CC BY
213
УДК 575.1:616.15
Экспрессия генов при пролиферации и дифференцировке гемопоэтических клеток с Ph-хромосомой ex vivo
Н. И. Гринева*, Е. А. Духовенская, А. М. Тимофеев, Т. В. Ахлынина, Л. П. Герасимова,
Т. Е. Манакова, Т. В. Боровкова, Д. А. Шмаров, Т. Г. Сарычева, Н. М. Найденова,
А. Р. Гавричкова, Л. Ю. Колосова, Т. И. Колошейнова, Л. Г. Ковалева
Гематологический научный центр Минздравсоцразвития Российской Федерации, 125167,
Москва, Новый Зыковский пр., 4
*E-mail: nigrin27@mail.ru
Поступила в редакцию 29.08.2011 г.
РЕФЕРАТ Гены p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl, bcr, bcl2, bax, gapdh вовлечены в регуляцию пролиферации, дифференцировки, апоптоза и клеточного цикла ex vivo клеток хронического миелолейкоза, содержащих Ph-хромосому и онкоген bcr/abl. Экспрессия этих генов коррелирует с регуляцией чередованием этапов пролиферации и дифференцировки P^-клеток трех основных типов, встречающихся при хроническом миелолейкозе. Гены p53, p21, mdm2 и gapdh сверхэкспрессируются в активно пролиферирующих миело-идных клетках в фазах S и G2/M клеточного цикла и при совпадении этих фаз с этапом пролиферации. Экспрессия этих генов заметно снижается при чередовании пролиферации и созревания, а также на этапах созревания со значительным накоплением нейтрофилов, особенно при многократных чередованиях этапов. В ходе созревания нейтрофилов уровни экспрессии генов падают в ряду gapdh > actin > c-myc, bcr/abl, p21 > p53 > bcl2 > bax. Уровни экспрессии этих генов в нейтрофилах ниже, чем в миелоцитах, и на порядок ниже, чем в клетках с длительным этапом пролиферации. Экспрессия онкогена bcr/abl при длительном созревании и накоплении нейтрофилов ингибируется, а на этапе пролиферации с накоплением миелоцитов возрастает в 2-3 раза. Минимальная экспрессия bcr/abl наблюдается при сверхэкспрессии p53, mdm2, p21, c-myc и максимуме клеток в S- и 02/М-фазах. Сверхэкспрессия bcr/abl отмечена при низкой экспрессии генов p53, p21, mdm2. В P^-клетках при бластном кризе и в фазе акселерации хронического миелолейкоза с высокими индексами эффективности (P/D = 5-20) наблюдается сверхэкспрессия генов в ряду bcr > gapdh > bcr/abl и снижение экспрессии р53, bcl2, mdm2, р21<< gapdh. Низкий контроль пролиферации и клеточного цикла генами-регуляторами способствует, очевидно, сверхэкспрессии гена bcr/abl и активному образованию bcr/ab^-клеток. Апоптоз в P^-клетках индуцируется при экспрессии генов bax > bcl2, р53, p21, c-myc и gapdh. На этапе созревания ингибируется апоптоз, накапливаются нейтрофилы и уменьшается экспрессия генов p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА экспрессия генов, регуляция пролиферации и дифференцировки, клетки, содержащие Ph-хромосому, хронический миелолейкоз, ОТ-ПЦР, клеточный цикл, апоптоз.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ УЭГ - уровни экспрессии генов; ПДК - пролиферация и дифференцировка клеток; ХМЛ - хронический миелолейкоз; Ph - Филадельфийская хромосома; P^-клетки - гемопоэтические (кроветворные) клетки, содержащие Филадельфийскую хромосому; ПК - периферическая кровь; КМ - костный мозг; ЭТС - эмбриональная сыворотка теленка; ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией; нз - незрелые, делящиеся клетки; з - зрелые клетки, нейтрофилы.
ВВЕДЕНИЕ
Хромосомные аномалии,транслокации, инверсии, делеции и многочисленные мутации приводят к развитию большинства лейкозов ([1-5] и ссылки там). В результате хромосомной транслокации 1(9;22)-^34^11), возникшей в гемопоэтической (кроветворной) полипотентной стволовой клетке, образуется Филадельфийская хромосома (РЦ, которая приво-
дит к хроническому миелолейкозу (ХМЛ), острому и хроническому лимфолейкозам. В клетках с Р^ хромосомой (Р^-клетках) в результате реципрок-ной транслокации 5'-фрагмента гена Ьсг и 3'-фраг-мента гена аЪ1 образуется химерный онкоген Ъcr/aЫ, кодирующий активную тирозинкиназу р210/р185, которая участвует в патогенезе ХМЛ. Транслокация приводит к замещению нормальных гемопоэтических
клеток P^-клетками. В клеточные и молекулярные механизмы патогенеза ХМЛ вовлечены многие гены: bcl2, ряд генов stat и гены, регулирующие клеточный цикл и апоптоз [1-57].
Способность онкогена bcr/abl определять туморогенные свойства, повышать жизнеспособность, активировать пролиферацию и блокировать апоп-тоз в линиях Ph+-клеток изучалась детально [9-7, 42-57]. Обнаружено, что тирозинкиназа р210 bcr/ abl может как подавлять апоптоз, так и не влиять на него. Данные о блокировании апоптоза при ХМЛ остаются противоречивыми [1-5, 42, 44, 45, 47 и наши неопубликованные данные]. Роль апоптоза при пролиферации и дифференцировке Ph+-клеток ранее не изучали. Наши последние исследования показывают, что апоптоз зависит от этапов пролиферации и созревания, а также от типа Ph+-клеток, выделяемых из костного мозга (КМ) и периферической крови (ПК) при ХМЛ [Гринева и др., неопубликованные данные].
Пролиферация и дифференцировка ex vivo трех основных типов Ph+-клеток регулируется при чередовании этапов пролиферации этих клеток (этап 1) и созревания нейтрофилов (этап 2). На этапе 1 скорость пролиферации превышает скорость созревания. На этапе 2, напротив, выше скорость созревания. Чередование этапов и их скоростей поддерживает эффективность пролиферации и дифференцировки Ph+-клеток на оптимальном уровне [1-4] и определяет волновой характер регуляции этих процессов.
Цель нашей работы состояла в выяснении роли экспрессии генов, регулирующих пролиферацию и дифференцировку, апоптоз и клеточный цикл нормальных гемопоэтических клеток, в регуляции этих процессов в P^-клетках. Мы изучали кинетику экспрессии генов p53, c-myc, bcr/abl, mdm2, p21, bcl2, bax, bcr, а также генов gapdh и actin в качестве контрольных, и сопоставляли ряды кинетических кривых и закономерности ex vivo пролиферации, диф-ференцировки, апоптоза и распределения в фазах клеточного цикла Ph+-клеток, полученных от больных ХМЛ.
Ph+-клетки ХМЛ, состоящие на 90% из гранулоци-тов, примечательны способностью совершать полный цикл пролиферации и дифференцировки подобно нормальным миелоидным клеткам, которых в пуле кроветворных клеток на порядок меньше. Это облегчает изучение закономерностей регуляции пролиферации и дифференцировки и их экстраполяцию на нормальные гемопоэтические клетки.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Использованные материалы: гепарин («Flow», Англия); Limphoprep, среда а-МЕМ («MP Biomedical»,
США); DEPC, HEPES, Трис, эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС), цитрат Na, лаурилсаркозил («ICN», США); краситель трипановый синий, L-глутамин и 2-меркаптоэтанол («Serva», Германия); Триреагент, гуанидинтиоцианат («Sigma», США); RQ1 ДНКаза, свободная от РНКаз, РНКазин, dNTP, бычий сывороточный альбумин (BSA), Taq-полимераза, буфер для обратной транскрипции, обратная транскрипта-за MuMLV («Promega», США); пенициллин и стрептомицин (ОАО «Биохимик», Саранск, Россия); PBS (10 мМ фосфатный буфер + 0.13 М NaCl + 2.7 мМ KCl, pH 7.4) таблетированный (НПО «Эко-сервис», Россия).
Олигонуклеотидные праймеры (таблица) синтезированы и очищены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) или HPLc фирмой «Синтол» (Москва).
Исследовали Ph+-мононуклеары, выделенные из ПК и КМ больных ХМЛ в хронической фазе до и в процессе лечения, в фазе акселерации и бласт-ного криза. При ХМЛ мононуклеары представлены в основном лейкоцитами и гранулоцитами, поэтому именно эти клетки здесь изучались. Характеристики Ph+-клеток и больных ХМЛ, из ПК и КМ которых выделены мононуклеары, приведены в [2-5]. Типы мРНК bcr/abl: b3a2, b2a2 или e1a2 в Ph+^летках определены с помощью ОТ-ПЦР [2, 5].
Методы выделения мононуклеаров, анализа пролиферации и дифференцировки Ph+^леток описаны ранее [1-6]. Суспензию (0.8 —12) х 106 клеток/мл в среде а-МЕМ, содержащей 10 — 20% ЭТС, 2 мМ L-глутамина, 10-4 М 2-меркаптоэтанола, 100 ед./мл пенициллина и 50 ед./мл стрептомицина, 25 мМ HEPES-NaOH pH 7.2—7.4, культивировали в строго одинаковых условиях, и отбирали пробы для анализа.
Степень апоптоза и распределение культивируемых Ph+-клеток по фазам клеточного цикла анализировали цитофлуориметрически [1—4] в гранулоци-тарном гейте с помощью проточного флуориметра EPICS-XL. Пробы Ph+-клеток (по 5000 клеток), выделенные из КМ и ПК в градиенте плотности фиколла, и пробы, отобранные в процессе культивирования, центрифугировали в течение 7 мин при 600 g и 4оС, промывали PBS и по каплям фиксировали охлажденным 70% этанолом в течение 30 мин при 4оС. Перед измерением взвесь клеток промывали PBS, центрифугировали и инкубировали осадок в 0.5 мл PBS, содержащего пропидий йодид (5 мкг/мл) и РНКазу А (50 мкг/мл), в течение 30 мин при комнатой температуре в темноте. Измерения проводили в проточном флуориметре EPIcS-XL. Клетки гранулоцитарно-го гейта анализировали с помощью прямого (FSC) и бокового (SSc) светорассеяния, одновременно ре-
гистрировали флуоресценцию пика FL2 по амплитуде и площади импульса (это позволяло «отсекать» слипшиеся клетки, конгломераты и обрывки клеток) в линейном и логарифмическом масштабе, определяли клетки, находящиеся в апоптозе. К клеткам, вошедшим в апоптоз, относили частицы FL2-H с ги-подиплоидным набором ДНК, которые формировали пик слева от пика клеток с диплоидным набором ДНК (уменьшение размера клеток не превышало двух порядков). Долю гранулоцитов, находящихся в апоптозе, анализировали в гранулоцитарном гейте, где отсутствуют обрывки клеток. Получали ДНК-гистограммы Ph+-клеток, в тех же пробах анализировали распределение по фазам клеточного цикла (S, G2/M) при помощи компьютерной программы (SFIT-метод) [7, 10].
Для выделения клеточной РНК использовали пробы, содержащие 106 клеток. Каждую пробу лизирова-ли гуанидинизоцианатом согласно [11] с небольшими модификациями [5].
Обработку проб ДНКазой проводили согласно [5]. РНК, выделенную из пробы (106 клеток), отжигали с 50 нг смеси гексамеров в 8 мкл воды (70оС, 10 мин). кДНК синтезировали в течение 1 ч при 37оС в 25 мкл буферного раствора для обратной транскрипции («Promega»), содержащего по 2.5 мкМ каждого из dNTP, 20 ед. акт. РНКазина («Promega»), 20 ед. акт. обратной транскриптазы MuMLV («Promega»). Раствор кДНК хранили при —70°С и быстро использовали для проведения ПЦР.
Транскрипцию генов p53, c-myc, bcr/abl, mdm2, p21, bcl2, bax, bcr и контрольных генов gapdh и actin анализировали методом ОТ-ПЦР. ОТ-ПЦР проводили со специфическими праймерами на РНК, выделенной из каждой пробы (таблица), в один или два раунда.
ПЦР проводили в 25 мкл раствора, содержащего буфер для ПЦР (50 мМ Трис-HCl pH 8.9, 16 мМ (NH ) SO , 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 50 мкМ EDTA,
0.14 мг/мл BSA), 2—5 мкл раствора кДНК, 200 мкM каждого из dNTP, 2.5 ед. акт. Taq-полимеразы («Promega») и 75 нг каждого праймера (таблица). ПЦР (30 циклов) проводили по следующей схеме: денатурация — 1 мин, 94°С; отжиг — 1 мин, 56оС для 1-го и 60°С для 2-го раунда; синтез — 3 мин, 72oC. Отжиг проб кДНК генов bcr, p53, mdm2 и bcr/abl проводили при 56oC для внешних праймеров и 60oC для внутренних (таблица). Продукты ПЦР анализировали при помощи электрофореза в 6% ПААГ. Гели окрашивали бромидом этидия (1 мкг/мл). Интенсивность флуоресценции амплифицированных фрагментов в данное время (Jt) определяли компьютерной денситометрией с помощью программы «Scion Image», учитывая объемы проб для ОТ-ПЦР и электрофореза.
Об экспрессии генов судили по результатам ОТ-ПЦР, проведенной на суммарной РНК Ph+-клеток с праймерами, приведенными в таблице. Уровень экспрессии мРНК оценивали по интенсивности флуоресценции (Jt) полос, соответствующих продуктам амплификации кДНК. В качестве внутреннего стандарта использовали уровень экспрессии мРНК gapdh и/или actin в той же пробе.
Экспрессию изоформ мРНК bax [9] анализировали с использованием праймеров для амплификации продуктов альтернативного сплайсинга РНК ин-трона 1 (таблица), накопление ПЦР-фрагмента которого коррелирует с ожидаемой экспрессией bax, bcl2 и других генов, а также с кинетикой апоптоза (рис. 1—9).
Кинетические кривые экспрессии генов, пролиферации, дифференцировки, апоптоза и распределения P^-клеток по фазам клеточного цикла представляли в полиномиальной аппроксимации. По изменению интенсивности флуоресценции (Jt) судили о положении пиков экспрессии РНК и их максимумов, по Jt/Jgapdh оценивали относительные уровни экспрессии мРНК. Это предполагает возможность сопоставления с результатами точечных измерений уровней экспрессии, широко применяемых в других исследованиях.
Для обработки кривых экспрессии генов, пролиферации и дифференцировки клеток применяли полиномиальную аппроксимацию шестой степени на том основании, что кривые имеют волнообразный характер с несколькими максимумами и минимумами и не подчиняются логарифмической и экспоненциальной зависимостям. При этом учитывали следующие возможности и ограничения полиномиальной аппроксимации. Оптимальное число обобщаемых данных равно степени аппроксимации минус единица. Аппроксимацию принимали достоверной на основании точности экспериментальных данных ± 10%, приведенной в работах [1—6] (R2 > 0.81 — 1). Превышение числа аппроксимируемых точек над показателем степени аппроксимации возможно на один-два пункта. Особое значение в характеристике кинетических кривых имеют точки первого периода роста (пять—восемь точек в наших опытах для отрезка времени 8—10 сут). Отбор проб через 1 сут при ПДК ex vivo соответствует ожидаемому времени развития клеточного цикла животных клеток in vivo, близкому к 1 сут. Пропуск одной-двух точек на вершине пика при известной кинетике (вычисляется и прогнозируется компьютерной программой по началу пика) позволяет построить кинетическую кривую в целом.
Для построения кинетических кривых пролиферации и дифференцировки P^-гранулоцитов и их субпопуляций: миелоидных клеток (бластов, про-
Олигонуклеотидные праймеры для ОТ-ПЦР
мРНК, мишень Праймеры, последовательность 5' ^ 3', GenBank Acc.no Фрагмент, п.н.
Внешние, отжиг при 56оС, первый раунд Внутренние, отжиг при 60оС, второй раунд
bcr/abl b3a2, b2a2 TGGATGAACTGGAGGCAG NM 005157 (342-361 bp, 20b) TCA CAG GCG TGA TGT AGT T NM 007313 (835-854 bp, 20b) NM_004327 (2896-2913 bp, 22b) (90% гомология) GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC ЫМ 004327 (3227-3248 Ьр, 22Ь) GCTTCACACCATTCCCCATT ЫМ 007313 (3477-3496 Ьр, 20Ь) ЫМ_005157 (289-308 Ьр, 20Ь) 378 b3a2, 303 b2a2
bcr TGGATGAACTGGAGGCAG NM 004327 (2896-2913 bp, 22b) CAGTTTGGCTCAGCTGTGTCCC NM_004327 (3448-3469 bp, 22b) GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC. ЫМ 004327 (3227-3248 Ьр, 22Ь) CAGTGGCTGAGTGGACGATGA ЫМ_004327 (3340-3360 Ьр, 21Ь) 134
mdm2 ATGTGCAATACCAACATGTC NM 002392 (297-317 bp, 20b) TAGGGGAAATAAGTTAGCAC NM 002392 (1470-1492 bp, 20b) CAAGAACTCTCAGATGAAGATG ЫМ 002392 (1092-1114 Ьр, 22Ь) TTGATGGCTGAGAATAGTCTTC ЫМ 002392 (1470-1492 Ьр, 22Ь) 401
p53 ATTGGCAGCCAGACTGCCTT NM 000546 (219-238 bp, 20b) GGAACAAGAAGTGGAGAATG NM_000546 (1434-1453 bp, 20b) AGCTACTCCCCTGCCCTCAA ЫМ 000546 (624-643 Ьр, 20Ь) GTCTTCCAGTGTGATGATGG ЫМ_000546 (1009-1028 Ьр, 20Ь) 405
gapdh GCTTGTCATCAATGGAAATC NM 002046 (300-319bp, 20b) CACGATACCAAAGTTGTCATG NM_002046 (595-615 bp, 21b) 316
bcl2 TGTGGAACTGTACGGCCCCAGCATGC ЫМ 000633 (1087-1113 Ьр, 27Ь) GCCTGCAGCTTTGTTTCATGGTACATC ЫМ 000633 (1286-1312 Ьр, 27Ь) 226
bax CATCAGGGACTCAGTTGT ЫС 000019 (522-540 Ьр, 19Ь) СAСTССTСAAATСTGTGССA ЫС_000019 (764-783 Ьр, 20Ь) 262
p21 GССGGAGСTGGGСGСGGATT ЫМ 07846(42-61 Ьр, 20Ь) GGСTTССTСTTGGAGAAGAT ЫМ_07846 (707-726 Ьр, 20Ь) 685
actin, beta (ACTB) GСGGGAAATСGTGСGTGAСATT M10277complete СDS (2280-2301 Ьр, 22Ь) GATGGAGGTTGAAGGTAGTTTСGTG М10277 complete СDS (2583-2606 Ьр, 24Ь) 327
c-myc GAGGCTATTCTGCCCATTTG NM 002467 (440-459 bp, 20b) GGCAGCAGCTCGAATTTCTT NM 002467 (721-740 bp, 20b) 301
миелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов, сегментоядерных и палочкоядерных нейтрофилов) использовали морфологический анализ. Состав клеток анализировали на мазках (в трех зонах каждого мазка по 100 клеток в каждой). Концентрацию субпопуляций клеток в пробах вычисляли по их содержанию на мазках в пересчете на 106 клеток/мл исходной суспензии [1-6].
Кинетические кривые индексов эффективности (P/D, соотношение скоростей пролиферации и созревания нейтрофилов) получали как соотношение накопления незрелых, пролиферирующих клеток, P (бласты, промиелоциты, миелоциты), и накопления созревающих без деления нейтрофилов, зрелых клеток, D (метамиелоциты, палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы) согласно [1—4].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Кинетические кривые уровней экспрессии генов (УЭГ) р53, р21, с-тус, Ъст/аЫ, mdm2, Ьс12, Ьах, Ъст, участвующих в регуляции клеточного цикла [14, 24, 28, 45-48, 52, 58, 59], апоптоза [3, 14, 16-22, 28, 42, 47, 49, 50, 56, 58, 60], пролиферации и дифференцировки получали при культивировании Р^-клеток (моно-нуклеаров), состоящих на 95% из миелоидных Р^-клеток, т.е. при миелопоэзе, изменяющемся при ХМЛ [1-3, 24, 26-28, 42, 43, 46, 48, 51-54, 57-68].
Кинетические кривые экспрессии генов с-тус, р53, Ъсг/аЪ1, mdm2, р21, Ъс12, Ьах, gapdh, асЫп, Ъсг сопоставили с кинетическими кривыми регуляции пролиферации и дифференцировки миелоидных Р^-клеток трех основных типов, их апоптоза и распределения в фазах клеточного цикла. Кривые УЭГ и ПДК получены из одной пробы для каждой точки.
Уровни экспрессии мРНК оценивали по интенсивности флуоресценции (Л) соответствующих продуктов О^ПЦР исследуемых генов. Гены gapdh и асЫп использовали в качестве контрольных. По величине Л определяли изменения экспрессии генов и положение ее пиков. По величине Jt/Jgapdh судили о соотношении экспрессии генов, но положение пиков, их максимумов и минимумов заметно изменяются вследствие изменений в экспрессии gapdh. Ранее изменения в уровне экспрессии gapdh наблюдали и другие исследователи [55, 56].
Кинетические кривые экспрессии генов сопоставляли с закономерностями пролиферации и диффе-ренцировки субпопуляций гранулоцитов, апоптоза и распределения Р^-клеток в фазах клеточного цикла при чередовании этапов пролиферации и созревания, регулирующих эффективность этих процессов (индекс Р/Б) [1-4] и представленных в полиномиальной аппроксимации. Закономерности регуляции пролиферации и дифференцировки Р^-клеток изучены ранее [1-6], но здесь они рассмотрены в полиномиальной аппроксимации, так как не подчиняются логарифмической и экспоненциальной зависимости, и кинетические кривые этих закономерностей имеют несколько максимумов и минимумов (рис. 1-9).
Закономерности распределения клеток по фазам клеточного цикла, уровень апоптоза и индексы эффективности Р/Б, согласно [1-4], различаются у Р^-клеток трех типов, полученных от больных ХМЛ. Типы клеток, их пролиферация и дифференцировка различаются последовательностью чередования этих этапов, их числом и длительностью. Предположение, что экспрессия генов отражает особенности регуляции пролиферации и дифференцировки Р^-клеток трех типов, их апоптоза и распределения в фазах клеточного цикла, находит подтверждение в данной работе.
Экспрессия генов при пролиферации и дифференцировке P^-клеток типа 1
Ph+^летки типа 1 характеризуются продолжительным этапом пролиферации (этап 1), скорость которого выше скорости созревания, концентрация незрелых клеток длительно превышает концентрацию зрелых клеток, а индекс P/D1 > 1 — 20. Эти клетки отличаются повышенным накоплением миелоцитов, промиелоцитов, бластов при низком накоплении созревающих без деления нейтрофилов и их активном апоптозе [1—3].
На рис. 1А—З представлены кинетические кривые экспрессии генов, пролиферации и дифференцировки Ph+-клеток типа 1 из КМ и ПК больных ХМЛ с умеренным пролиферативным потенциалом и индексом P/D = 1—5. Видно, что пики с максимальной и минимальной экспрессией генов в клетках КМ группируются в трех зонах. По величине пиков экспрессию генов в этих зонах можно подразделить на активную и умеренно активную. Активная экспрессия генов bcl2 и bax видна в первой зоне (на 1—2 сут). Во второй зоне в интервале 2—7 сут виден широкий пик сверхэкспрессии p53, mdm2 и p21 с максимумом на 3—5 сут (рис. 1А,Б, клетки КМ). Максимальная экспрессия генов p21, mdm2, p53, actin, gapdh, c-myc снижается в разной степени в том же ряду, достигая своего минимума на 8—9 сут. В 2-й зоне менее активно экспрессируются гены c-myc, bcr/abl, gapdh, actin, bcr. Все гены, кроме bcr/abl, имеют два минимума экспрессии — на 1 — 2 и 8—9 сут. В Ph+^летках из ПК гены р53, р21, mdm2, c-myc, bax, bcl2 сверхэкспрес-сируются сходным образом, но пики экспрессии р21, mdm2, c-myc и gapdh заметно уже (рис. 1Д,Е).
При пролиферации и дифференцировке клеток сверхэкспрессия генов р21, mdm2 и р53 достигает своего максимума в соответствии с распределением клеток в фазах S и G2/M, т.е. происходит в активно пролиферирующих миелоидных клетках-предшественниках. К концу цикла пролиферации и дифференцировки с гибелью клеток на 6 — 7 сут (рис. 1В,Ж) экспрессия этих генов несколько снижается, а затем вновь возрастает на 7—8 сут. Экспрессия генов c-myc, bcr/abl и gapdh при этом становится более умеренной. При этом концентрация пролиферирующих — незрелых — клеток значительно больше концентрации нейтрофилов (зрелых). На всем протяжении пролиферации и дифференцировки скорость накопления пролиферирующих клеток превышает скорость накопления созревающих нейтрофилов, и все клетки имеют общий максимум экспрессии генов при высоком содержании незрелых клеток и весьма низком — нейтрофилов.
Активная экспрессия генов p53, mdm2, p21 (в меньшей степени c-myc) коррелирует с изменени-
ями концентрации клеток, регуляцией цикла, а также с изменениями апоптоза клеток на 3-4 и 7-10 сут (рис. 1A-3). Сверхэкспрессию p21, p53, mdm2, умеренную и низкую экспрессию остальных генов (ac-tin, c-myc, gapdh, bcr и bcr/abl) в P^-клетках из КМ следует отнести к экспрессии генов клеток пролиферативного пула, которые активно накапливаются в G1- и S-фазах клеточного цикла на 3-4 сут. За это время, по-видимому, протекает G1-фаза с синтезом циклинов и киназ, формированием их ансамблей и фосфорилированием белка Rb, что происходит с участием р21 и белков, отвечающих за прохождение контрольных точек G^S-перехода [23, 24, 58, 64, 67-71]. Наблюдаемая при этом сверхэкспрессия р53 означает, что р53 выполняет свои функции в полном объеме: регулирует транскрипцию, клеточный цикл и его контрольные точки, дифференцировку и апоп-тоз [10-16].
Максимальный апоптоз клеток из костного мозга наблюдается на 4 сут (~30%), а далее лишь немного уменьшается. Минимальный апоптоз выявляется на 1 сут после быстрого уменьшения его доли вначале. В клетках из периферической крови апоп-тоз более интенсивен - с двумя максимумами УЭГ на 1 и 5-6 сут и с минимумом на 2-3 сут (рис. 1,З), что не согласуется с УЭГ bcl2 и bax, отвечающих за апоптоз [13, 14, 16-22]. Экспрессия bcl2, bax в клетках КМ характеризуется двумя пиками с максимумами на 2 сут и минимумом на 4-5 сут, что не соответствует максимумам апоптоза в клетках из КМ и ПК (рис. 1Г,З). Стимулировать апоптоз, как известно, могут также активно экспрессирующиеся гены p21, p53, gapdh, c-myc [10-28, 32, 34, 49-51, 55, 56, 67-69]. Белок р21 является ингибитором циклин-зависимых киназ и медиатором ряда функций р53. Экспрессия р21 отвечает за задержку роста клеток в фазе G1, регуляцию клеточного цикла и апоптоз [23-28, 64, 67, 68, 71]. Если при сверхэкспрессии р21 рост клеток в фазе G1 не задерживается, то дополнительные молекулы р21 индуцируют апоптоз и/или терминацию дифференцировки [24, 64, 68]. Активация апоптоза в ответ на экспрессию р21 происходит здесь на 4 сут при отсутствии в это время экспрессии bcl2 и bax (рис. 1A-Г).
Уровень апоптоза в P^-клетках ПК во втором пике с максимумом на 5-6 сут существенно выше, чем в клетках из КМ (рис. 1Г,З). Сравнивая УЭГ (рис. 1), можно отметить сходство в характере экспрессии генов р53, bcl2, bax в клетках КМ и ПК, и более узкий пик экспрессии в клетках ПК. Однако в клетках КМ активация экспрессии генов bax > bcl2 с максимумами на 5-6 сут отсутствует и не соответствует второму пику апоптоза, который наблюдается на 4 сут. Предполагается, что в регуляции этого
пика в клетках КМ участвует р21 , который, согласно [28, 57, 60], регулирует апоптоз. В клетках ПК в это время сверхэкспрессируется также gapdh (максимум экспрессии на 4—6 сут). Экспрессия gapdh в Ph+-клетках КМ возрастает в несколько раз, как и апоп-тоз (рис. 1Г,З).
Сверхэкспрессия mdm2 связана с функциями этого фактора транскрипции, модулирующего свойства многих генов и взаимодействующего с различными факторами роста и факторами транскрипции. Белки mdm2 и р53 взаимодействуют между собой и негативно регулируют экспрессию друг друга [29—36]. Сверхэкспрессия mdm2 модулирует, вероятно, функции р53 и р21, регулирует длительность S- и G2/M-фаз клеточного цикла и повышает пролиферативный потенциал Ph+-клеток при слабой экспрессии гена bcr/abl.
Супрессор опухолевого роста р53, активируемый при генотоксическом и клеточном стрессе, защищает нестабильные клетки с помощью экспрессии генов, инициирующих клеточный цикл с торможением пролиферации, арестом апоптоза и репарацией ДНК. При этом р53 и mdm2 взаимно активируют друг друга, одновременно стабилизируются и подвергаются деградации. Активация стрессом по механизму обратной связи ведет к активации р53 и mdm2 [31—36] и защите клеток от гибели. О взаимодействии р53 и mdm2 можно судить по совпадению их кинетических кривых (рис. 1А,Б,Д) с максимумом накопления клеток в S- и G2/M-фазах. Сверхэкспрессию mdm2 можно связать с активацией отложенного перехода клеток в S- и G2 /M-фазы клеточного цикла на 4—6 сут (рис. 1Г,З). Известно, что mdm2 стимулирует неконтролируемый переход клеток в S-фазу [29]. Кроме того, сверхэкспрессия mdm2, непосредственно взаимодействующего с промоторами р53 и р21, приводит к неконтролируемому выходу клеток в S-фазу и к их трансформации [24, 29—31, 67, 68, 71].
Известно, что пролиферация Ph+-клеток активируется экспрессией bcr/abl [43—48]. В данной работе P^-клетки из КМ и ПК характеризовались очень низкой экспрессией bcr/abl, существенно меньшей, чем р53, mdm2, p21 и c-myc. Довольно низкие уровни экспрессии bcr/abl находятся в зоне максимальной экспрессии генов р53, mdm2, p21 и даже c-myc на 3—10 сут, что соответствует значениям эффективности пролиферации и дифференцировки, невысоким для P^-клеток типа 1 (индексы P/D = 1.2—1.8—0.8). Экспрессия bcr/abl в клетках ПК несколько выше, чем в клетках КМ. В клетках из ПК отмечается максимум — на 5 сут и два минимума — на 1 и 9 сут. В клетках из КМ экспрессия bcr/abl медленно увеличивается к 4—10 сут. Эти различия не отражаются в индексах P/D, которые указывают на сопоставимые скорости
Экспрессия генов Jt, КМ
Экспрессия генов
Jt/Jgapdh, КМ
Пролиферация и дифференцировка
Апоптоз и распределение клеток в фазах
Д
•100
2 4 8 10
Время, сут
Экспрессия Jt, ПК
2 4 ' 8 8 10
Время, сут
Jt / Jgapdh, ПК
4 6 8
Время, сут
♦ mdm2
+ gapdh
A bcl2
■ c-myc
Полиномиальный (p21)
Полиномиальный (bax)
Полиномиальный (bcr/abl)
p53
p21
bcr
- Полиномиальный (mdm2) =
- Полиномиальный (gapdh) *
- Полиномиальный (bcl2) Полиномиальный (actin)
Ж 18 15 12 09 0.6 03 0
Пролиферация и дифференцировка P^-клеток, ПК
Апоптоз и распределение клеток в фазах клеточного цикла, ПК
actin
bcr/abl
bax
Полиномиальный (p53) Полиномиальный (c-myc) Полиномиальный (bcr)
2 4 6 8 10
Время, сут
Незрелые
Миелоциты
Зрелые
Сегментоядерные P/D (н/з)
Полиномиальный (P/D (н/з)) Полиномиальный (незрелые) Полиномиальный (миелоциты) Полиномиальный (зрелые) Полиномиальный (сегментоядерные)
2 4 6
Время, сут
G2/M
S+G2/M
Апоптоз
S
Полиномиальный (S+G2/M) Полиномиальный (S) Полиномиальный (апоптоз) Полиномиальный (G2/M)
А
Б
В
Г
З
Е
Рис. 1. Экспрессия генов p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl, bcr, bcl2, bax, gapdh, actin (А, Б, Д, Е) в Ph+-клетках с умеренными пролиферативным потенциалом (индексами P/D) и длительностью пролиферации. Сравнение уровней экспрессии этих генов с кинетическими кривыми пролиферации и дифференцировки Ph+^леток (В, Ж), уровнем апоптоза и распределением клеток в фазах клеточного цикла (Г, З). Измерения кинетических кривых выполнены в каждой пробе из 106 Ph+^леток, выделенных из костного мозга (КМ) (А—Г) и периферической крови (ПК) (Д—З). Уровни экспрессии генов (в условных единицах флуоресценции, Jt) (А, Д) определяли с использованием ОТ-ПЦР на суммарной РНК из 106 клеток и Jt/Jgapdh (Б, Е). Этап пролиферации, концентрация незрелых > зрелых ([нз] > [з]) и индекс P/D = 1.2—1.8 на 0-10 сут. Полиномиальная аппроксимация шестой степени.
пролиферации и созревания в клетках из КМ и ПК. По-видимому, низкую экспрессию Ъсг/аЪ1 при высоком содержании клеток в S- и G2 /М-фазах можно объяснить подавлением Ъст/аЫ при сверхэкспрессии генов р53, р21, mdm2, с-тус - основных регуляторов клеточного цикла [10-16, 23-28, 31-36, 51-54, 67, 68]. Экспрессия этих генов необходима также для пролиферации миелоидных клеток и терминации их диффе-ренцировки. Возможно, снижение уровня экспрессии согласуется с понижением концентрации незрелых делящихся клеток.
Видно, что в Ph+-клетках из ПК гены экспрессируются более узким пиком, чем в Ph+-клетках из КМ (рис. 1Д-З). В клетках из ПК и КМ экспрессия р53, bcl2, bax начинается сразу и протекает сходным образом, достигая максимума на 2 и 9 сут (bcl2, bax) и на 5 сут (р53). В клетках из ПК гены p21, mdm2, c-myc экспрессируются с задержкой на 3 сут и с максимальным уровнем на 5-6 сут. Затем их экспрессия быстро снижается при более высоком пике апопто-за, чем в клетках из КМ (рис. 1Г,З). Видно, что максимум экспрессии генов p21, р53, mdm2 и c-myc
Экспрессия генов клеток из ПК
Экспрессия генов
Jt/Jgapdh, ПК
ПД клеток из ПК
gеpdh Ьсг/еЫ Ьсг/еЬ1
I р53 ♦ Ьсг • р53
»- mdm2 4 Ьс12 * Ьсг
Полиномиальный (gеpdh) Полиномиальный (Ьсг) ““ Полиномиальный (Ьсг)
Полиномиальный (Ьсг/еЬ1) — Полиномиальный (р53) -^= Полиномиальный (р53)
Полиномиальный (mdm2) — Полиномиальный (Ьс12) Полиномиальный (Ьсг/еЬ1)
gapdh
mdm2
bcl2
Время, сут
Q> Незрелые • Бласты 4 Зрелые
Полиномиальный (gapdh) _ „
г ' Полиномиальный (P/D)
-Полиномиальный (миелоциты)
Полиномиальный (bcl2) Полиномиальный (mdm2)
а Миелоциты * Промиелоциты
■ P/D
—Полиномиальный (незрелые) ^—Полиномиальный (зрелые)
-Полиномиальный (промиелоциты) —Полиномиальный (бласты)
А
Б
В
Рис. 2. Экспрессия генов в Ph+-клетках ПК типа 1 с высоким пролиферативным потенциалом, длительной пролиферацией и индексом P/D = 5-12. Кинетические кривые уровней экспрессии генов (УЭГ) p53, mdm2, bcr/abl, bcr, bcl2, gapdh (А, Б), а также пролиферации и дифференцировки (В). Условия обработки проб как на рис. 1. Уровни экспрессии генов по ОТ-ПЦР Jt (А) и Jt/Jgapdh (Б). Продолжительность этапа пролиферации при [нз] > [з] равна 14 сут. Здесь и далее обозначения как на рис. 1.
по отдельности соответствует максимальному числу клеток из КМ и ПК в S- и G2/M-фазах (рис. 1Г,З). По-видимому, клетки из ПК синхронизированы в большей степени, чем клетки из КМ.
По соотношению Jt/Jgapdh (рис. 1Б) можно предположить, что экспрессия генов, связанных с пролиферацией клеток из КМ, падает в ряду: mdm2 ~ р21 ~ р53 > асЫп ~ с-тус > gapdh ~ Ьст/аЫ ~ Ьст. На максимуме пиков УЭГ в клетках КМ уменьшаются в 4.5 раза по сравнению с gapdh. В клетках из ПК сверхэкспрессия gapdh сочетается с резким снижением уровней экспрессии других генов, поэтому сравнение в координатах Jt /Jgapdh оказывается здесь бессмысленным.
На рис. 1 видно, что экспрессия ряда генов (в том числе Ьст/аЫ) коррелирует с закономерностями пролиферации и дифференцировки, апоптоза и распределения Р^-клеток по фазам клеточного цикла. Корреляция между максимальным накоплением пролиферирующих и дифференцирующихся клеток и экспрессией генов означает, что гены р21, mdm2, р53, с-тус, Ьст, Ьс12 и Ьах участвуют в регуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза Р^-клеток типа
1. Однако «привязать» экспрессию этих генов к различным видам клеток типа 1 нельзя - они продуцируются общим пиком с одновременным максимумом.
На примере P^-клеток типа 1, выделенных из ПК больного ХМЛ во время бластного криза (рис. 2), можно видеть сверхэкспрессию генов bcr > gapdh > bcr/abl с двумя максимумами на 1 и 7-10 сут при минимуме на 4-5 сут. Эти клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом (индекс эффективности P/D = 2-12) и значительным содержанием клеток CD34+ [6]. Широкому пику пролиферации и дифференцировки с максимумом пика бластных клеток на 1-3 сут соответствует весьма умеренная экспрессия р53, mdm2, bcl2 с максимумами на 0.5, 6 и 9 сут и минимумами на 2-4 и 11 сут. При этом концентрация незрелых клеток значительно больше, чем миелоцитов. К 5-8 сут пик незрелых клеток возрастает, однако он уже состоит в основном из миелоцитов. При этом уровень экспрессии гена bcr увеличивается, а bcr/abl падает (рис. 2А-В).
Высокие уровни экспрессии bcr/abl (рис. 2А,Б) с двумя максимумами соответствуют профилю индексов P/D, накоплению бластов и миелоцитов в процессе пролиферации и дифференцировки (рис. 2В). Они также отражают начало циклов 1 и 2 пролиферации и дифференцировки с экспрессией генов в ранних миелоидных клетках-предшественниках [6].
Таким образом, пик индекса P/D на 1 сут и распределение экспрессии генов в ряду
gapdh ~ bcr/abl > bcr >> p53 ~ mdm2 > bcl2 относятся в основном к бластным клеткам (миелоидные клетки-предшественники, примерно на 75% состоящие из бластов и промиелоцитов). Видно, что уровень экспрессии генов р53, mdm2 и bcl2 в 5 раз ниже, чем у генов bcr/abl и gapdh. Возможно, при сверхэкспрессии bcr/abl и gapdh ингибируются гены р53, mdm2 и bcl2, или же снижение экспрессии генов р53 и mdm2 ведет к бесконтрольному делению Ph+-клеток.
Пик пролиферации и дифференцировки незрелых пролиферирующих клеток на 7 сут состоит в основном из миелоцитов, и экспрессия генов в ряду bcr >> gapdh >> p53 > bcl2 ~ mdm2 > bcr/abl на 4-6 сут также определяется миелоцитами. Экспрессия генов в миелоцитах и нейтрофилах далее также уменьшается, что согласуется с низкой экспрессией многих белков и факторов роста в нейтрофилах [51, 57, 64, 65, 68, 69].
С другой стороны, известно, что белок BCR(64 ,
сверхэкспрессируемый в Ph+-клетках мышей с ХМЛ, фосфорилируется белком bcr/abl по остатку тирозина, вследствие чего киназная активность онкобелка bcr/abl снижается на 80% [37-40]. Сверхэкспрессия bcr (рис. 2) приводит к существенному, но не полному ингибированию bcr/abl. Максимум пика экспрессии bcr наблюдается на 2 сут раньше пика экспрессии bcr/abl и соответствует высоким индексам P/D = 6-12 и быстрому развитию бластного криза ХМЛ у этого больного [2].
Низкая экспрессия р53 отмечается также в других Ph+-клетках в фазе акселерации и бластного криза ХМЛ с высоким пролиферативным потенциалом и индексом P/D = 3-23. Так, на 3 сут обнаруживается экспрессия генов р53, не превышающая 1/3 экспрессии gapdh. В этих клетках уровни экспрессии bcr/abl, mdm2 и bcl2 сопоставимы с gapdh, при том, что экспрессия bcr в 2 раза выше. Ph+^летки с высоким индексом P/D (от другого больного ХМЛ) имеют сходный профиль экспрессии этих генов. Возможно, данные клетки бластного криза ХМЛ несут дефектный р53, хотя мутации в этом гене не типичны для ХМЛ.
Итак, Ph+-клетки типа 1 при продолжительной пролиферации, концентрации незрелых клеток большей, чем зрелых, и индексе P/D = 2-20 отличаются по составу и уровню экспрессии генов. Для клеток с индексом P/D ~ 5-20 характерно повышенное содержание бластных клеток (от CD34+ до промиелоцитов), которым соответствует сверхэкспрессия bcr > gapdh > bcr/abl при пониженной экспрессии р53, bcl2 и mdm, р21< gapdh. Активация bcr/abl в миелоидных клетках-предшественниках сопровождается низкой экспрессией p53, p21, mdm2. В отсутствие контроля, осуществляемого генами-
регуляторами пролиферации и клеточного цикла, создаются, по-видимому, благоприятные условия для активной пролиферации клеток Ьcт/aЬl+. Возможно, эти Р^-клетки содержат мутантный р53.
В Р^-клетках типа 1 с невысоким пролиферативным потенциалом, Р^ ~ 1.2-4 и большим содержанием незрелых клеток, чем зрелых, наблюдается умеренная экспрессия Ьст/аЫ при сверхэкспрессии р21, mdm2, р53, Ьс12, Ьах, а также пролиферация и диф-ференцировка, благополучная для данного клона Р^-клеток. Эти гены участвуют в регуляции клеточного цикла, распределение клеток в S- и G2/M-фазах которого представлено широким пиком на 2-5 сут с максимумом на 3 сут. В этот период экспрессируются гены р21, р53 и mdm2 и взаимодействуют р53 и mdm2, контролирующие экспрессию друг друга.
В Р^-клетках типа 1 происходит эффективная пролиферация с накоплением незрелых клеток и сверхэкспрессией р21, р53 и mdm2. Зрелые клетки (нейтрофилы), образующиеся в период с 3 по 7 сут, быстро выходят в апоптоз. При этом концентрация зрелых клеток падает почти на порядок, что служит дополнительной причиной уменьшения экспрессии генов в ряду р21> mdm2> р53. По совокупности приведенных данных можно сказать, что в зоне 1 пролиферации и дифференцировки (1-4 сут) клеток типа 1 (рис. 1 и 2) экспрессия генов р21 > mdm2> р53 в 4-4.5 раза выше, чем гена gapdh. Далее на 4-10 сут, когда число клеток в S- и G2/M-фазах падает, уровни экспрессии этих генов уменьшаются в 3, 2.5 и 1.5 раза по сравнению с gapdh соответственно. На 8-9 сут уровни экспрессии этих генов на кинетической кривой имеют близкие минимумы.
Экспрессия генов при пролиферации и дифференцировке Ph+-клеток типа 2
Для Р^-клеток типа 2 на этапе созревания характерно значительное накопление нейтрофилов, особенно сегментоядерных, которые существенно блокируют апоптоз и ингибируют пролиферацию Р^-клеток. Пролиферация и дифференцировка происходят длительно с низкой эффективностью (P/D2 < 1) и скоростью созревания большей, чем скорость пролиферации, и при большей концентрации зрелых клеток, чем незрелых [1-4].
В Р^-клетках типа 2 (рис. 3А-Г) наиболее активно экспрессируются гены mdm2 > р53, значительно слабее асЫп ~ gapdh> р21> Ьст > с-тус ~ Ьст/аЬ1 > Ьах > Ьс12 (широкий пик с максимумом на 2 сут), что по длительности и положению максимумов соответствует повышенному (30-40%) накоплению клеток в S-и G2/M-фазах в течение 3-4 сут при низком уровне апоптоза (2-5%, рис. 3Г). Уровни экспрессии генов р21 > с-тус ~ Ьст/аЬ1 > Ьах> Ьс12 ниже, чем у гена
Уровни экспрессии генов Jf, КМ
Jt/Jgapdh, КМ
mdm2
gapdh
p53
bcr/abl
м p21 •/О bcl2
acfin
bcr
Апоптоз и распределение Ph+-клеток КМ в
о
СІ
Время, сут
Время, сут
Рис. 3. Экспрессия генов в Ph+^летках типа 2 из КМ при длительном этапе созревания с низкой эффективностью P/D < 1. Кинетические кривые уровней экспрессии генов (УЭГ) p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl, bcr, bcl2, bax, gapdh, acfin (А, Б), а также пролиферации и диф-ференцировки (В), апоптоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (Г) Ph+^леток КМ при [з] > [нз]. Детали обработки проб как на рис. 1. Уровни экспрессии генов Jf (А) и Jf/Jgapdh (Б).
А
Б
Г
gapdh. Ко времени максимума продукции миелоцитов (4-5 сут) экспрессия генов mdm2 > p53 приближается к минимуму (4 сут). При этом в течение всего времени наблюдения (5 сут) концентрация нейтрофилов в ~ 2 раза выше, чем миелоцитов, что согласно [1, 3] заметно тормозит накопление незрелых клеток - ингибирует пролиферацию в течение 1-5 сут. Несмотря на большее накопление нейтрофилов, чем незрелых, при совпадении по времени их максимумов и высокого содержания клеток в G2/M + S-фазах (~ 40%) экспрессия mdm2 > p53 > gapdh остается значительной.
В этих условиях уровни экспрессии gapdh, ac-tin, р21, bcr, c-myc, bax мало изменяются, а уровень bcl2 составляет не более половины от уровня gapdh; у остальных генов этот показатель еще ниже. Таким образом, нейтрофилы и миелоциты при высоком их содержании мало влияют на экспрессию этих генов. Уровни экспрессии генов р21, bcr, c-myc, bcl2, bax в клетках типа 2 в 2-5 раза ниже, чем в клетках типа 1. Это позволяет отнести сверхэкспрессию генов
р53 и mdm2 в Ph+^летках типа 2 к пролиферирующим клеткам в S- и G2/M-фазах, а не к миелоцитам и нейтрофилам на этапе созревания. При этом уровни экспрессии mdm2 и р53 в S- и G2/M-фазах клеток обоих типов сходны и составляют 4.5 и 2-3 относительно gapdh.
Максимальные уровни экспрессии bcr/abl и bcl2 соответствуют максимуму пика миелоцитов. В случае bcr/abl максимум отвечает максимальному накоплению миелоцитов, росту индексов P/D на 4 сут и максимальной экспрессии bcr/abl > gapdh на 4-5 сут. Экспрессия bcr/abl снижается одновременно с накоплением нейтрофилов и возрастает примерно в 2 раза с продукцией миелоцитов. Низкие уровни bax и bcl2 соответствуют низкой доле апоптоза, особенно при bcl2 > bax, когда bcl2 блокирует апоптоз. Другими словами, миелоциты и нейтро-филы характеризуются низкой экспрессией генов gapdh ~ actin > bcr, р21, bax, mdm2, p53 и c-myc, тогда как уровень экспрессии гена bcr/abl достигает своего максимума в миелоцитах (рис. 3А-В).
Рис. 4. Кинетические кривые уровней экспрессии генов (УЭГ) p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl, bcl2, bax, gapdh, acfin (А,
Б), а также ПДК (В), апоптоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (Г) для Ph+^леток типа 3 из ПК с чередованием этапов пролиферации и дифференцировки по схеме 1/2. Уровни экспрессии генов Jf (А) и Jf/Jgapdh (А, Б). Этап пролиферации на 0-3 сут с [нз] > [з], этап созревания с [з] > [нз] на 3-6 сут.
Уровни экспрессии генов, Jf, ПК
Jf/Jgapdh, ПК
mdm2
bcl2
gapdh
Полиномиальный (bax)
- Полиномиальный (gapdh)
p53
c-myc
Полиномиальный (mdm2) Полиномиальный (bcr/abl) Полиномиальный (p53)
bcr/abl
bax
Полиномиальный (p21)
- Полиномиальный (c-myc)
p21
acfin
Полиномиальный (bcl2) Полиномиальный (acfin)
Апоптоз и распределение Ph+-клеток
о
ІЗ
Миелоциты
Сегментоядерные
P/D
Полиномиальный (зрелые) Полиномиальный (миелоциты) Полиномиальный (сегментоядерные)
о Метамиелоциты Бласты
— Полиномиальный (P/D)
— Полиномиальный (незрелые)
— Полиномиальный (метамиелоциты) ■— Полиномиальный (бласты)
Апоптоз
G2/M
- Полиномиальный (S+G2/M) Полиномиальный (G2/M)
S
S+G2/M
Полиномиальный (S) Полиномиальный (апоптоз)
А
Б
Г
Экспрессия генов при пролиферации и дифференцировке P^-клеток типа 3
Регуляция пролиферации и дифференцировки Ph+ -клеток типа 3 зависит от последовательности этапов чередования и от схемы чередования: 1/2/1или 2/1/2, т.е. с какого этапа - пролиферации (1) или созревания (2) - начинается их чередование. Согласно [1-4] пролиферация и созревание протекают параллельно, однако с повышенной скоростью начинающего этапа чередования по сравнению с последующим. Максимуму скорости пролиферации соответствует минимум скорости созревания и наоборот. В точках пересечения кривых накопления незрелых клеток и нейтрофилов скорости этапов одинаковы и равны 1. Таким образом, чередование этапов определяет волновой процесс пролиферации и дифференцировки клеток. Чередование этапов по схемам 1/2/1 или 2/1/2 различается не только поочередным повышением скорости (либо пролиферации, либо созревания), но также ингибированием пролиферации высокими концентрациями нейтрофилов при [з] >> [нз] [1-4].
Характер экспрессии генов в P^-клетках, так же как их пролиферация и дифференцировка, зависит
от последовательности этапов чередования и от его начального этапа.
Экспрессия генов при чередовании пролиферации и созревания по схеме 1/2/1
На рис. 4А-Г видно, что активная экспрессия генов совпадает с максимумами распределения клеток в фазах G2/M + S и индексов Р^ (максимум на 2-3 сут, рис. 4В,Г). На этапе 1 (0-3 сут) скорости пролиферации и созревания различаются незначительно (по накоплению незрелых и нейтрофилов) без выраженного максимума (рис. 4В). Примерно на 3 сут (после пересечения кривых накопления незрелых и зрелых клеток) этап пролиферации (Р^ = 1.4—1.1 и концентрация незрелых выше, чем зрелых) переходит в этап созревания (3-6 сут) с максимумом накопления нейтрофилов и их компонентов: метамиелоцитов, сегментоядерных, палочкоядерных, и снижением индексов эффективности (P/D2 < 1). При этом на этапе 2 концентрация нейтрофилов существенно (в 4 раза) увеличивается, достигая максимума на 5 сут, а незрелых и миелоцитов возрастает всего на ~ 20% и также достигает максимума на 5 сут.
При этом зрелых клеток в 3 раза больше, чем незрелых (низкий уровень апоптоза - 3-7%, рис. 4В,Г). Видно, что накопление клеток в S-фазе на 5 сут сопровождается незначительным повышением их апоптоза, которое не приводит к увеличению содержания клеток в G2/M-фазе (рис. 4Г). Видно также, что 4-кратное увеличение содержания нейтрофилов заметно ингибирует пролиферацию на этапе созревания.
На рис. 4А-Г можно видеть, что этапу пролиферации (1) на 2-3 сут соответствуют максимумы экспрессии mdm2 > p53 > bax > p21, минимумы bcl2 > c-myc >> bcr/abl, а также первый максимум S-фазы, максимумы G2/M, S+G2/M и индекса P/D. На 0.5 сут видны первый максимум экспрессии bcr/abl, минимумы р53, mdm2, bax и максимумы bcl2, c-myc. Этапу созревания (2) на 3-6 сут (максимум зрелых >> незрелых > метамиелоцитов > сегментоядерных >> бластов и небольшой максимум апоптоза) соответствуют минимумы экспрессии p53 > p21 >> bax, mdm2 на 4-5 сут, минимумы клеток в G2/M-, G2+S-фазах и P/D на 5-6 сут, а также максимумы экспрессии bcr/abl и bcl2. При этом пику 2 непроизводительной S-фазы (не ведущей к G2/M) на 4-6 сут соответствуют максимумы c-myc и G2+S и второй минимум P/D на 5-6 сут, а также минимумы экспрессии p53 ~ p21>> bax и минимум G2/M на 4-5 сут.
Уровни экспрессии генов (рис. 4А,Б) на первом этапе (2-3 сут) снижаются в ряду: mdm2 >> p53 > bax ~ gapdh ~ p21 ~ bcl2 > bcr/abl, а экспрессия генов bcl2, c-myc > bcr/abl достигает минимума. На этапе 2 (на 5 сут) видны максимумы экспрессии bcr/abl ~ bcl2 > gapdh и повышение уровней actin, p53 ~ p21, а также c-myc при минимальном уровне bax. Сверхэкспрессия mdm2 >> p53 >> bax > gapdh, максимум которой наблюдается на 2 сут, соответствует максимальному числу клеток в S- и G2/M-фазах. При этом с завершением пролиферации и переходом к созреванию экспрессия р53 и mdm2 резко падает, а bcr/ abl и bcl2 возрастает. На этапе созревания по уровню максимальной экспрессии (4-6 сут) гены располагаются в ряду: bcr/abl ~ bcl2 > gapdh ~ actin ~ p21 ~ c-myc. Максимальные уровни экспрессии bcr/abl и bcl2 наблюдаются при незначительном накоплении незрелых и миелоцитов на 5 сут. При экспрессии bcl2 >> bax апоптоз блокирован (он составляет 2-4% и на 5-6 сут не превышает 7%). Это подчеркивает роль сверхэкспрессии bcl2 по сравнению с низкой экспрессией bax в таком значительном подавлении апоптоза (рис. 4А,Г). В случае bcl2 > bax или асинхронности максимумов и минимумов их экспрессии также наблюдалось ингибирование апоптоза в Р^-клетках типа 1 и 2. Повышение уровней экспрессии ряда генов к 5-6 сут можно считать предвестником этапа
пролиферации, следующего за этапом созревания.
На этапе пролиферации, когда содержание пролиферирующих клеток едва превосходит содержание нейтрофилов, сверхэкспрессия в ряду mdm2 >> р53> bax > gapdh соответствует максимуму пролиферирующих клеток в S- и G2/M-фазах, а на этапе созревания появляются небольшие максимумы экспрессии bcr/abl ~ bcl2 > gapdh. Уровни экспрессии остальных генов ниже, чем у gapdh на этапах и пролиферации, и созревания. Экспрессия генов mdm2 и р53 резко увеличивается на этапе пролиферации и быстро уменьшается на этапе созревания в соответствии с долей клеток в фазе G2/M. Это означает, что экспрессия гена mdm2 значительна в пролиферирующих клетках, но низка или отсутствует в ней-трофилах. Активная экспрессия mdm2, вероятно, может служить маркером этапа пролиферации и активации клеток в фазе G2/M клеточного цикла. Такой же характер изменения максимумов экспрессии mdm2, р53 и р21, совпадающих с максимумом клеток в фазе G2/M (рис. 5), отмечается и на этапе созревания с чередованием 2/1.
Экспрессия bcr/abl имеет два максимума (рис. 4А,Б). На этапе пролиферации с незначительным превышением незрелых клеток над зрелыми, максимум bcr/abl1 < gapdh. Однако на этапе созревания, при высокой концентрации зрелых и их значительном превышении над незрелыми, экспрессия максимальна в ряду bcr/abl2 > gapdh и bcr/abl1 < bcr/abl2 (рис. 4А-В). Отметим, что и здесь при пролиферации и созревании Р^-клеток с чередованием этапов 1/2 экспрессия bcr/abl возрастает при снижении УЭГ р53, mdm2 и p21. В Р^-клетках типа 2 и 3 уровень экспрессии bcr/abl1 < bcr/abl2(рис. 3 и 4). В Р^-клетках типа 1 можно встретить и bcr/abl1 < bcr/abl2, и bcr/abl1 > bcr/abl2.
Таким образом, экспрессия генов коррелирует с регуляцией пролиферации и дифференцировки Р^-клеток типа 3 с чередованием пролиферации и созревания по схеме 1/2. И в этом случае повышенная экспрессия р53, mdm2 и р21 совпадает с максимумом фаз S+G2/M и соответствует низкой экспрессии bcr/abl.
Экспрессия генов P^-клеток c чередованием этапов по схеме 2/1/2
При чередовании пролиферации и созревания по схемам 2/1 — 2/1/2/1 концентрация Р^-клеток типа 3 последовательно изменяется в ряду: [з] > [нз] ^ [нз] > [з] ^ [з] > [нз] (рис. 5—9).
На рис. 5 и 6 видно, что уровни экспрессии генов при созревании и пролиферации соответствуют низкому содержанию пролиферирующих клеток в фазах клеточного цикла (10-20%) при значительной индук-
Jf RT-ПЦР РНК клеток из ПК
Jf/Jgapdh, ПК
p53
acfin
bax
- Полиномиальный (gapdh)
— Полиномиальный (bcl2)
Время, сут А
mdm2
bcr/abl
Полиномиальный (p53) Полиномиальный (acfin) Полиномиальный (bax)
p21 c-mmy Полиномиальный (p21) Полиномиальный (bcr/abl)
gapdh
bcl2
Полиномиальный (mdm2) Полиномиальный (c-myc)
В Пролиферация и дифференцировка Ph+^леток ПК
Ї 5
о
Апоптоз и распределение Ph+-клеток ПК
о
3
Время, сут
Время, сут
Рис. 5. Уровни экспрессии генов p53, р21, mdm2, c-myc, bcr/abl, bcl2, bax, gapdh, acfin (А, Б), а также кинетические кривые ПДК (В), апоптоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (Г) Ph+^леток типа 3 из КМ с чередованием этапов по схеме 2/1/2. Детали на рис. 1. Уровни экспрессии генов Jf (А) и Jf/Jgapdh (Б). Этапы созревания при [з] > [нз] на 0-3 и 6 сут; этап пролиферации с [нз] > [з] на 3-6 сут.
А
Б
Г
ции апоптоза (40-80%). При этом высокое содержание неспособных к делению нейтрофилов на этапе созревания ведет к уменьшению пролиферативного пула клеток в фазах S+G2/M, особенно заметному на рис. 6, и этот пул не увеличивается при пролиферации на 2-6 сут. Возможно, максимум клеток в этих фазах не совпадает со значительным накоплением незрелых на этапе пролиферации. Однако созревающие без деления нейтрофилы, естественно, уменьшают накопление пролиферирующих клеток в фазах 8 и G2/M, при этом в них снижается экспрессия генов, активность которых существенно повышена в пролиферирующем пуле клеток в фазах 8 + G2/M.
Здесь уровни экспрессии исследованных генов существенно ниже, чем в предыдущих примерах, в том числе относительно gаpdh.
При пролиферации и дифференцировке Р^-клеток, начинающейся с этапа созревания, при значительном накоплении нейтрофилов с их ин-
гибированием пролиферации на 0-3 сут (рис. 5 и 6) максимум накопления нейтрофилов соответствует минимумам индекса эффективности Р/D и накопления незрелых и миелоцитов. При переходе к этапу пролиферации на 3-5 сут видны минимумы накопления зрелых, рост Р/D и минимумы накопления нейтрофилов. При этом концентрации зрелых и незрелых в их максимумах отличаются в 4-5 раз, что позволяет вполне корректно отнести экспрессию генов к нейтрофилам или соответственно к миелоцитам, уже не способным делиться.
На этапе созревания (рис. 5А-Г) максимальная экспрессия р21, mdm2, p53 > bcl2 > bax на 2 сут принадлежит не нейтрофилам, а пролиферирующим клеткам в S- и G2/M-фазах (20%), поскольку при повышении накопления миелоцитов в 5 раз на этапе пролиферации на 5 сут экспрессия этих генов не только не увеличивается, но снижается до минимальных значений.
Уровни экспрессии генов, Jf, ПК
Jf/Jgapdh, ПК
p53
bcr/abl
- Полиномиальный (p53)
- Полиномиальный (bax)
acfin
bcl2
Полиномиальный (p21) Полиномиальный (bcl2)
Время, сут
gapdh
bax
- Полиномиальный (gapdh) Полиномиальный (bcr/abl)
p21
c-myc
Полиномиальный (c-myc) Полиномиальный (acfin)
Апоптоз и распределение Ph+-клеток
Рис. 6. Экспрессия генов p53, p21, c-myc, bcr/abl, bcl2, bax, gapdh, acfin (А, Б), а также кинетические кривые ПДК (В), апоп-тоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (Г) Ph+^леток ПК типа 3 с чередованием по схеме 2/1. Детали на рис. 1. Уровни экспрессии генов Jf (А) и Jf/Jgapdh (Б) для ОТ-ПЦР (проба 106 клеток). Этап созревания с 0-3 сут при [з] > [нз], этап пролиферации с 3-6 сут при [нз] > [з].
А
Б
Г
Максимальный уровень экспрессии генов bcr/abl, actin, gapdh, c-myc, наблюдаемый на 5 сут, относится уже к миелоцитам (Р/D2 = 2.5). Два пика экспрессии bcr/abl (относительно gapdh, рис. 5А,Б) при пролиферации миелоцитов в 2 раза больше, чем при созревании нейтрофилов (на 5 и 0.5 сут). На этапе созревания (на 2 сут) видны также минимумы экспрессии генов gapdh > actin > bcr/abl. Это означает, что экспрессия генов, регулирующих клеточный цикл в пролиферирующих незрелых клетках, активируется и на этапе созревания в соответствии с максимумом клеток в фазах S и G2/M, но уровень экспрессии в 2-3 раза ниже, чем в Р^-клетках типа 1 и 2.
На рис. 5 уровни экспрессии генов р21 ~ mdm2 ~ p53 > gapdh выше, чем на рис. 6. Из рис. 6 видно, что на этапе созревания содержание клеток в фазах S + G2/M в 2 раза меньше, а нейтрофилов в 5 раз больше, чем незрелых, при значительно большем количестве сегментоядерных нейтрофилов. То есть, чем
выше содержание нейтрофилов, тем меньше клеток накапливается в фазах S и G2/M и тем ниже относительные уровни экспрессии генов р21, mdm2, p53 и gapdh (рис. 5 и б).
На этапе пролиферации с максимумом пика миелоцитов (на 5 сут) только у генов bcr/abl и actin уровни экспрессии выше, чем у gapdh, а у p53 > c-myc
> bax > mdm2 > p21 они ниже. Два максимума экспрессии gapdh коррелируют с максимумами апопто-за (рис. 5А,Б,Г). На рис. бА,Б,Г видно, что на 2-4 сут только р53 и bcl2 экспрессируются активнее gapdh. Максимум экспрессии генов р53 > gapdh >> mdm2
> p21 на 2-4 сут соответствует также максимуму широкого пика апоптоза (на 2-5 сут). Это отличается от умеренной экспрессии gapdh в ранее обсуждаемых примерах пролиферации и дифференцировки без чередования этапов и, вероятно, связано с участием gapdh в индукции апоптоза с максимумом на 1 и 5 сут. Отметим, что экспрессия p53, c-myc и bcl2,
минимальная на этапе пролиферации на 3-6 сут, составляет 0.5-0.7 от максимального уровня экспрессии gapdh (рис. б). На рис. б видно, что максимумы экспрессии генов р53 > mdm2 > p21 на 2-4 сут соответствуют также максимуму широкого пика апоптоза (на 2-5 сут).
Известно, что экспрессия p21, p53, gapdh и c-myc может отвечать за индукцию апоптоза [13-16, 20, 21, 28, 55, 56]. На этапе пролиферации на 3-6 сут в отсутствие экспрессии bax и bcl2 апоптоз индуцируется, очевидно, с участием генов gapdh, p21 и p53 (рис. 5 и б).
Отметим, что уровень экспрессии bcr/abl на 0.5-1 сут соответствует максимальному кратковременному накоплению миелоцитов и незрелых клеток-предшественников миелоцитов. Экспрессия генов, достигающая максимума на 0.5 сут, изменяется в ряду р53 > gapdh > actin > bcr/abl. Уровень экспрессии гена bcr/abl на 0-1 сут в 2 раза ниже, чем на 5 сут, что также связано с ингибированием пролиферации Ph+-клеток при повышенной концентрации нейтро-филов (рис. 5 и б).
Таким образом, относительные изменения уровней экспрессии генов в Ph+-клетках соответствуют чередованию этапов по схеме 2/1 (от созревания к пролиферации). Экспрессия генов согласуется с ингибированием пролиферации незрелых клеток нейтрофилами, созревающими без деления. Экспрессия генов на этапе созревания с максимальным содержанием нейтрофилов (в виде сегментоядерных при небольшой доле пролиферирующих клеток в фазах S и G2/M) в несколько раз ниже, чем в Ph+-клетках типа 1-3 с максимумом пула пролиферативных клеток. В этих случаях экспрессия генов однозначно повышена в активно пролиферирующих клетках в фазах S и G2/M. При этом ней-трофилы, как неделящиеся клетки, в этих фазах отсутствуют.
Низкая экспрессия исследуемых генов в самих нейтрофилах видна на этапах созревания Ph+-клеток типа 2 и 3 (рис. 3-б), что согласуется с пониженной продукцией в нейтрофилах многих белков и факторов роста [51, 57, 64, 65, 68, 69].
Видно (рис. б), что в клетках типа 3 с чередованием этапов 2/1 на этапе созревания при повышенном содержании нейтрофилов понижены уровни экспрессии всех генов. Уровни экспрессии генов p21 ~ mdm2 ~ p53 > gapdh > c-myc при созревании в 3-5 раз ниже, чем на этапе пролиферации (рис. 5 и б). При этом изменяется характер экспрессии р21 и mdm2. Пики их экспрессии, достигающей максимума на 1 или 2 сут, сужаются, а затем снижаются до минимума в соответствии с завершением фаз S и G2/M клеточного цикла по времени.
Отметим, что на этапе пролиферации с накоплением миелоцитов существенно повышается экспрессия bcr/abl. На этапе созревания нейтрофилов экспрессия bcr/abl в ~ 2 раза ниже, чем при накоплении миелоцитов. На этапе пролиферации экспрессия bcr/abl зависит от вида и концентрации пролиферирующих миелоидных клеток-предшественников (бластов), экспрессия bcr/abl в которых, возможно, подавляется активной экспрессией р53, mdm2 и p21. Дополнительно к ингибированию пролиферации в Р^-клетках типа 3 с чередованием 2/1 на этапе созревания происходит ингибирование экспрессии bcr/abl до минимума - в 1.5-3 раза ниже gapdh (рис. 5-6). При этом в нейтрофилах в максимуме созревания (1-2 сут с сегментоядерными нейтрофилами, составляющими основное содержание) заметно экспрессируются только gapdh и actin. Минимальные уровни c-myc, bcr/abl, p53 > p21 > bcl2 > bax в 2-10 раз ниже, чем у gapdh (рис. 6А,Б), что согласуется с низким содержанием клеток в фазах S и G2/M (< 12%).
При длительном чередовании этапов 2/1/2/1 Р^-клеток с очень низким содержанием в фазах S и G2/M (от 5 до 2%) и активном апоптозе экспрессия генов также коррелирует с чередованием этапов созревания и пролиферации. При этом экспрессия генов bcr/abl > gapdh > c-myc повышена, а у генов mdm2, p53, bcl2 остается на низком уровне и при созревании, и при пролиферации (рис. 7А,Б). Экспрессия гена bcr/abl характеризуется двумя пиками, большими, чем у гена gapdh и bcr/abl1 > bcr/abl2 на этапах созревания и пролиферации соответственно (рис. 7). Этап созревания с высоким накоплением нейтрофилов сопровождается экспрессией bcr/abl > gapdh > c-myc > p53 > mdm2, которая к 5 сут стремится к минимуму. На этапе пролиферации (5-7 сут) уровни экспрессии снова возрастают до максимума (на 7-8 сут) и затем снижаются с четкой очередностью. Так максимумы и минимумы накопления Р^-клеток при созревании и пролиферации чередуются так же, как максимумы и минимумы экспрессии генов в ряду c-myc, bcr/abl, gapdh, р53. При этом им соответствуют высокие уровни экспрессии генов bcr/abl и c-myc и очень низкие - bcl2 и mdm2. Быстро растущее накопление нейтрофилов приводит к подавлению пролиферации незрелых и экспрессии их генов и снижению содержания клеток в S- и G2-фазах до 3-5% (рис. 7В,Г). Последовательность этих событий отражается на уровне экспрессии генов в ряду: c-myc ~ gapdh ~ bcr/abl > р53
> mdm2 на 1-9 сут (рис. 7А-Г).
В другом примере Р^-клеток из КМ (рис. 8) с чередованием этапов 2/1/2/1 при повышенном содержании клеток в S- и G2-фазах (~ 30%, с двумя их максимумами на 2 и 6 сут) видны два максимума экспрессии
Уровни экспрессии генов, Jf, клеток КМ
Jf/Jgapdh, КМ
** bcr/abl •/о acfin
----Полиномиальный (acfin)
Время, сут
О p53 ч- gapdh
Полиномиальный (mdm2) <
A bcl2
— Полиномиальный (p53) С
— Полиномиальный (gapdh)
mdm2
Полиномиальный (bcr/abl) Полиномиальный (bcl2)
4 c-myc
---Полиномиальный
(c-myc)
ПД Ph+-клеток КМ
Г
Апоптоз и распределение Ph+-клеток КМ в S + Gl/M-фазах клеточного цикла
о
3
Рис. 7. Экспрессия генов p53, mdm2, c-myc, bcr/abl, bcl2, gapdh, acfin (А, Б), а также кинетические кривые ПДК (В), апоптоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (Г) в Ph+-клетках типа 3 из КМ с чередованием этапов по схеме 2/1/2/1. Детали на рис. 1. Уровни экспрессии генов Jf (А) и Jf/Jgapdh (Б). Этапы созревания 0-5 и 6-8 сут с [з] > [нз], этапы пролиферации на 5-6 и 8 сут
при [нз] > [з].
А
Б
В
генов: первый на этапе созревания: р21 > bax ~ c-myc ~ actin >> bcr/abl и gapdh ~ bcl2 ~ p53 > mdm2; второй на этапе пролиферации: c-myc ~ р21 >bax >> bcr/abl
> actin и gapdh > mdm2 > p53 > bcl2. Второй максимум уровней экспрессии р21 > bax ~ c-myc на порядок выше первого. В Р^-клетках из ПК (рис. 9) от того же больного ХМЛ экспрессия генов р21 > bax ~ c-myc была значительно ниже уровней экспрессии в клетках из КМ (рис. 8) и оставалась высокой на этапе пролиферации при трехкратном накоплении нейтрофилов ПК на этапе созревания. То есть при значительном накоплении нейтрофилов подавляется экспрессия генов на этапах созревания даже с повышенным содержанием клеток в фазах S + G2/M.
Результаты, представленные на рис. 7-9, примечательны тем, что рис. 7 показывает влияние длительного избытка нейтрофилов над незрелыми на экспрессию генов и на полное подавление пула пролиферирующих клеток в S + G2/M-фазах при низком уровне апоптоза. А на рис. 8-9 видно подавление нейтрофилами экспрессии генов на этапе созревания при совпадении существенного максимума клеток в S + G2/M-фазах (30%). Однако при пере-
ходе к пролиферации со значительным накоплением незрелых пролиферирующих клеток в условиях 50-80% индукции апоптоза (до того 10-20%) образуется второй максимум накопления пролиферирующего пула в фазах S+G2/M. При этом экспрессия генов р21 > bax ~ c-myc > bcr/abl > mdm2 возрастает на порядок при минимумах p53 > bcl2. Другими словами, нейтрофилы способны подавлять и задерживать образование пула пролиферирующих клеток в фазах клеточного цикла и/или подавлять экспрессию соответствующих генов. В этих терминах можно также интерпретировать и результаты, представленные на рис. 4-б.
Итак, при пролиферации и дифференцировке с чередованием этапов 2/1 - 2/1/2/1 экспрессия генов в нейтрофилах и миелоцитах согласуется с типами клеточной регуляции чередованием этапов, апоптоза и распределения Ph+-клеток ХМЛ в фазах клеточного цикла. Это также дополнительно свидетельствует о блокировании нейтрофилами апоптоза и ингибировании пролиферации Ph+-клеток. Уровни экспрессии генов на этапах созревания определяются максимальным накоплением клеток в S- и G2/M-фазах клеточ-
Уровни экспрессии генов, Jf, в Ph+^летках КМ
Уровни экспрессии генов, Jf, в Ph+^летках КМ
Время, сут Jf/Jgapdh, КМ
♦ gapdh A bcl2
— Полиномиальный (gapdh)
— Полиномиальный (p53)
Д
Время, сут
Jf / acfin, KM
Время, сут
■ mdm2
A bax
■ p53
■ bcr/abl
Полиномиальный (bcl2) Полиномиальный (p21)
Полиномиальный (mdm2) Полиномиальный (bax)
В Апоптоз и распределение Ph+^леток КМ
в S + Gl/M-фазах клеточного цикла
•'-у
о4
*
О
О
13
Время, сут
c-rnyc
Полиномиальный (c-myc) Полиномиальный (acfin) Полиномиальный (bcr/abl)
0 12 3
Время, сут
*— незрелые —£и— зр
■- P/D (н/з)
А
Б
Г
Рис. 8. Кинетические кривые уровней экспрессии генов p21, c-myc, bcl2, p53, mdm2, bcr/abl, bax, gapdh, acfin (А, Б, Г, Д), а также ПДК (Е), апоптоза и распределения в фазах клеточного цикла (В) Ph+- клеток из КМ типа 3 с чередованием этапов по схеме 2/1. Детали на рис. 1. Jf (А, Б), Jf/Jgapdh (Г, Д). Этап созревания с [з] > [нз] на 0-3 сут, этап пролиферации с [нз] > [з] на 3-7 сут.
ного цикла и ингибированием пролиферации нейтро-филами. Совпадение максимумов накопления клеток в S + G2/M-фазах и на этапе пролиферации указывает на их значение в повышании уровней экспрессии генов р21, mdm2, p53, bax, c-myc в 1.5-7 раз.
В нейтрофилах на этапе созревания уровни экспрессии остальных генов в 2-10 раз ниже, чем у гена gapdh. Это сопоставимо с уровнями экспрессии в клетках 2-го типа и в 5-10 раз ниже, чем в незрелых клетках первого типа.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В полученных от больных ХМЛ гемопоэтических клетках, содержащих Ph-хромосому и онкоген bcr/abl, определены кинетические кривые экспрессии 10 генов, регулирующих пролиферацию и диф-ференцировку, клеточный цикл и апоптоз. Экспрессия основных регуляторов клеточного цикла - р53, mdm2, p21, c-myc, bcr/abl, bax, bcl2 и gapdh, в диф-
ференцирующихся пролиферирующих миелоидных Р^-клетках и нейтрофилах, созревающих без деления, коррелирует с регуляцией процессов пролиферации и дифференцировки, с индукцией апоптоза и распределением клеток в фазах клеточного цикла ex vivo. Сравнение кинетики экспрессии генов и закономерностей регуляции пролиферации и дифферен-цировки Р^-клеток ex vivo с функциями этих генов показало, что эти гены участвуют в регуляции пролиферации и дифференцировки ex vivo Р^-клеток трех основных типов, а также в чередовании пролиферации (1) и созревания (2).
Определенные нами уровни экспрессии генов можно считать оценочными, выявляющими тенденцию, поскольку данные ОТ-ПЦР сравнивали с уровнями экспрессии gapdh и actin, которые также изменяются (измеряли в тех же пробах) в ходе культивирования, а не применяли внутренние стандарты на каждый ген.
А Уровни экспрессии генов, Jf,
в Ph+^летках ПК
Время, сут Jf/Jgapdh, ПК
Время, сут
■* gapdh a bcl2
— Полиномиальный (gapdh)
— Полиномиальный (p53)
Уровни экспрессии генов, Jf, в Ph+^летках ПК
- mdm2 p53
Полиномиальный (mdm2) Полиномиальный (bcl2)
Время, сут
- acfin bax
bcr/abl
Время, сут
p21
Апоптоз и распределение Ph+-клеток ПК в S+Gl/M-фазах клеточного цикла
Время, сут
А Апоптоз G2/M
S ■ S+G2/M
Полиномиальный (апоптоз) Полиномиальный (G2/M )
Полиномиальный (S) Полиномиальный (S+G2 /M)
ПД Ph+^леток ПК
Время, сут
c-rnyc Полиномиальный (p21)
Полиномиальный (bcr/abl) Полиномиальный (acfin)
& Зрелые А Миелоциты
* Сегментоядерные Незрелые
■ P/D Полиномиальный (P/D (н/з))
— Полиномиальный (зрелые) Полиномиальный (незрелые)
Полиномиальный (миелоциты) Полиномиальный (сегментоядерные)
В
Б
Г
Е
Рис. 9. Экспрессия генов p21, c-myc, bcl2, p53, mdm2, bcr/abl, bax, gapdh, acfin (А, Б, Г, Д) в сравнении с кинетикой апоптоза и распределения клеток в фазах клеточного цикла (В), а также ПДК (Е) для Ph+^леток из ПК типа 3 с чередованием этапов по схеме 2/1/2. Детали на рис. 1. Jf (А, Б), Jf/Jgapdh (Г, Д). Этап созревания с [з] > [нз] на 0-4 сут, этап пролиферации с [нз] > [з] на 4-7 сут.
Обнаружено, что экспрессия генов изменяется синхронно с регуляцией пролиферации и диффе-ренцировки, фазами клеточного цикла и апоптозом. Это показывает, что рассмотренные гены участвуют в регуляции пролиферации и дифференцировки пролиферирующих миелоидных Ph+-клеток и ней-трофилов. Полученные результаты соответствуют опубликованным данным о закономерностях экспрессии этих генов в других клетках. Они также согласуются с закономерностями пролиферации и дифференцировки, клеточного цикла и апоптоза в других системах. Это свидетельствует о пригодности использованных методов и кинетических кривых, полученных с помощью ОТ-ПЦР, для изучения экспрессии генов. Низкая экспрессия генов в ней-трофилах согласуется с низкой продукцией белка р21, ряда специфичных белков и многих факторов в гемопоэтических нейтрофилах [51, 57, 64, 65, 68, 69].
Кинетический подход к изучению экспрессии генов методом ОТ-ПЦР при сравнении с кинетикой пролиферации и дифференцировки клеток в полиномиальной аппроксимации оказывается вполне информативным для исследования регуляции пролиферации и дифференцировки, клеточного цикла и апоптоза гемопоэтических клеток, пролиферирующих с дифференцировкой и созревающих без деления. Полученные результаты позволяют поставить новые вопросы, важные для понимания экспрессии генов и механизмов ХМЛ. Один из них - участвуют ли гены р53, mdm2, p21, c-myc в ингибировании экспрессии bcr/abl. Второй вопрос - является ли экспрессия bcr/abl генотоксическим или клеточным стрессом для гемопоэтических клеток, и как реагируют на это гены р53, mdm2, p21, c-myc.
Результаты работы свидетельствуют, что повышению скорости пролиферации и агрессивности пролиферирующих Р^-клеток с высокой экспрессией гена
bcr/abl способствует пониженная экспрессия генов p53, mdm2 и р21, создающая условия для неконтролируемой экспрессии bcr/abl. Сверхэкспрессия генов р53, p21, mdm2 и c-myc, основных регуляторов клеточного цикла, напротив, подавляет экспрессию bcr/abl в РЬ+-клетках и образование клеток bcr/abl+.
ВЫВОДЫ
1. Экспрессия генов p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl, bcr, bcl2, bax, gapdh, actin участвует в общей программе регуляции ex vivo пролиферации и диффе-ренцировки РЬ+-клеток при ХМЛ.
Экспрессия этих генов согласуется с пролиферацией и дифференцировкой РЬ+-клеток трех типов и с их регуляцией чередованием этапов пролиферации (1) и созревания (2) по схемам 1/2/1 и 2/1/2, а также с пролиферацией и дифференцировкой на этапах только пролиферации (тип 1) или только созревания (тип 2).
2. В активно пролиферирующих миелоидных клетках-предшественниках, накапливающихся в S-и G2/M-фазах клеточного цикла, сверхэкспресси-руются гены p53, p21, mdm2 >> gapdh. Сверхэкспрессия этих генов наблюдается в клетках типа 1 и при совпадении максимума клеток в S- и G2/M-фазах с этапом пролиферации в РЬ+-клетках типов 2 и 3. При созревании и повторных чередованиях этапов пролиферации и созревания, где накапливаются нейтрофилы и миелоциты, экспрессия генов существенно снижается, а при чередовании по схеме 2/1/2 уменьшается также доля клеток в S- и G2/M-фазах клеточного цикла.
3. В нейтрофилах на этапе созревания уровень экспрессии падает в ряду gapdh > actin > c-myc,
bcr/abl, p21 > p53 > bcl2 > bax; в миелоцитах уровень экспрессии этих генов также не достигает уровня gapdh.
4. Экспрессия гена bcr/abl в Ph+-клетках типов 2 и 3 имеет два пика - снижается на этапе созревания при блокировании апоптоза и накоплении нейтрофи-лов и усиливается в 2-3 раза на этапе пролиферации с накоплением миелоцитов. Минимуму экспрессии bcr/abl соответствует сверхэкспрессия генов p53, mdm2, p21, c-myc и максимум клеток в S- и G2/M-фазах клеточного цикла.
5. На этапе созревания ингибируется апоптоз, накапливаются нейтрофилы и уменьшается экспрессия генов p53, mdm2 и p21, c-myc, bcr/abl. Апоптоз в Ph+-клетках индуцируется при экспрессии генов bax > bcl2, р53, p21, c-myc и gapdh.
6. В Ph+-клетках типа 1, полученных при бласт-ном кризе и в фазе акселерации ХМЛ, с индексами эффективности P/D ~ 5-20 и высоким содержанием клеток CD34+ и промиелоцитов, наблюдается сверхэкспрессия генов bcr > gapdh > bcr/abl при пониженной экспрессии р53, bcl2, mdm, р21 < gapdh. При этом сверхэкспрессия bcr/abl в миелоидных предшественниках сопровождается низкой экспрессией p53, p21, mdm2. Предполагается, что снижение/отсутствие контроля генов регуляторов пролиферации, дифференцировки и клеточного цикла способствует сверхэкспрессии гена bcr/abl и активной продукции клеток bcr/abl+.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 0б-04-08372-офи).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гринева Н.И., Ахлынина Т.В., Герасимова Л.П., Манакова Т.Е., Сарычева Т.Г., Шмаров Д.А., Тимофеев А.М., Найденова Н.М., Колосова Л.Ю., Колошейнова Т.И. и др. // Acta Naturae. 2009. Т. 1. № 3. С. 120-133.
2. Гринева Н.И., Ахлынина Т.В., Герасимова Л.П., Манакова Т.Е., Сарычева Т.Г., Шмаров Д.А., Тимофеев А.М., Найденова Н.М., Саркисян Г.П., Боровкова Т.В. и др. // Рос. биотерапевт. журн. 2009. Т. 8. № 4. С. 53-68.
3. Ахлынина Т.В., Гринева Н.И., Герасимова Л.П., Манакова Т.Е., Шмаров Д.А., Сарычева Т.Г., Боровкова Т.В., Найденова Н.М., Саркисян Г.П., Тимофеев А.М. и др. // Рос. биотерапевт. журн. 2010. Т. 9. № 2. С. 3-12.
4. Гринева Н.И., Ахлынина Т.В., Герасимова Л.П., Манакова Т.Е., Сарычева Т.Г., Шмаров Д.А., Тимофеев А.М., Найденова Н.М., Саркисян Г.П., Боровкова Т.В. и др. // Рос. биотерапевт. журн. 2010. Т. 9. № 4. С. 61-76.
5. Ахлынина Т.В., Герасимова Л.П., Саркисян Г.П., Боровкова Т.В., Духовенская Е.А., Манакова Т.Е., Найденова Н.М., Тимофеев А.М., Гринева Н.И. // Цитология. 2007. Т. 49.
С. 889-900.
6. Гринева Н.И., Барышников А.Ю., Герасимова Л.П., Боровкова Т.В., Саркисян Г.П., Манакова Т.Е., Ахлынина Т.В., Логачева Н.П., Найденова Н.М. // Рос. биотерапевт. журн. 2007. Т. 6. № 2. С. 21-32.
7. Dean РЖ // Cell Tissue Kinet. 1980. V. 13. Р. 299-302.
8. Chomczynski Р, Sacchi N. // Anal. Biochem. 1987. V. 162.
Р 156-159.
9. Edlich F., Banerjee S., Suzuki M., Cleland M.M., Arnoult D., Wang C., Neutzner A., Tjandra N., Youle R.J. // Cell. 2011.
V. 145. Р 104-116.
10. Levine A.J. // Cell. 1997. V. 88. Р 323-331.
11. Ko L.J., Praves C. // Genes Dev. 1996. V. 10. Р. 1054-1072.
12. Chylicki K., Ehinger M., Svedberg H., Gulberg U. // Cell Growth Differ. 2000. V. 11. Р 561-571.
13. Miyashita Т., Kraevsky S., Kraevsky M., Wang H.G., Lin H.K., Liebermann D.A., Hoffman B., Reed J.C. // Oncogene. 1994. V. 9. Р 1799-1805.
14. Wang Y., Okan I., Szekely L., Klein G., Wiman K.G. // Cell Growth Differ. 1995. V. 6. Р. 1071-1075.
15. Brosh R., Rotter V. // Mol. Biosyst. 2010. V. 6. № 1. Р. 17-29.
16. Hale A J., Smith C.A., Sutherland L.C., Stoneman V.E.,
Williams G.T. // Eur. J. Biochem. 1996. V. 236. № 1. P. 1-26.
17. van Delft M.F., Huang D.C.S. // Cell Res. 2006. V. 15. P. 203213.
18. Latier L., Cartron P.F., Juin P., Nedelkina S., Manon S., Bech-inger B., Vallete EM. // Apoptosis. 2007. V. 12. P. 887-896.
19. Fletcher J.I., Meusburger S., Hawkins C.J., Riglar D.T., Lee E.F., Fairlie W.D., Huang D.C.S., Adams J.M. // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P. 18081-18087.
20. Adams J.M. // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 2481-2495.
21. Green D.R., Kroemer G. // Science. 2004. V. 305. P. 626-629.
22. Yin X.M., Olevai Z.N., Korsmeyer S.N. // Nature. 1994. V. 369. P. 321-323.
23. Yusen. L., Martindale J.L., Gorospe M., Holbrook N.J. // Cancer Res. 1996. V. 56. P. 31-35.
24. Sherr C.J., Roberts J.M. // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 1149-1165.
25. El-Deiry W., Tokino T., Velculescu V.E., Levy D.B., Parsons R., Trent J.M., Lin D., Mercer W.E., Kinzler K.W., Vogelstein B. // Cell. 1993. V. 75. P. 817-825.
26. Macleod K.F., Sherry N., Hannon G., Besch D., Tokino T., Kinzler K., Vogelstein B., Jacks T. // Genes Dev. 1995. V. 9.
P. 935-944.
27. Parker S.B., Eichele G., Zhang P., Rawis A., Sands A.T., Bradley A., Olson E.N., Hasper J.W., Elledge S.G. // Science. 1995.
V. 267. P. 1024-1027.
28. Lee E.W., Lee M.S., Camus S., Ghim J., Yang M.R., Oh W., Ha N.C., Lane D.P., Song J. // EMBO J. 2009. V. 28. P. 2100-2113.
29. Freedman D.A., Wu L., Levine A.J. // Cell Mol. Life Sci. 1999. V. 55. № 1. P. 96-107.
30. Momand J., Zambetti G.P., Olson D., George D., Levine A.P.
// Cell. 1992. V. 69. P. 1237-1242.
31. Haupt Y., Maya R., Kazaz A., Oren M. // Nature. 1997.
V. 387. P. 296-299.
32. Wu L., Levine A.J. // Mol. Med. 1997. V. 3. № 7. P. 441-451.
33. Stommel J.M., Wahl G.M. // Cell Cycle. 2005. V. 4. № 3.
P. 411-417.
34. Xia M., Knezevic D., Tovar C., Huang B., Heimbrook D.C., Vassilev L.T. // Cell Cycle. 2008. V. 7. № 11. P. 1604-1612.
35. Momand J., Wu H.H., Dasgupta G. // Gene. 2000. V. 242.
№ 1-2. P. 15-29.
36. Asher G., Lotem J., Sachs L., Kahana C., Shaul Y. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 13125-13130.
37. Arlinghaus R.B. // Oncogene. 2002. V. 21. P. 8560-8567.
38. Hawk N., Sun T., Xie S., Wang Y., Wu Y., Liu J., Arlinghaus R.B. // Cancer Res. 2002. V. 62. № 2. P. 386-390.
39. Ling X., Ma G., Sun T., Liu J., Arlinghaus R.B. // Cancer Res. 2003. V. 63. № 2. P. 298-303.
40. Chen S., O’Reilly L.P., Smithgall T.E., Engen J.R. // J. Mol. Biol. 2008. V. 383. № 2. P. 414-423.
41. Melo J.V. // Blood. 1996. V. 88. P. 2375-2384
42. Deininger M.W.N., Goldman J.M., Melo J.V. // Blood. 2000.
V. 96. P. 3343-3356.
43. Primo D., Flores J., Quijano S., Sanchez M.L., Sarasquete M.E., del Pino-Montes J., Gaarder P.I., Gonzalez M., Orfao A. // Brit. J. Haematol. 2006. V. 135. P. 43-51.
44. Holyoake T.L., Jiang X., Eaves A.C., Eaves C.J. // Leukemia. 2002. V. 16. P. 549-558.
45. Buckle A.M., Mottram R., Pierce A., Lucas G.S., Russell N.,
Miyan J.A., Whetton A.D. // Mol. Med. 2000. V. 6. P. 892-902.
46. Coppo P., Dusanter-Fourt I., Millot G., Nogueira M.M., Dugray A., Bonnet M.L., Mitjavila-Garcia M.T., Le Pasteur D., Guilhot F., Vainchenker W., et al. // Oncogene. 2003. V. 22. P. 4102-4110.
47. Cortez D., Kadlec L., Pendergast A.M. // Mol. Cell Biol. 1995. V. 15. № 10. P. 5531-5541.
48. Traycoff C.V., Haistead B., Rice S., McMahel J., Srour E.F., Cornetta K. // Brit. J. Haetmatol. 1998. V. 102. P. 759-767.
49. Juin P., Hunt A., Littlewood T., Griffiths B., Swigart L.B., Korsmeyer S., Evan G. // Mol. Cell Biol. 2002. V. 22. № 17.
P. 6158-6169.
50. Mitchell K.O., Ricci M.S., Miyashita T., Dicker D.T., Jin Z., Reed J.C., El-Deiry W.S. // Cancer Res. 2000. V. 60.
P. 6318-6325.
51. Liebermann D.A., Hoffman B. // Stem Cells. 1994. V. 12.
№ 4. P. 352-369.
52. Gartel A.L., Shchors K. // Exp. Cell Res. 2003. V. 283. № 1.
P. 17-21.
53. Hoffman B., Amanullah A., Shafarenko M., Liebermann
D.A. // Oncogene. 2002. V. 21. P. 3414-3421.
54. Kleine-Kohlbrecher D., Adhikary S., Eilers M. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006. V. 302. P. 51-62.
55. Berry M.D., Boulton A.A. // J. Neurosci. Res. 2000. V. 60.
№ 2. P. 150-154.
56. Bustin A.S. // J. Mol. Endocrinol. 2000. V. 25. P. 169-193.
57. Goldman J.M., Melo J.V. // Acta Haematol. 2008. V. 119. № 4.
P. 212-217.
58. Khwaja A., Tatton L. // Blood. 1999. V. 94. P. 291-301.
59. Josefsen D., Myklebust J.H., L0mo J., Sioud M., Blomhoff H.K., Smeland E.B. // Stem Cells. 2000. V. 18. P. 261-272.
60. Danial N.N. // Clin. Cancer Res. 2007. V. 13. P. 7254-7263.
61. Bedi A., Sharkis S.J. // Curr. Opin. Hematol. 1995. V. 2.
P. 12-21.
62. Madrigal-Velazquez M., Aviles A., Neri N., Huerta J., Martinez-Jaramillo G., Mayani H. // Leuk. Lymphoma.
2006. V. 47. P. 665-673.
63. Graham S.M., Vass J.K., Holyoake T.L., Graham G.J. // Stem Cells. 2007. V. 25. P. 3111-3120.
64. Liu Y., Martindale J.L., Gorospe M., Holbrook N.J. // Cancer Res. 1996. V. 56. P. 31-35.
65. Berliner N., Hsing A., Graubert T., Sigurdsson F., Zain M., Bruno E., Hoffman R. // Blood. 1995. V. 85. P. 799-803
66. Eaves C., Jiang X., Eisterer W., Chalandon Y., Porada G., Zanjani E., Eaves A. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003. V. 996. P. 1-9.
67. Chin Y.E., Kitagawa M., Su W.C., You Z.H., Iwamoto Y., Fu X.Y. // Science. 1996. V. 272. P. 719-722.
68. Steinman R.A., Huang J., Yaroslavskiy B., Goff J.P., Ball E.D., Nguyen A. // Blood. 1998. V. 91. P. 4531-4542.
69. Borregaard N., Cowland J.B. // Blood. 1997. V. 89. P. 35033521.
70. Moore S., Haylock D.N., Levesque J.-P., McDiarmid L.A., Samels L.M., To L.B., Simmons P.J., Hughes T.P. // Blood. 1998. V. 92. P. 2461-2470.
71. Matsumura I., Ishikawa J., Nakajima K., Oritani K., Tomi-yama Y., Miyagawa J., Kato T., Miyazaki H., Matsuzawa Y., Kanakura I. // Mol. Cell Biol. 1997. V. 17. № 5. P. 2933-2943.
