CC BY
54
УДК 616-006.446.8-092.4:616-097:576.5
N.I. Grineva1, A.Yu. Baryshnikov2, L.P. Gerasimova^, T.V. Borovkova1, G.P. Sarkisyan , T.E. Manakova , T.V. Akhynina , N.P. Logacheva , N.M. Naydenova
ANTIGENE EXPRESSION KINETICS FOR HUMAN CML PHCELLS UNDER CELL PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION IN THE SUSPENSION CULTURE
1 Research Center for Hematology RAMS, Moscow 2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
ABSTRACT
Expression kinetics of 8 antigens (CD34, CD33, CD15, CD13, CD11b, CD14, CD3, CD19) under cultivation of Ph+,BCR/ABL+cells that are resulted in chromosome translocation t(9,22) and determined CML arising and progression have been studied in comparison with cell differentiation kinetics tested by cell morphology. Under 14 days cultivation in vitro of Ph+,BCR/ABL+ mononuclears from periferal blood of CML patient with b3a2 BCR/ABL mRNA there are identified additionally to cell differentiation according to CML myelopoiesis scheme also the active CD34 antigen expression on granulocytes and lymphocytes precursors. Activ CD34+cell accumulation occurs at cultivation finish under significant decrease of Ph+mononuclear concentration due to differentiation and apoptosis. Expression kinetics of CD34 antigen and other antigens look like two-phases pattern with noticeable activation of antigen expression close to cultivation finishing. There is strong correlation between CD34 antigen expression and cell proliferation in the first cultivation phase and especially in the second phase proliferation (7-14 days). CD34 +cell proliferation that are mainly presented by CD34+Myeloid precursor cells is assumed to be resulted in exit of Go/Gi phases of cell cycle with consequent partial differentiation in the cytokine presence and conservation in G 0 without cytokines. Simultaneous CD34 antigen expression on blast cells (myeloid and lymphocyte precursors) in the Ph+mononuclears studied shows that chromosome translocation t(9,22) resulted in early cell precursors of this CML patient -that look like is an polipotent hematopoietic stem cells or hematopoietic stem cell itself.
Key words: hematopoietic Ph+BCR/ABL+cells in culture, kinetics of Ph+cells proliferation, differentiation and proliferation, chronic myeloid leukemia, antigens expression, CD34, CD33, CD15, CD13, CD11b, CD14, CD3, CD19.
1 2 11 Н.И. Гринева , А.Ю. Барышников , Л.П. Герасимова , Т.В. Боровкова , Г.П. Саркисян1, Т.Е. Манакова1, Т.В. Ахлынина1, Н.П. Логачева2, Н.М. Найденова1
КИНЕТИКА ЭКСПРЕССИИ АНТИГЕНОВ В ПРОЦЕССЕ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ PH-КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ МИЕЛОЛЕЙКОЗЕ В КУЛЬТУРЕ
1 Гематологический научный центр РАМН, Москва 2ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
Изучена кинетика экспрессии 8 антигенов (CD34, CD33, CD15, CD13, CD11b, CD14, CD3 и CD19) при культивировании Ph+BCR/ABL+-клеток, образующихся при хромосомной транслокации t(9,22) и определяющих развитие хронического миелолейкоза в сравнении с кинетикой дифференцировки, тестируемой по морфологии клеток. При 14-сут культивировании in vitro Ph+BCR/ABL+-мононуклеаров из периферичесой крови больного ХМЛ с мРНК b3a2 BCR/ABL, кроме дифференцировки клеток по схеме, характерной для миелопо-эза при ХМЛ, идентифицирована также длительная пролиферация CD34+-предшественников миелоидных клеток и лимфоцитов. Активное накопление CD34+-клеток происходит в конце культивирования при значительном уменьшении концентрации Ph+-мононуклеаров при дифференцировке и апоптозе и объясняет повторную активацию пролиферации и рост отношения P/D - делящихся и неделящихся клеток - в конце культивирования. Кинетика экспрессии CD34 антигена и других исследованных антигенов имеет двухфазный характер с существенной активацией экспрессии антигенов к концу культивирования, что указывает на диф-ференцировку CD34+-клеток в 1-й фазе и активацию пролиферации CD34+-клеток во 2-й фазе (7-14 сут).
В этой фазе пролиферация CD34+-клеток, состоящих преимущественно из CD34+-предшественников миело-идных клеток (вероятно, КОЕ-ГМ и более ранних), происходит, как предполагается, в результате выхода CD34+-клеток в G1 из G0 фазы клеточного цикла с последующей, вероятно, частичной, дифференцировкой в присутствии цитокинов и консервацией в G0 без них. Одновременная экспрессия антигенов CD34 на предшественниках гранулоцитов и на лимфоцитах в исследованных Ph+^летках указывает на хромосомную транслокацию t(9,22) у данного больного ХМЛ в раннем предшественнике - в полипотентной стволовой клетке или даже ранее.
Ключевые слова: гемопоэтические Ph+ BCR/ABL+-клетки в культуре in vitro, кинетика пролиферации и дифференцировки, бласты, лейкозные стволовые клетки, хронический миелолейкоз, экспрессия антигенов CD34, CD33, CD15, CD13, CD11b, CD14, CD3 и CD19.
ВВЕДЕНИЕ
Согласно современным представлениям о механизмах возникновения и прогрессии лейкозов злокачественный этап болезни формируется в результате образования и функционирования лейкозных стволовых клеток (ЛСК). Образование этих клеток может протекать при хромосомных транслокациях, последующих мутациях и/или специфических изменениях генной регуляции [21; 23; 25; 30].
В зависимости от вида хромосомной транслокации клон ЛСК начинает формироваться либо сразу из стволовой гемопоэтической клетки (СКК), либо поэтапно. Вначале возникают трансформированные клетки, сохраняющие способность к мультипотентно-му кроветворению, которые затем мутируют в ЛСК [29; 30]. Этот путь реализуется при развитии хронического миелолейкоза (ХМЛ) от хронической фазы (ХФ) до бластного криза. ХФ ХМЛ возникает при реципрокной хромосомной транслокации 1(9,22) в стволовых гемопоэтических клетках (СКК) с образованием РЬ+БСК/ЛБЬ+-клеток, способных к диффе-ренцировке (Б-РЪ+-клетки). Согласно [21; 23; 25; 29; 30] Б-РЪ+-клетки могут превращаться в клон ЛСК вследствие мутаций не только в стволовых клетках, но и в их специализированных потомках: полипотент-ных, коммутированных предшественниках и даже в созревающих клетках [23]. При этом ЛСК подобно СКК способны к длительному самоподдержанию (посредством сохранения значительной доли клеток в О0 фазе клеточного цикла), но не способны к диффе-ренцировке.
Особенности РЪ+-клеток при ХМЛ определяет онкоген BCR/ABL, образовавшийся в составе РЪ+-хромосомы в результате хромосомной транслокации, и его продукт
- онкобелок - активная тирозинкиназа р210. Онкобелок р210 фосфорилирует различные факторы транскрипции и СТАТ белки (белки сигнальной трансдукции и активаторы транскрипции) и, активируя транскрипцию целого ряда генов, изменяет многие пути сигнальной трансдукции и в итоге - генную регуляцию клеток [15; 19; 20; 23; 27; 29-32]. Многообразие действия р210 создает особые сложности в исследовании накопления мутаций в Б-РЪ+-клетках при их превращении в ЛСК. В настоящее время не известно, как и какие клетки-предшественники или их потомки и на каком этапе развития ХМЛ превращаются в ЛСК.
Сложные механизмы кроветворения, включающие пролиферацию, многоэтапную дифференцировку с делением клеток, созреванием клеток без деления и апоптозом зрелых клеток и/или его блокированием затрудняют исследования последовательности процессов в прогрессии ХМЛ.
Весьма успешные современные исследования генной регуляции обсуждаемых процессов проведены методами трансфекции клеточных линий, культур стволовых клеток мышей и на потомках этих клеток, генетическими конструкциями, экспрессирующими заданные белки. С помощью таких подходов выявлены многочисленные гены, участвующие в регуляции CKK [21; 23; 25; 29; 30]. Последовательность процессов в клетках-предшественниках исследуется в культурах, получаемых из одной-единственной полипо-тентной клетки. Такие подходы однако не позволяют исследовать последовательность процессов, участвующих в превращениях D-Ph+-клеток в ЛСК, например, при лейкозах из-за отсутствия адекватных клеточных моделей.
Ранее мы исследовали кинетику пролиферации, дифференцировки, апоптоза и транскрипции анти-апоптотических генов в культурах Ph+-клеток при ХМЛ и убедились в информативности изучения непрерывной регуляции клеточных и молекулярных процессов при ХМЛ in vitro [2]. Такой путь позволяет в динамике судить о состоянии кроветворения на разных этапах болезни.
В данной работе с целью выявить лейкозный злокачественный клон на ранних этапах ХМЛ мы исследовали кинетику экспрессии 8 антигенов на Ph+-клетках ПК больного в хронической фазе ХМЛ при 14-сут культивировании в суспензионной культуре до начала лечения в сравнении с кинетикой дифференцировки этих клеток. В итоге кроме дифференцировки по схеме, характерной для миелопоэза при ХМЛ, идентифицирована также пролиферация CD34+-клеток и ее некоторые особенности, что позволяет подойти к идентификации этих клеток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использованные материалы: гепарин (Flow, Англия); Limphoprep, среда альфа-МЕМ (MP Biomedical, США); DEPC, Hepes, Трис, PBS, эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС), цитрат Na , лаурилсаркозил
(ICN, США); краситель трипановый синий, L-глутамин и 2-меркаптоэтанол (Serva, Германия), пенициллин и стрептомицин (ОАО «Биохимик», Саранск, Россия); Г-КСФ (F.Hoffmann-La Roche Ltd, Франция); моноклональные антитела (МАТ) соответственно: ICO-115, ICO-174, ICO -175, ICO-GM1, ICO-90, F(ab’)2 фрагмент FITZ-меченной кроличьей сыворотки против иммуноглобулинов мыши (НПО «Мед-биоспектр», Москва). Фикоэритрин-меченные МАТ (PE-CD33, PE-CD13 и PE-CD19, Caltag, США).
Ph+,BCR/ABL+-клетки получали из ПК от больного ХМЛ в хронической фазе до лечения (ГНЦ РАМН, где в клетках ПК данного больного была идентифицирована Ph+^ромосома в 94 % митозов) и помещали во флакон с гепарином (50 ед/мл). Из ПК выделяли фракцию мононуклеаров в градиенте плотности фи-колла 1,077 г/см3 (Limphoprep, MP Biomedical). В Ph+-мононуклеарах методом RT-PCR определяли транскрипт мРНК BCR/ABL b3a2 типа (длина амплификата 378 пар оснований) [7].
Ph+,BCR/ABL+-мононуклеары культивировали в среде а-МЕМ (MP Biomedical), содержащей 20 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (ICN), 2mM L-глутамина (Serva), 10-4 моль/л 2-меркаптоэтанола (Serva), 100 ед. пенициллина и 50 ед. стрептомицина, 25 mM Hepes (pH 7,2-7,4), обозначая условиями культивирования без факторов роста. Для культивирования с факторами к той же среде добавляли 100 нг/мл Г-КСФ (F.Hoffmann-La Roche Ltd) и интерлейкин-3 (ИЛ-3) в составе кондиционированной среды (10 % по объему), которую получали от клеточной линии U5637 по [28]. Ph+-клетки (1,1 х 106 клеток в 1 мл) инкубировали в 24 ячеечных платах по 12 ячеек на каждую пробу в течение 14 дней при 37 °С в условиях абсолютной влажности и 5 % содержания СО2. В пробах, отбираемых в процессе культивирования, определяли число живых и мертвых клеток, анализировали экспрессию поверхностных антигенов и морфологию клеток в мазках по Романовскому [1; 3; 10; 34].
Кинетические кривые дифференцировки грануло-цитов и лимфоцитов определяли по изменению состава морфологически идентифицируемых клеток в мазках по методу Романовского [1]. Концентрацию различающихся по морфологии клеток вычисляли из общей концентрации мононуклеаров на кривой их роста и %-ного состава клеток на мазках. Концентрацию выражали в 106 клеток на мл суспензионной культуры.
Кинетику изменений индекса P/D гранулоцитов определяли как отношение концентраций суммы пролиферирующих клеток (бласты, промиелоциты, миелоциты) к сумме дифференцирующихся без деления и зрелых гранулоцитов (метамиелоциты, палочкоядерные, сегментоядерные нейтрофилы) по [2; 6].
Для анализа экспрессии антигенов CD34, СD14, CD15, CD11b, CD3 использовали моноклональные антитела (МКА) соответственно: ICO-115, ICO-174, ICO-175, ICO-GM1, ICO-9, и F(ab’)2 фрагмент FrTC-меченной кроличьей сыворотки против иммуноглобулинов мыши (НПО «Медбиоспектр», Москва) в мето-
де непрямого иммунофенотипирования с помощью FASCan-анализа [3; 10; 34]. Для этого 5х105 клеток инкубировали 30 мин с 20 мкл МКА при 4 °С, дважды промывали PBS и затем инкубировали30 мин с 20 мкл FITC-меченной сыворотки кролик - мышь при 4 °С. Клетки дважды промывали PBS, и экспрессию поверхностных клеточных антигенов определяли ци-тофлоюриметрически в гранулоцитарном и лимфоцитарном гейтах на приборе FASCan, Beckton Dickinson по светорассеянию и размерам клеток, результаты оценивали в процентах. В отдельных случаях клетки до анализа ресуспендировали в 1%-ном растворе формальдегида в PBS [10; 34].
Для анализа антигенов CD33, CD 19 и CD 13 использовали метод прямого иммунофенотипирования с помощью фикоэритрин-меченных МКА (PE-CD33, PE-CD13 и PE-CD19, Caltag, США). Для этого 5х105 клеток инкубировали с 20 мкл МКА 30 мин при 4 °С и дважды промывали PBS, ресуспендировали в PBS и анализировали экспрессию антигенов в гранулоцитар-ном и лимфоцитарном гейтах, как указано выше. Значимыми считали данные выше 10 % для CD34, CD19 и более 20 % для остальных антигенов [3; 10; 34].
Кинетические кривые экспрессии антигенов получали на основании данных экспрессии антигенов в гранулоцитарном и лимфоцитарном гейтах (в % ) в тех же пробах Ph+-клеток, в которых анализировали их дифференцировку по морфологии. Кинетику изменения концентрации CD34+-клеток (106/мл) рассчитывали, используя изменения %-ного содержания грану-лоцитов и лимфоцитов при культивировании по данным морфологии (что определяет погрешности в концентрации CD34+-клеток в 10-20 %) и изменения концентрации клеток в процессе культивирования.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С целью выявить возможность образования лей-козного злокачественного клона на ранних этапах ХФ ХМЛ (при установлении диагноза) мы исследовали кинетику экспрессии антигенов и дифференцировки морфологически различимых Ph+-клеток ПК больного в хронической фазе ХМЛ при культивировании однократно взятой пробы Ph+BCR/ABL+-мононуклеаров в суспензионной культуре. Такой подход позволяет оценить дифференцировочный и пролиферативный потенциалы Ph+-клеток больного на момент отбора пробы в некотором временном развитии in vitro, что проанализировано в [2].
На рис. 1 и 2 представлены кинетические кривые экспрессии всех антигенов (рис. 1 и 2, А и Б) и каждого антигена (рис. 1 и 2, В и Г) в процессе культивирования после разделения проб клеток в гранулоцитар-ном и лимфоцитарном гейтах. Кинетика дифференци-ровки клеток гранулоцитарного ростка кроветворения по данным морфологии дана на рис. 3, а на рис. 4 приведены кривые роста Ph+^ононуклеаров и составляющих их гранулоцитов и лимфоцитов, а также отношение P/D количества клеток, делящихся и созревающих без деления; в присутствии факторов роста -
Рис. 1. Кинетические кривые экспрессии 8 антигенов (CD34, CD33, CD15, CD14, CD13, CD11b, CD3 и CD19) в процессе культивирования Ph+нмононуклеаров периферической крови хронической фазы ХМЛ без факторов роста (А, В) и с факторами роста (Б, Г), выявляемой в гранулоцитарном гейте цитофлюо-риметра FASCan, Beckton Dickinson:
А - кинетические кривые экспрессии всех антигенов без факторов роста;
Б - кинетические кривые экспрессии всех антигенов с факторами роста (в присутствии ИЛ3 и Г-КСФ);
В - кинетические кривые экспрессии каждого антигена без факторов роста;
Г - кинетические кривые экспрессии каждого антигена с факторами роста.
Рис. 2. Кинетические кривые экспрессии 8 антигенов (СБ34, СБ33, СБ15, СБ14, СБ13, СБ11Ъ, СБ3 и СБ19) в процессе культивирования РИ+-мононуклеаров ПК ХФ ХМЛ без факторов (А, В) и с факторами (Б, Г), выявляемой в лимфоцитарном гейте:
В - кинетические кривые экспрессии каждого антигена без факторов;
Г - кинетические кривые экспрессии каждого антигена с факторами.
(рис. Б) и без факторов - (рис. А). Во всех случаях, в том числе при экспрессии антигенов, видно активирующее влияние цитокинов.
Для иммунофенотипирования были выбраны моноклональные антитела (МКА): на CD34, CD33, CD15, CD14, CD13, CD11b, CD3 и CD19-антигены [3; 10] на том основании, что исходные Ph+-мононуклеары при ХМЛ, кроме миелоидных и лимфоидных предшественников, содержат и более дифференцированные клетки, что видно на рис. 3 и 4. Последние образуются также в процессе дифференци-ровки при культивировании.
Видно (см. рис. 3, 4), что при 14-сут культивировании in vitro Ph+BCR/ЛBL+-мононуклеаров ПК больного ХМЛ с мРНК b3a2 BCR/ABL, кроме дифферен-цировки и апоптоза по схеме, характерной для миело-поэза при ХМЛ [6-9; 12-15], идентифицируется также длительная экспрессия антигенов CD34 на клетках в гранулоцитарном и лимфоцитарном гейтах (см. рис. 1 и 2) и, следовательно, пролиферация соответствующих CD34+-клеток. Их содержание в гранулоцитарном и лимфоцитарном гейтах колеблется от 1 до 30 % и от 17 до 27 % соответственно.
На рис. 3, где приведены кинетические кривые пролиферации и дифференцировки, а также влияние на эти процессы факторов роста (см. рис. 3, Б), видно, что РЬ+-гранулоциты последовательно пролиферируют и дифференцируются с образованием бластов, промиелоцитов с максимумом на 1-е сут и миелоцитов с максимумом накопления на 7-е сут, и далее метамиелоцитов и зрелых нейтрофилов. В совокупности эти результаты подтверждают, что в данной суспензионной культуре РЪ+-клетки ПК больного ХМЛ пролиферируют и дифференцируются в соответствии со схемой миелопоэза в ХФ ХМЛ [6-9; 12-15; 26; 27].
При этом четко прослеживается механизм грану-лоцитопоэза и влияние на него факторов роста. Видно, что факторы ускоряют дифференцировку особенно созревающих клеток и как следствие ускоряют гибель зрелых клеток. Основную массу клеток составляют миелоциты. К 10-м сут культивирования концентрация миелоцитов резко падает и далее уменьшается в присутствии дополнительных факторов на порядок; при их отсутствии концентрация к 10-м сут уменьшается заметно меньше, а к 14-м сут даже несколько возрастает. При недостатке факторов
Рис. 3. Кинетические кривые дифференцировки (накопления и расходования) ?И+-гранулоцитов при культивировании ?И+-мононуклеаров ПК ХФ ХМЛ без факторов роста (А) и с факторами (Б) (в присутствии ИЛ3 и Г-КСФ):
А - альфа-БМЕМ среда + 20 % фетальной бычьей сыворотки;
Б - ИЛ3 в 10 % по объему кондиционированной среды из клеток Ш637 [28] и 100 нг/мл Г-КСФ.
26 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ
Рис. 4. Кинетические кривые накопления и расходования РИ+-мононуклеаров, РИ+-гранулоцитов и РИ+-лимфоцитов, а также изменения индекса P/D для гранулоцитов при культивировании без факторов роста (А) и в присутствии факторов роста (Б):
P/D выражает отношение пролиферирующих и дифференцирующихся с делением гранулоцитов (незрелых, Р, к гранулоцитам, дифференцирующимся без деления (созревающим и зрелым нейтрофилам, D).
наблюдается торможение дифференцировки, а в присутствии факторов роста видна повышенная скорость созревания нейтрофилов и их апоптоза. После завершения дифференцировки и выхода зрелых клеток в апоптоз с 10 до 14 сут культивирования концентрация клеток падает; виден новый рост концентрации клеток, который заметно зависит от присутствия в среде цитокинов ИЛ3 и Г-КСФ (см. рис. 3, А и Б). Эти цито-кины, как известно, участвуют в активации дифференцировки миелоидного ростка гемопоэтических клеток [4; 5; 12-14; 24].
Согласно [2] изменение отношения количества делящихся и созревающих без деления клеток, P/D, на рис. 4 выявляет активную пролиферацию клеток в начале и новый этап пролиферации в конце культивирования в присутствии факторов роста. Наблюдаемый рост концентрации клеток в конце культивирования одновременно с активацией пролиферации в виде нового этапа увеличения отношения P/D предполагает пролиферацию самоподдерживающихся клеток и возможное клонирование злокачественных лейкозных бластов - РЪ+-клеток, теряющих способность к дифференцировке. Анализируя экспрессию CD34, CD33, CD15, CD13, CD14, CD3, CD11 и CD19-антигенов в РЪ+-клетках (см. рис. 1 и 2), мы попытались идентифицировать клетки, участвующие в поздней пролиферации.
Характер кривой СБ34+-клеток (см. рис. 1, А и Б) из гранулоцитарного гейта свидетельствует, что пролиферация этих клеток начинается после 7 сут культивирования и возрастает к 10 сут до 24 % в отсутствии факторов и до 30 % в их присутствии. СБ34-антиген в течение 0-7 сут в гранулоцитарном гейте практически отсутствует. Рис. 1, В, Г и рис. 2, В, Г показывают кинетику экспрессии каждого антигена. Видно, что до 7 сут все СБ34+-клетки как более ранние предшественники попадают в лимфоцитарный гейт (от 17 до 24 %, см. рис. 2). На 10-14-е сут в гранулоцитарном гейте тоже появляются СБ34+-клетки, относящиеся согласно экспрессии антигенов (см. рис. 1), и схеме биомаркеров антигенов (рис. 5), вероятно, к РЬ+С034+СБ33+К0Е-ГМ-клеткам. Это клетки-предшественники (бласты), которые могли возникнуть на позднем этапе культивирования только при делении следов СБ34+-клеток по механизму самопод-держания с выходом из О0 в О: фазу клеточного цикла. Наблюдаемую на 1-е сут эффективную экспрессию СБ33-антигена (рис. 1, В, Г) следует отнести к экспрессии небольшого количества миелобластов и промиелоцитов, дифференцировка которых в первые сутки согласно рис. 4 достигает максимума.
Как видно (см. рис. 1 и 2), активное накопление СБ34+-клеток происходит при значительном умень-
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ 27
Рис. 5. Схема экспрессии антигенных биомаркеров при гемопоэзе согласно [11]
шении общей концентрации РЪ+-клеток вследствие завершения дифференцировки и апоптоза с резким падением концентрации РЪ+-мононуклеаров к 10-14-м сут культивирования (см. рис. 3 и 4).
Сопоставление рис. 1, А, Б и рис. 3, А, Б показывает, что кинетическая кривая образования и расходования дифференцирующихся гранулоцитов по данным морфологии с высоким содержанием миелоцитов в течение всего времени культивирования (см. рис. 3) соответствует количественной экспрессии антигена СБ13 (см. рис. 1) и экспрессии антигенных маркеров гемопоэза (схема на рис. 5 по [11]). Экспрессия СБ11Ь растет по ходу дифференцировки от промиелоцитов до зрелых гранулоцитов. Экспрессия остальных антигенов: СБ34, СБ33 и СБ15 имеет 2-фазный характер. 1-я фаза - 0-3 сут культивирования (см. рис. 1) с активной быстро завершающейся пролиферацией и дифференцировкой бластов (см. рис. 3), и 2-я фаза -7-14 сут - медленное созревание клеток и рост экспрессии соответствующих антигенов. При этом СБ34 экспрессируется только после 7 сут культивирования почти синхронно с СБ33, СБ15, СБ 11Ь и СБ14. Последний антиген, вероятно, указывает на некоторую экспрессию моноцитов. Отсутствие экспрессии СБ34 и СБ14 в гранулоцитарном гейте в начале культиви-
рования указывает на то, что их соответствующие клетки-предшественники попадают вначале в состав бластов (см. рис. 3), идентифицирующихся в лимфоцитарном гейте (см. рис. 2). По мере дифференцировки в культуре некоторое количество потомков CD34+-клеток, очевидно, КОЕ-ГМ-клетки и их потомки, перемещаются в гранулоцитарный гейт. В основном это CD33+CD15+CD13+ КОЕ-Г с примесью КОЕ-М-клеток. Часть из них быстро пролиферирует и далее дифференцируется в течение 0-3 сут. Другая часть этих клеток экспрессирует СD34-антиген наряду с CD33, CD13, CD15, CD14 (КОЕ-Г и КОЕ-М клетки) только в конце культивирования - после 7 сут. Вероятно, эти клетки-предшественники, находящиеся в G0 фазе клеточного цикла в малом количестве, начинают к 7-10-м сут культивирования пролиферировать и дифференцироваться и только после этого попадают в гранулоцитар-ный гейт, так как уже дополнительно к CD34 экспрессируют и CD 33-антиген (см. рис. 1).
Из рис. 2 видно, что в данном образце мононук-леаров ПК наблюдаются 2 пика пролиферации согласно индекса P/D [2]: 1-й - активный в начале культивирования (0-3 сут) и 2-й - менее активный и более медленный - в конце (на 10-14-е сут). Различия в активации пролиферации гранулоцитов особенно видны
при культивировании в присутствии факторов (см. рис. 3, Б и 4, Б). Индекс P/D - отношение всех делящихся клеток к неделящимся в процессе культивирования - можно рассматривать в качестве меры пролиферации (по [б] - индекс созревания).
Отметим, что рост накопления CD34+-предшественников миелоидных клеток и CD34+-лимфоцитов в процентах к моменту значительного падения концентрации всех других клеток может приводить к увеличению содержания остающихся клеток, поэтому на рис. б приведена кинетика изменения концентрации CD34+-предшественников миелоидных клеток, лимфоцитов и суммы СD34+-клеток (CD34+-бластов) при культивировании с факторами роста и без них. Видно, что основное количество СD34+-клеток представлено CD34+-предшественниками миелоидных клеток (гранулоцитов) и что оно действительно растет с падением концентрации Ph+BCR/ABL+-клеток на 10-е -14-е сут культивирования. Накопление клеток при этом имеет двухфазный характер (рис. б) аналогично кинетике экспрессии других исследованных антигенов (см. рис. 1 и 2). Видно, что со временем экспрессия антигена CD34 на предшественниках миелоидных клеток падает к 14-м сут после некоторого накопления на 10-е сут культивирования, что указывает на активную
Рис. 6. Кинетические кривые изменения концентрации СБ34+-клеток, экспрессирующих антиген СБ34 на предшественниках лимфоцитов, миелоидных клеток и на их сумме (бластах) при культивировании РИ+-мононуклеаров ПК ХФ ХМЛ без факторов (б/ф) и с факторами роста (с/ф, в присутствии ИЛ3 и Г-КСФ)
пролиферацию СБ34 -клеток, выходящих из О0 цикла в присутствии факторов роста, и их дифференцировку, видимо, частичную.
В совокупности эти данные могут означать выход из О0 цикла предшественников дифференцирующихся РЬ+БСЕ/АБЬ+-клеток (Б-РЬ+ВСЛАВ£+-клеток) в ответ на резкое падение концентрации РЪ+БСК/ЛБЬ+-клеток в среде и, возможно, новый этап их дифферен-цировки на 10-14-е сут культивирования. Наблюдаемая экспрессия антигенов СБ33, 15 и 11Ь на этом этапе культивирования (см. рис. 1) не противоречит предположению о параллельно протекающей медленной дифференцировке СБ34+-клеток.
Экспрессия антигенов клеток лимфоцитарного гейта (см. рис. 2) также демонстрирует 2-фазную экспрессию исследованных антигенов. Превалирующая экспрессия СБ3-антигена, относящаяся к Т-лимфоцитам, в начале культивирования соответствует этапу активной пролиферации клеток-предшественников в составе бластов на 0-7-е сут (см. рис. 2 и 6). Кроме СБ3 в этой фазе синхронно экспрессируются антигены СБ34, СБ11Ь, СБ33, СБ14, СБ19, СБ14, СБ13; во 2-й фазе на 7-14-е сут культивирования экспрессируются антигены СБ3, СБ34, СБ19. Однако наблюдаемые значения СБ14, СБ33 и СБ11Ь ниже информативных 10-20 %.
В гранулоцитарном гейте СБ34+-клетки обнаруживаются только в конце культивирования РЪ+-клеток; и их экспрессия коррелирует с экспрессией антигена СБ33 (см. рис. 1). СБ34-антиген в лимфоцитарном гейте также экспрессируется в виде 2 фаз, более выраженных и разделяющихся при культивировании в присутствии факторов роста, с существенной активацией экспрессии к концу культивирования (см. рис. 2).
Отметим, что в это же время по данным морфологии в 1-й фазе активно дифференцируются бласты (максимум в 1-3-е сут, см. рис. 3). Эти бласты по отношению к ростовым факторам представлены неоднородными клетками. Часть из них дифференцируются с максимумом на 1-е сут (вероятно, КОЕ-ГМ), а другая часть - вероятно, КОЕ-Г и/или миелобласты (СБ33+, СБ13+, СБ15+) - позже - на 3-е сут (см. рис. 3). Отсутствие экспрессии антигенов СБ33, СБ15, СБ14, СБ15 и СБ11Ь на гранулоцитах от 0 до 7 сут и увеличение их экспрессии на 10-14 сут (см. рис. 1) означает, что некоторая часть этих клеток дифференцируется во времени аналогично пику бластов (см. рис. 3). В соответствии с дифференцировкой и значительным накоплением миелоцитов на 3-10-е сут наблюдается повышенная экспрессия СБ13, СБ15 и СБ11Ь-антигенов, которые соответствуют миелоцитам и характеру их экспрессии. Что касается других морфологически определяемых РЪ+-клеток (см. рис. 1, 2), то их экспрессия по кинетике и биомаркерам вполне согласуется с известной экспрессией соответствующих антигенов (схема рис. 5 согласно [11]).
Кинетика небольшой дифференцировки РЪ+-лимфоцитов на 1-3-е сут по морфологии (см. рис. 4) и экспрессии СБ34 антигена (см. рис. 2, 6) также выяв-
ляет неоднородность фракции лимфоцитов: ранний пик - 1-е сут, поздний - 3-е сут на рис. 2. Дифферен-цировка раннего пика ускоряется в присутствии факторов и позволяет наблюдать более поздний пик. Экспрессия антигенов СБ34 на клетках лимфоцитарного гейта (см. рис. 2, 6) при культивировании без факторов выражена максимумом на 2-3-е сут и дальнейшим падением; а с факторами - двумя максимумами на 23-е и 10-е сут культивирования.
Совокупность полученных данных (см. рис. 6, а также рис. 1 и 2) обнаруживает 2-фазную экспрессию антигена СБ34 на предшественниках гранулоцитов и лимфоцитов при продолжительности фаз около 7 сут. Соотношение образующихся во 2-й фазе СБ34+-предшественников гранулоцитов и СБ34+-лимфоцитов составляет 4 к 1. В 1-й фазе обнаруживающиеся СБ34+-клетки скорее всего дифференцируются. Во 2-й фазе культивирования при корреляции со значительным падением концентрации дифференцирующихся РЪ+-клеток стимулируется пролиферация СБ34+-клеток. Пролиферация на 2-м этапе после 10 сут культивирования протекает, очевидно, благодаря активации перехода клеток из О0 в О: фазу клеточного цикла, которые в присутствии факторов роста частично дифференцируются с экспрессией антигенов СБ34, СБ33, СБ13, и СБ15 (миелоидные клетки) и СБ19 (В-лимфоциты). В отсутствии факторов роста СБ34+-клетки накапливаются и, по-видимому, снова консервируются в О0.
Концентрация СБ34+-предшественников миело-идных клеток существенно (примерно на порядок) увеличивается к 10-м сут (рис. 1 и 6). Далее в присутствии факторов она падает в 2 раза, что сопровождается существенно более активной, синхронной с антигеном СБ34, экспрессией антигенов СБ33, СБ15 и СБ11Ь, чем при отсутствие факторов (см. рис. 1). Это позволяет предполагать способность СБ34+-предшественников миелоидных клеток к пролиферации и, возможно, к дифференцировке на 2-м этапе их накопления (см. рис. 1 и 6).
Итак, в суспензионной культуре РЪ+-мононуклеаров ПК больного ХМЛ с мРНК Ь3а2 БСЯ/АБЬ после завершения основной части диффе-ренцировки и апоптоза дифференцирующихся по механизму миелопоэза РЪ+-клеток обнаруживается также пролиферация СБ34+-клеток с экспрессией антигена СБ34 на предшественниках гранулоцитов и лимфоцитов. Эти РЬ+СБ34+-клетки, вероятно, могут быть злокачественными лейкозными бластами с блоком дифференцировки (т.е. ЛСК), а также потомками ПСКК РЪ+ СБ34+-клеток или ПСКК РЪ" СБ34+-клеток. Накопление СБ34+-клеток во 2-й фазе культивирования происходит, как предполагается, в результате выхода этих клеток в клеточный цикл из О0 фазы при значительном уменьшении концентрации РЪ+-клеток в среде и активации факторами роста. Одновременная экспрессия антигенов СБ34 на предшественниках гранулоцитов и лимфоцитов в исследованных РЪ+-клетках может означать транслокацию и, возможно, дополнительную мутацию в их раннем предшественнике -
полипотентной стволовой кроветворной клетке (ПСКК) или ранее в гемопоэтической стволовой клетке.
Поскольку транслокация с образованием РЪ+-хромосомы и последующая мутация в РЪ+-клетках происходили не в их О0 фазе, а после выхода в клеточный цикл и после пролиферации клеток, то злокачественные лейкозные СБ34+-бласты должны пройти достаточно длинный путь до становления клона, даже если они возникли при хромосомной транслокации и сразу в единственной клетке СКК. Сравнение кинетики экспрессии антигенов (см. рис. 1 и 2) с кинетикой дифференцировки гранулоцитов и лимфоцитов по данным морфологии в тех же пробах (см. рис. 3 и 4) в сочетании с известной схемой экспрессии антигенов -биомаркеров, экспрессирующихся при гемопоэзе по [11] (см. рис.5), позволяет соотнести их между собой и четче идентифицировать этапы дифференцировки и экспрессии антигенов.
Низкая экспрессия антигена СБ34 на лимфоцитах при низкой экспрессия СБ19 и очень высокой экспрессии СБ3, соответствующих накоплению В- и Т-лимфоцитов, служит косвенным свидетельством неучастия предшественников Т-лимфоцитов в транслокации (т.е. Т-лимфоциты остаются РЪ"-клетками). Одновременное образование СБ34+-клеток, предшественников миелоидных клеток и лимфоцитов, хорошо известно при смешанном типе бластного криза ХМЛ, что встречается в 30 % случаев [3].
Согласно современным представлениям о механизмах прогрессии лейкозов формирование злокачественного этапа болезни происходит в результате образования, становления клона и функционирования лейкозных стволовых клеток (ЛСК). Образование этих клеток может протекать при хромосомных транслокациях, последующих мутациях и/или специфических изменениях генной регуляции клеток [16; 17; 21; 23; 25; 29-32].
В зависимости от вида хромосомной транслокации клон ЛСК возникает либо сразу из стволовой кроветворной клетки (СКК), либо поэтапно. Вначале возникают трансформированные клетки, сохраняющие способность к мультипотентному кроветворению, которые затем мутируют в ЛСК [30]. Б-РЪ+-клетки превращаются в клон ЛСК вследствие мутаций не только в стволовых клетках, но и в их специализированных потомках - полипотентных, коммитирован-ных предшественниках и даже в созревающих клетках [23; 21; 30]. При этом ЛСК подобно СКК способны к длительному самоподдержанию (посредством сохранения значительной доли клеток в О0 фазе клеточного цикла), но не способны к дифференцировке [23]. Ранее показано, что СБ34+-бласты при ХМЛ выходят в О0 /О1 фазу клеточного цикла значительно быстрее нормальных СБ34+-клеток КМ [33].
Полученных в работе данных однако недостаточно для выбора, являются ли СБ34+-клетки, накапливающиеся во второй фазе культивирования, злокачественными ЛСК или они наследуют способность СКК
к самоподдержанию благодаря исходной транслокации в СКК или ПСКК. Поэтому во второй фазе культивирования в ответ на значительное падение концентрации Б-РЪ+-клеток скорее всего начинается новый этап пролиферации самоподдерживающихся клеток, еще способных к дифференцировке в качестве наследников СКК, претерпевших транслокацию 1(9,22).
Кинетика экспрессии антигена СБ34 на предшественниках миелоидных клеток, лимфоцитов и их сумме (бластах) (см. рис. 6) позволяет выявить дополнительные свойства пролиферирующих во второй фазе культивирования СБ34+-клеток. Видно, что в 1-й фазе экспрессии (0-7 сут культивирования) пролиферация и дифференцировка всех СБ34+-бластов (предшественников миелоидных клеток, лимфоцитов и всех обнаруженных СБ34+-клеток) ускоряется и что ускорение зависит от цитокинов ИЛ-3 и Г-КСФ, регулирующих миелопоэз клеток-предшественников [4; 5; 12-14; 24]. Во 2-й фазе культивирования экспрессия антигена СБ34 свидетельствует о начале нового этапа пролиферации СБ34+-клеток. При этом в ответ на 510-кратное уменьшение концентрации всех Б-РЪ+-клеток (см. рис. 3) концентрация СБ34+-предшественников миелоидных клеток и всех СБ34+-клеток увеличивается к 10-м сут на порядок (см. рис.6). Далее количество первых СБ34+-клеток (мие-лоидных бластов) без факторов роста консервируется, а в присутствии факторов частично дифференцируется с экспрессией антигенов СБ33, СБ13, СБ 15, СБ 11Ь на более зрелых гранулоцитах, но лишь с 2-кратным уменьшением концентрации этих СБ34+клетках-предшественниках гранулоцитов и всех СБ34+-бластов. Отметим, что СБ34+-лимфоциты в отсутствии факторов роста пролиферируют в основном в 1-й фазе культивирования; их концентрация увеличивается всего в 3 раза (см. рис. 6, А); они дифференцируются с максимумом на 3-е сут до весьма низкой концентрации, которая далее, в том числе и во второй фазе, мало меняется (см. рис. 4, А, Б). В присутствии факторов максимум пролиферации и экспрессии антигена СБ34 смещается к 1-м сут (см. рис. 4 и 6). Во 2-й фазе к 10-м сут концентрация временно удваивается и к 14-м сут падает вновь, т.е. СБ34+-предшественники лимфоцитов делятся, увеличивая свою концентрацию в 3 раза и затем полностью дифференцируются во 2-й фазе культивирования, как и в
1-й (см. рис. 6).
Совокупность изложенных данных позволяют предположить, что во 2-й фазе культивирования функционируют иные СБ34+-предшественники мие-лоидных клеток, чем в 1-й. Эти клетки, вероятно, пролиферируют, выходят из О0 фазы клеточного цикла и являются самоподдерживающимися СБ34+-предшественниками гемопоэтических клеток, которые консервируются в отсутствии факторов роста, а в присутствии факторов частично дифференцируются в СБ34", СБ33+, СБ13+, СБ15+, СБ11Ь+-гранулоциты. СБ34+-предшественники лимфоцитов ПК данного ХМЛ таким свойством не обладают.
Известно, что лейкозные стволовые клетки быстрее выходят из G0 в Gi фазу клеточного цикла, чем СКК доноров. Они снова легко консервируются в G0 и стимулируют секрецию цитокинов [16; 24; 26; 30; 33]. То обстоятельство, что CD34+-6ласты способны активно пролиферировать с факторами роста в среде и без них (см. рис. 6, 2-я фаза), указывает на стимулирование в этих клетках секреции цитокинов, концентрации которых, возможно, недостаточно для последующей полной дифференцировки. Замедленная пролиферация CD34+-клеток только в конце культивирования и то, что CD34+-предшественники миелоидных клеток 2-го этапа пролиферации дифференцируются не полностью, является единственным указанием на то, что они могут быть ЛСК или их промежуточной формой, способной к самоподдержанию и стимуляции аутокринной секреции факторов роста, необходимых для самоподдержания, но еще сохраняющие в какой-то степени способность к дифференцировке.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучена кинетика экспрессии 8 антигенов (CD34, CD33, CD15, CD14, CD13, CD 11b, CD3 и CD19) при культивировании Ph+BCR/ABL+-клеток, образующихся при хромосомной транслокации t(9,22) при хроническом миелолейкозе в сравнении с кинетикой диффе-ренцировки, тестируемой по морфологии клеток. При 14-сут культивировании in vitro Ph+BCR/ABL+-мононуклеаров периферической крови больного ХМЛ с мРНК b3a2 BCR/ABL, кроме дифференцировки и созревания клеток по схеме, характерной для миелопоэза при ХМЛ, идентифицирована также 2-фазная пролиферация CD34+-предшественников миелоидных клеток и лимфоцитов. Активное накопление CD34+-клеток происходит в конце культивирования Ph+-мононуклеаров при значительном уменьшении их концентрации в результате дифференцировки и апоптоза. Образование значительного количества CD34+-клеток в конце культивирования объясняет 2-й этап активации пролиферации Ph+-клеток и роста индекса P/D.
Кинетика экспрессии антигена CD34 и других исследованных антигенов имеет двухфазный характер с существенной активацией экспрессии антигенов в том числе в конце культивирования, что коррелирует с 2-этапной пролиферацией клеток, определяемой по морфологии, и указывает на дифференцировку CD34+-клеток на 1-м этапе и активацию их пролиферации на
2-м (7-14 сут). Пролиферация CD34+-клеток, состоящих преимущественно из CD34+-предшественников миелоидных клеток, происходит, как предполагается, в результате выхода CD34+-клеток из G0 фазы клеточного цикла с последующей частичной дифференци-ровкой в присутствии цитокинов и консервацией в G0 без них. Одновременная экспрессия антигенов CD34 на предшественниках миелоидных клеток и лимфоцитов в исследованных Ph+-мононуклеарах указывает на хромосомную транслокацию t(9,22) у данного больного ХМЛ в раннем предшественнике - полипотентной стволовой клетке или даже ранее.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абрамов М.Г. Гематологический атлас. - М.: Медицина, 1985. - 344 с.
2. Ахлынина Т.В., Герасимова Л.П., Саркисян Г.П. и др. Кинетика пролиферации, дифференцировки и транскрипции генов, регулирующих апоптоз, BCR/ABL+Ph+-клеток человека в культуре in vitro // Цитология. - 2007. -Т. 49, № 8. - в печати.
3. Барышников А.Ю., Кадагидзе Э.Г., Махо-нова Л.А., Тупицин Н.Н. Иммунологический фенотип лейкозной клетки. - М.: Медицина, 1989. - 240 с.
4. Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. Роль ростовых факторов в регуляции кроветворения // Гематология и трансфузиология. - 2000. - Т. 45, № 6. - С. 6-8.
5. Владимирская Е.Б. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста. В кн.: Биологические основы противоопухолевой терапии. - Агат-Мед, 2001. - С. 5-32.
6. Руководство по гематологии. - Под ред. А.И. Воробьева. - М.: Ньюдиамед, 2002. - Т. 1. - 280 с.
7. Герасимова Л.П., Манакова, Т.Е., Ахлынина и др. Экспрессия онкогена BCR/ABL и р53-индуцированный апоптоз в суспензионных культурах гемопоэтических Ph+ клеток при хроническом миело-лейкозе // РБЖ. - 2002. - Т. 1, № 4. - С. 29-38.
8. Козинец Г.И., Котельников В.М. Кинетика гемопоэза и ее клиническое значение //Советская медицина. - 1983. - № 4. - C. 73-7.
9. Котельников В.М., Козинец Г.И., Касаткина
B.В., Ковалевская Н.П. Кинетика гранулоцитопоэза. В кн.: Кинетические аспекты гемопоэза. - Томск: Издание Томского Государственного университета, 1982. -
C. 149-211.
10. Луговская С.А., Почтарь М.Е., Тупицин Н.Н. Фенотипирование в диагностике гемобластозов. - М., Тверь: Триада, 2005. - 166 с.
11. Маркина И.Г., Тупицин Н.Н., Андреева Л.Ю. Использование иммунофенотипирования для совершенствования диагностики и прогнозирования результатов терапии острых и лимфобластных лейкозов // РБЖ. - 2002. - Т. 1, № 1. - С. 3-13.
12. Натан Д.Г., Зифф К.А. Регуляция кроветворения // Гематология и трансфузиология. - 1994. - Т. 39, № 2. - С. 3-10.
13. Патофизиология крови. - Под ред. Шиффман Ф.Д . - BINOM Publishers, 2000. - 446 с.
14. Чертков И.Л., Дризе Н.И. Взлет и падение гематологии за % века //Гематология и трансфузиология. - 2001. - Т.46(3). - С. 10-4.
15. Bedi A., Barber J.P., Bedi G.C. et al. Inhibition of apoptosis by BCR-ABL in CML // Blood. -1995. -Vol. 86. - P. 148-58.
16. Buckle A.M., Mottram R., Pierce A. et al._The effect of Bcr-Abl protein tyrosine kinase on maturation and proliferation of primitive haematopoietic cells // Mol. Med. - 2000. - Vol. 6(10). - P. 892-902.
17. Coppo P., Bonnet M.L., Dusanter-Fourt I. et al. Constitutive and specific activation of STAT3 by BCR-ABL in embryonic stem cells // Oncogene. - 2003. - Vol. 22(26). - P. 4102-10.
18. Deininger V.N., Vieira S., Mendiola R. et al. BCR/ABL tyrosine kinase activity regulates the expression of multiple genes implicated in the pathogenesis of chronic myeloid leukemia // Cancer Research. - 2000. -Vol. 60. - P. 2049-55.
19. Era T., Witte O.N. Regulated expression of P210 Bcr-Abl during embryonic stem cell differentiation stimulates multipotential progenitor expansion and myeloid cell fate // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol. 97. - P. 1737-42.
20. de Groot JR., Raaijmakers P.A.M., Lammers J-W.J. et al. STAT5 Activation by BCR-Abl Contributes to Transformation ofK562Leukemia Cells //Blood. - 1999.
- Vol. 94. - P. 1108-12.
21. Guzman M.L., Jordan C.T. Considerations for targeting malignant stem cells in leukemia //Cancer Control. - 2004. - Vol. 11(2). - P. 97-104.
22. Jaiswal S., Traver D., Miyamoto T. et al. Expression of BCR/ABL and BCL-2 in myeloid progenitors leads to myeloid leukemias // Proc.Nat. Acad. Sci. USA. -2003. - Vol. 100. - P. 10002-7.
23. Jamieson C.H.M., Ailles L.E., Dylla S.J. et al. Granulocyte-macrophage progenitors as candidate leukemic stem cells in blast crisis CML // New England J. Medicine. - 2004. - Vol. 354. - P. 657-67.
24. Holyoake T.L., Jiang X., Jorgensen H.G et al. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3 // Blood. -2001.
- Vol. 97. - P.720-8.
25. Holyoake T.L., JiangX., Eaves, A.C., Eaves C.J. Elucidating critical mechanisms of deregulated stem cell turnover in the chronic phase of chronic myeloid leukemia // Leukemia. - 2002. - Vol. 16. - P. 549-58.
26. Lotem, J., Sachs, L. Control of apoptosis in hema-topoiesis and leukemia by cytokines, tumor suppressor and oncogenes // Leukemia, - 1996. - Vol. 10 - P. 925-31.
27. Melo J.V. The diversity of the BCR-ABL fusion proteins and their relationship to leukemia phenotype // Blood. - 1996. -Vol. 88. - P. 2375-84.
28. Morioka E., Taniguchi S., Okamura S. et al. Purification of a granulocyte colone-stimulating factor from the conditioned medium of a subclone of human bladder carcinoma cell line 5637, HTB90 // Res.Exp. Med. -1990. - Vol.190 (4). - P. 229-38.
29. Niwa H., Burdon T., Chambers I., Smith A. Selfrenewal of pluripotent embryonic stem cells via activation of STAT3 // Genes & Development. - 1998. - Vol.12. -P. 2048-60.
30. Passegue E., Jamieson C.H.M., Ailles L.E., Weissman I.L. Normal and leukemic hematopoiesis: Are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? //Proc.Nat. Acad.Sci.USA. - 2003. -Vol. 100. - P. 11842-9.
31. Shuai K, Halpern J., ten Hoeve J. et al. Constitutive activation of STAT5 by the BCR/ABL oncogene in chronic myelogenous leukemia //Oncogene. - 1996. -Vol. 13(2). - P. 247-54.
32. Sillaber C., Gesbert F., Frank D.A. et al. STAT5 activation contributes to growth and viability in Bcr/Abltransformed cells // Blood. - 2000. - Vol. 95. - P. 2118-25.
33. Traycoff C.V., Haistead B., Rice S. et al. Chronic myelogenous leukaemia CD34+cells exit G0/G1 phases of cell cycle more rapidly than normal marrow CD34+cells // Brit. J. Haetmatology. - 1998. - Vol. 102(3). - P. 759-67.
34. Turkina A.G., Baryshnikov A.Yu., Sedyakhina N.P. et al. Studies of P-glycoprotein in chronic mye-logtnjus leukaemia patients: expression, activity fnd corrlations with CD34 antigen // Brit. J. Haematology. -1996. - Vol. 92. - P. 88-96.
Поступила 17.11.2006.
