЛ. ПД Ph+клеток 1 типа характеризуется высоким индексом эффективности P/D, значительным накоплением миелоцитов или бла-стов, пониженным содержанием нейтрофилов, созревающих без деления, апоптоз которых способствует увеличению скорости и эффективности пролиферации. Отметим, что транскрипция bcr/abl при ПД Ph+клеток 1 типа определена в [3], где показано совпадение максимумов транскрипции этого гена и индекса эффективности P/D на 1 сут. Ph+клеток из ХМЛ № 1.1. Индивидуальные различия в закономерностях ПД при культивировании Ph+ клеток разных от больных ХМЛ в разных фазах с их индивидуальной генетической программой, проявляющиеся в одинаковых условиях суспензионной культуры, изолированной от многофакторной регуляции in vivo, ранее не изучались. С помощью анализа скоростей ПД Ph+ клеток от индивидуальных больных ХМЛ в суспензионной культуре обнаружены три типа Ph+клеток, встречающиеся у разных больных ХМЛ с различиями в пролиферации и созревании и, очевидно, в их регуляции. По кинетике ПД Ph+ клеток данного больного ХМЛ в культуре можно судить о ПД не только до лечения больного, но и о ПД в процессе болезни и терапии, так как механизм ПД довольно стабильно воспроизводится со всеми тонкостями регуляции ПД клеток от разных больных.
+Параметры пролиферации и созревания при ПД Ph+лейкоцитов и их субпопуляций, полученные нами при культивировании проб ПК и КМ от многих индивидуальных больных ХМЛ с помощью кинетического анализа ПД, согласуются с многими характеристиками, полученными в результате клинических исследований, основанных на данных многочисленных больных в разное время болезни [1; 7; 21; 30; 33; 34; 45; 47; 59]. Пониженное накопление нейтрофилов в культуре клеток из КМ и ПК при бластном кризе ХМЛ ранее обнаружено в клинических исследованиях, медицинской практике, а также в опытах с суспензионными культурами клеток от ХМЛ и названо дефектным созреванием [1; 7; 20; 33; 34; 45; 58]. Результаты исследования кинетики ПД в культуре показывают, что дефектное со+зревание связано с эффективной пролиферацией Ph+ клеток 1 типа и гибелью зрелых нейтрофилов в условиях активного апоптоза последних при ПД. Отметим, что индекс эффективности P/D как отношение скоростей пролиферации и созревания Ph+ клеток в течение одного цикла ПД субклона Ph+клеток величина переменная. Это соответствует многоступенчатым превращениям субпопуляций с уменьшением пролиферативного потенциала, из которых три последних субпопуляции не способны к делению. Пролиферативный потенциал Ph+клеток 1 типа можно оценить по индексу P/D и доле Ph+клеток в S+G2/M фазах клеточного цикла для одного цикла ПД Ph+клеток трех типов от разных источников. Вероятно, пролиферативный потенциал Ph+ клеток также величина не постоянная.
Роль bcr/abl онкогена и тирозинкиназы p210 в изменениях путей сигнальной трансдукции [20; 24-28; 32; 37; 38; 40-42; 44; 52-53], их влияние на самопод-держание гемопоэза и на параметры клеточного цикла [46; 58], на механизмы апоптоза [4-6; 17; 18; 38; 39; 41] и регуляцию пролиферации Ph+ клеток цитокина-ми [4-6; 12; 25; 26; 35; 43] указывает на участие bcr/abl онкогена и тирозинкиназы p210 в клеточных и молекулярных механизмах регуляции ПД Ph+ клеток.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ..
67
Об этом свидетельствуют работы на клеточных линиях Ph+клеток [19; 20; 25; 48; 51]. На клетках от больных ХМЛ об этом также свидетельствуют различия в эффективности ПД в культуре первичных Ph+клетках от разных больных ХМЛ, обнаруженные в данной работе. Полученные здесь результаты можно использовать для уточнения диагноза, прогнозирования течения ХМЛ и выбора терапии данного больного. Кинетический подход к ПД позволяет определить эффективность P/D, пул пролиферирующих клеток при ПД и по этим данным оценить путь потенциальной прогрессии ХМЛ. Результаты исследования демонстрируют информативный подход для изучения клеточной и молекулярной регуляции ПД гемопоэтических клеток. Отметим, что исследование роли и встречаемости обнаруженных общих черт и различий в ПД при ХМЛ отдельная самостоятельная задача.
Заключение
На примере Ph+клеток от индивидуальных больных ХМЛ в разных фазах с предполагаемыми мутациями в онкогене bcr/abl, сопровождающими ХМЛ, разработан кинетический подход к детальному исследованию индивидуальных особенностей Ph+клеток по скорости и эффективности пролиферации и созревания при ПД в культуре.
Обнаружено 3 типа Ph+клеток, различающихся соотношением скоростей и эффективности пролиферации и созревания, где индекс эффективности P/D количественно выражает соотношение скоростей пролифераци+и и созревания.
При 1 типе Ph+клеток P/D>1, при 2 типе P/D<1 продолжительное время ~7 сут. При 3 типе Ph+клеток за тот же период времени этапы пролиферации и созревания со своими индексами P/D неоднократно чередуются. Изучена ПД Ph+клеток 1 типа с P/D>1-2 ^ 20 и долей Ph+клеток в S+G2/M фазах клеточного цикла > 20-45 %, которая приводит к повышенному накоплению миелоцитов, промиелоцитов и/или бластов при низком накоплении нейтрофилов, созревающих без деления. Чем ниже содержание нейтрофилов, созревающих без деления, тем выше эффективность пролиферации, тем серьезнее прогрессия ХМЛ, из КМ или ПК которых выделены Ph+ клетки. Ph+ клетки 1 типа получены от больных ХМЛ в фазах ФА, БК и активно прогрессирующей ХФ ХМЛ и составляют пятую часть исследованных Ph+клеток.
Показано, что индекс P/D переменная величина в течение цикла ПД субклона Ph+клеток, что соответствует многоступенчатым превращениям клеток с уменьшением пролиферативного потенциала, из которых три последних субпопуляции не способны к делению.
Литература
1. Абдулкадыров К.М., Бессмельцев С.С., Рукавицын О.А. Хронический миелолейкоз. - СПб: Специальная литература, 1998. - 463 с.
2. Абрамов М.Г.. Гематологический атлас, - М., Медицина, 1985 . - 344 с.
3. Ахлынина Т.В., Герасимова Л.П., Саркисян Г.П. и др. Кинетика пролиферации, дифференцировки и транскрипции генов, регулирующих апоптоз, BCR/ABL+Ph+клеток человека в культуре//Цитология. - 2007. -Т. 49. -С. 889-900.
4. Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. Роль ростовых факторов в регуляции кроветворения // Гематология и трансфузиология. - 2000. - Т. 45, № 6. - С. 6-8.
5. Владимирская Е.Б. Механизмы апоптоза клеток крови // Лабораторная медицина. - 2001. - № 4. - С. 47-54.
6. Владимирская Е.Б. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста. В кн.: Биологические основы противоопухолевой терапии. - М.: Агат-Мед, 2001. - С. 5-32.
7. Руководство по гематологии под ред. А.И. Воробьева. - Т.1. - М.: Ньюдиамед, 2002. - 280 с.
8. Герасимова Л.П., Манакова Т.Е., Ахлынина Т.В. и др. Экспрессия онкогена BCR/ABL и р53-индуцированный апоптоз в суспензионных культурах гемопоэтических Ph+ клеток при хроническом мие-лолейкозе // Российский биотерапевтический журнал. - 2002. - Т. 1, № 4. - С. 29-38.
9. Гринева Н.И., Барышников А.Ю. и др. Кинетика экспрессии антигенов в процессе пролиферации и дифференцировки Ph+клеток периферической крови при ХМЛ в культуре // РБЖ. - 2007. - Т. 6, № 2. - С. 21-32.
10. КозинецГ.И., КотельниковВ.М. Кинетика гемопоэза и ее клиническое значение//Сов. медицина. - 1983. - № 4. -С. 3-77.
11. Котельников В.М., Козинец Г.И., Касаткина В.В., Ковалевская Н.П. Кинетика гранулоцитопоэза. В кн.: Кинетические аспекты гемопоэза. - Томск: Изд. Томского государственного университета, 1982. - С. 149-211.
12. Натан Д.Г., Зифф КА. Регуляция кроветворения//Гематология и трансфузиология. - 1994. - Т. 39, № 2. - С. 3-10.
13. Пинегин Б.В., Ярилин А.А., Симонова А.В. и др. Цитофлуориметрический метод оценки апоптоза активированных лимфоцитов периферической крови человека с помощью пропидиум иодида. В кн.: Применение проточной цитофлуориметрии для оценки функциональной активности... - М.: МЗ РФ, 2001. - С. 48-53.
14. Розмарин А. Д. Лейкоциты. В кн.: Патофизиология крови. - М.: BINOM Publishers, 2000. - С. 123-148.
15. Шмаров Д.А., Козинец Г.И. Способы анализа клеточного цикла при помощи проточной цитофлуориметрии. В кн.: Лабораторно-клиническое значение проточного цитометрического анализа крови. - М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - С. 49-65.
16. Amarante-Mendes G.P., Naekyung Kim C., Liu L. et al. Bcr-Abl exerts its antiapoptotic effect against diverse apop-totic stimuli through blockage of mitochondrial release of citochrome C and activation of caspase-3 // Blood. -1998. - Vol. 91. - P. 1700-5.
17. Bedi A., Zehnbauer B.A., et al. BCR-ABL-mediated inhibition of apoptosis with delay of G2/M transition after DNA damage: a mechanism of resistance to multiple anticancer agents // Blood. - 1994. - Vol. 83. - P. 2038-44.
18. Bedi A., Barber J.P., Bedi G.C et al. Inhibition of apoptosis by BCR-ABL in CML//Blood. - 1995. - Vol. 86. - P. 1148-58.
19. Brandford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. High frequency of point mutations clustered within ATP-binding region in CML or Ph+AML patients who develop imanitib resistance //Blood. - 2002. - Vol. 99. - P. 3472-5.
20. Buckle A.M., Mottram R., Pierce A. et al. The effect of Bcr-Abl protein tyrosine kinase on maturation and proliferation of primitive haematopoietic cells // Mol.Med. - 2000. - Vol. 6(10). - P. 892-902.
21. ChervenickP.A., BoggsD.R. Granulocyte kinetics in CML // Ser.Heamatol. J. - 1968.- № 3. - P. 27-37.
22. Clarkson B., Strife A., Perez A. et al. Integration of molecular and bioljgical abnormalities in quest for selective treatment of CML // Leukemia & Limphoma. - 1993. - Vol. 11. - P. 81-100.
68
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ..
23. Clarkson B., Strife A. Linkage of proliferative maturational abnormalities in CML and relevance to treatment // Leukemia. - 1993. - Vol. 7. - P. 1683-721.
24. Coppo P., Bonnet M.L., Dusanter-Fourt I. et al. Constitutive and specific activation of STAT3 by BCR-ABL in embryonic stem cells // Oncogene. - 2003. - Vol. 22(26). - P. 4102-4110.
25. Cortez D., Kadlec L., Pendergast A.M. Structural and signaling requeirments for bcr-abl-mediated transformation and inhibition of apoptosis // Mol.cell. biology. - 1995. - 10. - P. 5531-41.
26. Dean P.N. A simplified method of DNA distribution analysis // Cell Tissue Kinet. - 1980. - Vol. 13 - P. 299-302.
27. Deininger M.W.N. et al. The molecular biology of chronic myeloid leukemia//Blood - 2000. - Vol. 96. - P. 3343-56.
28. Deininger M.W.N., Vieira S., Mendiola R. et al. BCR/ABL tyrosine kinase activity regulates the expression of multiple genes implicated in the pathogenesis of chronic myeloid leukemia // Cancer research. - 2000. - Vol. 60. - P. 2049-55.
29. Dublez L., Eymin B., Sordet O. et al. ABL delays apoptosis upstream of procaspase-3 activation //Blood. - 1998. -Vol. 91. - P. 2415-22.
30. Elias L., Greenderg P. Devergent pattern of marrow cell suspension culture in the myeloid leukemia: correlation of vitro findings with clinical features // Blood. -1977. - Vol. 50. - P. 263-74.
31. Era T., Witte O.N. Regulated expression of P210 Bcr-Abl during embryonic stem cell differentiation stimulates multipotential progenitor expansion and myeloid cell fate // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol. 97. - P. 1737-42.
32. Gesbert F., Griffin J.D. Bcr/Abl activates transcription of the Bcl-X gene through STAT5 // Blood. - 2000. - Vol. 96 -P. 2269-76.
33. GoldeD., ClineM. Human prsleukemia: identification a maturation defect in vitro//New EnglJMed -1973. - Vol. 288. - P. 1083-6.
34. Golde D. W., Byers L.A., Cline M.J. Chronic myelogeneous leukemia cell growth and maturation in liquid culture // Cancer Research. - 1974. - Vol. 34. - P. 419-23.
35. Goldman J.M., Th ’ng K.G., Catovsky D., Galton D.A.D. Production of colony stimulating factor by leukemic leukocytes / Blood. - 1976. -Vol. 47. - P. 381-8.
36. Guzman M.L., Jordan C.T. Considerations for targeting malignant stem cells in leukemia // Cancer Control. -2004. - Vol. 11(2) - P. 97-104.
37. Holyoake T.L., JiangX., Eaves, A.C., Eaves C.J. Elucidating critical mechanisms of deregulated stem cell turnover in the chronic phase of chronic myeloid leukemia // Leukemia. - 2002. - Vol. 16. - P. 549-58.
38. Holyoake T.L., JiangX., Jorgensen H.G. et al. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent nt growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3 // Blood. - 2001. - Vol. 97. - P. 720-8.
39. Jaiswal S., Traver D., Miyamoto T. et al. Expression of BCR/ABL and BCL-2 in myeloid progenitors leads to myeloid leukemias // Proc.Nat. Acad. Sci. USA. -2003. - Vol. 100. - P. 10002-7.
40. Jamieson C.H.M., Ailles L.E., Dylla S.J. et al. Granulocyte-macrophage progenitors as candidate leukemic stem cells in blast crisis CML // New England J. Medicine. - Vol. 354. - P. 657-67.
41. Lotem J., Sachs L. Control of apoptosis in hematopoiesis and leukemia by cytokines, tumor suppressor and oncogenes // Leukemia. - 1996. -Vol. 10. - P. 925-31.
42. Lugo T.G., Pendergast A.M., Muller A.J., Witte O.N. Tyrosine kinase activity and transformation potency of bcr-abl oncogene products // Science. - 1990. - Vol. 247. - P. 1079-82.
43. Melo J.V. The diversity of the BCR-ABL fusion proteins... // Blood. - 1996. - Vol. 88. - P. 2375-84.
44. Niwa H., Burdon T., Chambers I., Smith A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells via activation of STAT3 // Genes & Development. - 1998. - Vol. 12. - P. 2048-60.
45. Ogawa M., Fried J., Sakai Y. et al. Studies of cellular proliferation in human leukemia. V1.The proliferative activity, generation time, and emergence time of neutrophilic granulocytes in CML // Cancer. - 1970. - Vol. 25. - P. 1031-49.
46. Passegue E., Jamieson C.H.M., Ailles L.E., Weissman I.L. Normal and leukemic hematopoiesis: Are leukemia’s a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? // Proc.Nat.Acad. Sci. USA. - 2003. - Vol. 100. - P. 11842-9.
47. Perry S., Moxly J.H., Weiss G.H., ZelenM. Stadies of leukocyte kinetics by liquid scintillation counting in normal individuals and patients with chronic myeloid leukemia // J. Clinical Investigation, - 1966. - Vol. 45(9). - P. 1388-99.
48. Primo D., Flores J., Quijano S .et al. Impact of BCR/ABL gene expression on the proliferative rate of different subpopulations of haematopoietic cells in chronic myeloid leukaemia // Brit.J.Haematol. - 2006. - Vol. 135. - P. 43-51.
49. Satler M., Mohi M.G., Pride Y.B. et al. Critical role for Gab2 in transformation by bcr/abl // Cancer cell. - 2002. -Vol. 1. - P. 479-92.
50. Selleri C., Maciejewski J.P., Pane F. et al. Fas-mediated modulation of bcr/abl in CML results in differential effects on apoptosis // Blood. - 1998. - Vol. 92. - P. 981-9.
51. Sherbenou D. W., Hantschel O., Turaga L. et al. Characterization of bcr-abl deletion mutants CML patients // Leukemia. - 2008. -Vol. 22. -P. 1184-90.
52. Shuai K., Halpern J., ten Hoeve J. et al. Constitutive activation of STAT5 by the BCR/ABL oncogene in chronic myelogenous leukemia // Oncogene. - 1996. - Vol. 13(2). - P. 247-554.
53. Sillaber C., Gesbert F., Frank D.A. et al. STAT5 activation contributes to growth and viability in Bcr/Abltransformed cells // Blood. - 2000. - Vol. 95. - P. 2118-25.
54. Skipper H.E., Perry S. Kinetics of normal leukemic leukocyte population and relevance to chemotherapy // Cancer Res. - 1970. - Vol. 30. - P. 1883-97.
55. Stoklosa T., Poplawski T., Koptyra M. et al. Bcr/abl inhibits mismatch repair to protect from apoptosis and induce point mutations // Cancer Res. - 2008. - Vol. 68. - P. 2576-80.
56. Strife A., Lambek C., Wisniewski D. et al. Proliferative potential of subpopulation of granulocyte-macrophage progenitor cells in normal and CML patients // Blood. - 1983. - Vol. 62. - P. 389-97.
57. Strife A., Lambek C., Wisniewski. D. et al. Discordant maturation as the primary biological defect in CML. //Cancer Res. - 1988. - Vol. 48. - P. 1035-41.
58. Traycoff C.V., Haistead B., Rice S. et al. Chronic myelogenous leukaemia CD34+cells exit G0/G1 phases of cell cycle more rapidly than normal marrow CD34+cells // Brit. J. Hematology. - 1998. - Vol. 102. - P. 759-67.
59. Whang-Peng J., Perry S., Knutsen T.A., Gart J.J. Cell cycle characteristics, maturation and phagocytosis in vitro of blast cells from CML patients // Blood. - 1971. - Vol. 38. - P. 153-241.
