CC BY
52
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 616-006.446.8-092.4:616-091.818:616.155.34:576.385.5
Т.В. Ахлынина, Н.И. Гринева, Л.П. Герасимова, Т.Е. Манакова, Д.А. Шмаров, Т.Г. Сарычева, А.М. Тимофеев,
Н.М. Найденова, Т.В. Боровкова, Г.П. Саркисян, А.Р. Гавричкова, Л.Ю. Колосова, Т.И. Колошейнова,
Л.Г. Ковалева, А.В. Воронцова, А.Г. Туркина
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ Ph+КЛЕТОК ОТ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ БОЛЬНЫХ ХМЛ В СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЕ.
Ph+КЛЕТКИ С НИЗКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ ПРОЛИФЕРАЦИИ И СПОСОБНОСТЬЮ БЛОКИРОВАТЬ АПОПТОЗ
Г ематологический научный центр РАМН, Москва
Контактная информация:
Гринева Нина Ивановна, д-р хим. наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории генной инженерии адрес: 125167, Москва, Новозыковский проезд, 4а; тел.: +7(499)615-31-02; e-mail: nigrin27@mail.ru
Статья поступила: 19.06.2010, принята к печати 01.04.2010.
Резюме
Ранее выявлены 3 типа Ph+клеток от разных больных ХМЛ, которые отличаются эффективностью пролиферации и дифференцировки, скоростями накопления пролиферирующих и созревающих без деления клеток [7]. Здесь исследована пролиферация и дифференцировка Ph+ клеток 2 типа. Она протекает с низкой эффективностью P/D < 1 и скоростью созревания большей, чем скорость пролиферации. Доля Ph+ клеток в фазах клеточного цикла S+G2/M менее 20^40%. Пролиферация и дифференцировка Ph+клеток 2 типа сопровождается блокированием апоптоза и значит+ельным накоплением нейтрофилов, особенно сегментоядерных, существенным ингибированием пролиферации Ph+ клеток созревающими нейтрофилами и пониженным содержанием миелоцитов. Блокирование апоптоза и накопление нейтрофилов происходят асинхронно накоплению миелоцитов, но синхронно ингибированию пролиферации. При этом происходит инверсия первоначального порядка (последовательности) накопления созревающих нейтрофилов (М>ММ>ПЯ>СЯ в СЯ>ПЯ>ММ>М), что ведет к накоплению всех нейтрофилов и постепенному изменению содержания каждого из них. Эти свойства Ph+ клеток 2 типа определяют клеточную регуляцию пролиферации и дифференцировки Ph+ клеток 2 типа с ингибированием пролиферации и поэтапным тор-мо+жением созревания самих нейтрофилов, вероятно+, по механизму обратной связи. Кривые роста популяции Ph+ лейкоцитов 2 типа не отражают пролиферации Ph+ клеток. Рост клеточности лейкоцитов связан с увеличением содержания созревающих нейтрофилов из-за блокирования их гибе+ли, низкой эффективностью пролиферации, превышением скорости созревания над скоростью пролиферации. Ph+ клетки 2 типа составляют треть от исследованных образцов Ph+клеток; все из них от больных ХМЛ в хронической фазе (ХФ).
Ключевые слова: культивирование гемопоэтических Ph+лейкоцитов (мононуклеаров), Ph-хромосома, ХМЛ, кинетика пролиферации, дифференцировки, апоптоз Ph+клеток in vitro, распределение Ph+клеток по фазам клеточного цикла, пролиферации и Ph+клеток, регуляция клеточной пролиферации и дифференцировки созревающими нейтрофилами.
T.V. Akhynina, N.I. Grineva, L.P. Gerasimova, T.E. Manakova, D.A. Schmarov, T.G. Sarycheva, T.V. Borovkova,
N.M. Naydenova , G.P. Sarkisyan, A.M. Tumofeev, L.Yu. Kolosova, T.I. Kolosheynova,
L.G. Kovaleva, A. V. Voronzova, A.G. Turkina
DIFFERENCES IN PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF Ph+CELLS FROM INDIVIDUAL CML PATIENTS IN THE SUSPENSION CULTURE.
Ph+CELLS WITH LOW PROLIFERATING EFFICIENCY AND ABILITY OF APOPTOSIS ARREST
GU Research Center for Hematology of RAMS, Moscow
Abstract
Three types of Ph+cells from individual CML patients have been detected by studying kinetics peculiarities of their proliferation and differentiation in the culture [7]. Here we have studied the proliferation and differentiation of type 2 Ph+cells that reveal low proliferating P/D efficiency and higher rate for accumulation of neutrophiles maturated without dividing. P/D index is ratio between rates for P and D cells accumulations. Proliferation and differentiation of type 2 Ph+cells reveal P/D index 0,2-1, number of cycling cells into cycle phases S+G2/M was below 20^45%. The proliferation and differentiation of Ph+ type 2 cells is accompanied by apoptosis inhibition and significant accumulation of neutrophils, particularly high segment neutrophils, we have also observed the reduced proliferation of Ph+ cells and low content of myelocytes. Apoptosis blocking and maturated neutrophiles accumulation occur anisochrous myelocytes accumulation but synchronously proliferation inhibition. This results in neutrophils primary consistency inversion myelocytes (M) > metamyelocytes (MM) > band neutrophiles (BN)> segment neutrophieles (SN) into SN > BN > MM > M, which lead to accumulation of al types neutrophils. These peculiar properties of Ph+ type 2 cells determine the cells proliferation and differentiation +in parallel with inhibition of neutrophils maturation. We suggest this take place by feed back mechanism. The curves of Ph+ type 2 leukocytes population accumulating do not reflect the proliferation rate of Ph+ type 2 leukocytes. The increas+ed level of these cells we link with the increasing number o+f maturated neutrophils and their non-efficient proliferation. Ph+ type 2 cells account for one-third fraction of investigated Ph+ cells. We have derived all of cells from patient with CML in a quite phase.
Key words: cultiv+ation of hematopoietic Ph+leu+kocytes, chronic myeloid leukemi+a, kinetics of differentiation and apoptosis in vitro, Ph+cells in culture, cycling of Ph+cell distribution in cell phases, Ph+cell proliferate and differentiate efficiency, regulation of cell proliferation by matured cells.
Ранее с помощью кинетического подхода к исследованию ПД Ph+ клеток при ХМЛ ex vivo обнаружено, что у разных больных ХМЛ встречаются три типа Ph+клеток, отличающихся характеристиками пролиферации и созревания. Различия обнаруживаются в относительных скоростях пролиферации и созревания, в индексах эффективности P/D, в отношении к апоптозу и продолжительности поддержания данных условий при ПД Ph+клеток каждого типа. Ph+ клетки от разных больных, попадая в одинаковые условия суспензионной культуры и будучи изолированными от клеточного окружения in vivo, различаются регуляцией ПД. Эго означает, что Ph+ клетки от больных ХМЛ наследуют и воспроизводят в культуре функции исходных клеток от больных ХМЛ с особенностями их регуляции при участии онкогена bcr/abl, кодирующего тирозинкиназу р210. Последние, как известно для клеточных линий, активируют пролиферацию Ph+клеток, изменяют многие пути сигнальной трансдукции, осложняют регуляцию кроветворения и приводят к лейкозам: ХМЛ, ОМЛ и ОЛЛ [1; 5; 10; 12; 13; 17; 19-21; 23-33; 40]. Именно bcr/abl и р210 определяют туморогенность+, активацию пролиферации и блокирование апоптоза Ph клеток на клеточных линиях [12-14; 18; 21; 23; 30; 33; 36; 37; 39]. В работах [15; 16; 25; 35-37; 39] исследована роль разных мутантов р210 в клеточной пролиферации, туморогенности и апоптоза Ph+клеток, полученных трансфекцией генноинженерными конструкциями с различными мутациями в онкогене bcr/abl.
Совокупность этих данных предполагает, что многообразие ХМЛ по диагностике, симптомам, отношению к терапии связано с вариациями структуры и функций онкогена bcr/abl и его продукта □ тирозин-киназы р210, и что эти вариации, вероятно, отражаются в типах Ph+клеток и их ПД в культуре. С целью приблизиться к решению этой задачи мы в данной работе изучили кинетику ПД в культуре Ph+клеток 2 типа и роль созревания нейтрофилов с низкой эффективностью пролиферации в регуляции ПД.
Материалы и методы
Материалы и методы детально приведены в предыдущей статье [7].
Использованы материалы: гепарин (Flow, Англия); Limphoprep, среда а-МЕМ (MP Biomedical, США); DEPC, Hepes, Трис, PBS, эмбриональная бычья сыворотка (ЭБС), цитрат Na , лаурилсаркозил (ICN, США); краситель трипановый синий, L-глутамин и 2-мерка-птоэтанол (Serva, Германия), пенициллин и стрептомицин (ОАО «Биохимик»] Саранск, Россия); Г-КСФ (F. Hoffmann-La Roche Ltd, Франция); PBS (10мМ фосфатный буфер + 0,13 М NaCl + 2,7 мМ KCl, pH 7,4) таб-летированный, НПЦ «Эко-сервис I» Россия.
Исследовали Ph+ мононуклеары 2 типа выделенные из ПК и КМ от больных ХМЛ в ХФ д+о лечения и в процессе лечения. Характеристики Ph+клеток и больных ХМЛ, из ПК и КМ которых получены мо-нонуклеары, даны в [7]. В Ph+ клетках определены типы мРНк bcr/abl: b3a2, b2a2 или e1a2 с помощью метода RT-PCR как указано в [2]. Ph+мононуклеары из ПК и КМ больных ХМЛ получали, анализировали и культивировали как указано в [7].
Цитофлуориметрический анализ кинетических кривых апоптоза и распределения Ph+клеток в фазах клеточного цикла при культивировании Ph+клеток детально описан в сообщении I [7]. Измерения проводили в проточном флуориметре EPlCS-XL. Клетки грануло-цитарного гейта анализировали с помощью прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния и одновременно регистрировали флуоресценцию FL2 пика по ампли-
туде и площади импульса (это позволяло отсекать слипшиеся клетки, конгломераты и обрывки клеток) в линейном и логарифмическом масштабе, определяя клетки в апоптозе. К клеткам, вышедшим в апоптоз, относили FL2-H частицы с гиподиплоидным набором ДНК. Долю гранулоцитов, находящихся в апоптозе, определяли для клеток, анализируемых в гранулоци-тарном гейте, где отсутствуют обрывки клеток. В тех же пробах Ph+клеток получали ДНК-гистограммы и в них анализировали распределение клеток по фазам клеточного цикла (S, G2/M). +
Кинетические кривые пролиферации Ph+лейкоци-тов (кривая роста популяции Ph+клеток □ в основном мо-нонуклеаров) и их гибели получали согласно концентрации живых и мертвых клеток, которую и вычисляли по доле клеток при концентрации 106 клеток/мл.
Кинетические кривые дифференцировки
Ph+лейкоцитов и их субпопуляций: миелоидных клеток, лимфоцитов, гранулоцитов, и субпопуляций гра-нулоцитов: бластов, промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов строили, вычисляя концентрацию соответствующих клеток в пробах по их доле, определяемой по морфологии на мазках, на 10б клеток/мл. Детали см.[7]. Ошибка определения ± 5П11%. Кроме морфологии Ph+клетки от ХМЛ № 1.1 и № 2.6 идентифицировали по экспрессии антигенов CD с набором моноклональных антител как указано в работе [б], где приведены результаты идентификации и кинетики экспрессии антигенов. Результаты определений по экспрессии антигенов и морфологии совпадают.
Индекс эффективности P/D определяли как соотношение скоростей накопления клеток P, пролиферирующих c дифференцировкой, и клеток D, дифференцирующихся без деления, определяли по [7].
Результаты и обсуждение
Согласно [7] Ph+клетки разных больных ХМЛ представлены 3 типами, пролиферация и дифференци-ровка (ПД) которых в культуре отличается эффективностью, а также соотношением скоростей пролиферации клеток P и созревания нейтрофилов, клеток D. Ph+клетки
1 типа пролиферируют с высокой эффективностью, и больные ХМЛ с такими клетками предрасположены к быстрой прогрессии ХМЛ [7]. Повышенная эффективность пролиферации этих клеток при ПД согласуется с активной экспрессией онкогена bcr/abl, однако при этом нет ареста апоптоза [2; 7], который при ХМЛ по многим данным следовало бы ожидать [19-22; 31; 32; 35; 39]. Ко
2 типу отнесены Ph+клетки, ПД которых происходит с большей скоростью созревания (накопления созревающих без деления нейтрофилов, D клеток), чем скорость пролиферации (накопления пролиферирующих клеток Р), и с низким индексом эффективности P/D<1, при продолжительности этих условий ~ 5-9 сут [7]. Это видно по различиям в кинетических кривых ПД Ph+клеток (рис. 1 -5, а-г соответственно). ПД клеток 2 типа по продолжительности сопоставима с циклом дифференциров-ки гемопоэтических клеток [8; 9; 38]. Клетки 2 типа были выделены из 9 образцов ПК и/или КМ больных ХМЛ в хронической фазе. Они составили ~ треть исследованных образцов Ph+мононуклеаров от больных ХФ ХМЛ [7]. Лейкоциты рассматривались и анализировались как клетки, составляющие основную часть Ph мононуклеа-ров при ХМЛ [1; 5; 10]. Субпопуляции лейкоцитов включали миелоидные клетки, гранулоциты, лимфоциты, моноциты; cубпопуляции гранулоцитов □ бласты, промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты (ММ), ПЯ и СЯ нейтрофилы; пролиферирующие клетки Р - бласты + промиелоциты + миелоциты.
Созревающие клетки D включали ММ + ПЯ + СЯ. В данной работе, кроме перечисленных, анализировали кинетические кривые апоптоза и распределения Ph+ клеток в фазах клеточного цикла. Характеристика образцов Ph+ клеток 2 типа (мононуклеаров) из КМ и ПК от больных ХФ ХМЛ даны в [7].
Сопоставление закономерностей кривых роста популяции лейкоцитов, дифференцировки лейкоцитов и гранулоцитов, у которых скорость созревания больше, чем скорость пролиферации при низком индексе эффективности P/D<1 (рис. 1-5; табл.) показывает, что значительный рост клеточности лейкоцитов в 1,5-4 раза происходит не за счет активной пролиферации клеток, а за счет накопления в значительных концентрациях нейтрофилов, созревающих без деления, особенно СЯ. Нейтрофилы накапливаются при блокировании апоптоза и очень низком содержании пролиферирующих клеток и миелоцитов в том числе, т.е. популяция лейкоцитов увеличивается при ингибировании пролиферации Ph+клеток с уменьшением скорости и эффективности пролиферации по сравнению со скоростью созревания. Это означает, что при блокировании апоптоза нейтрофи-лы накапливаются в избытке, уменьшают скорость пролиферации и ингибируют пролиферацию клеток, из которых сами образуются, а также тормозят диф-ференцировку самих нейтрофилов в ряду СЯ, ПЯ и ММ при их значительной концентрации, вероятно, по механизму обратной связи.
Рассмотрим эти события на конкретных примерах. ПД Ph+клеток 2 типа протекает с низкой эффективностью - индексом P/D < 0,2-1 и со скоростью накопления нейтрофилов, созревающих без деления, D [зрелых], большей, чем скорость пролиферирующих Ph+клеток, P [незрелых]. Эффективность ПД - индекс P/D (соотношение скоростей накопления клеток пролиферирующих P и клеток D, созревающих без деления) колеблется от 0,2 до 1,6. Индексы P/D< 0,2-1, большие скорости созревания и следовательно повышенные концентрации нейтрофилов ([з] > [нз]) (см. рис. и табл.) сохраняются длительное время (5-9 сут) и по продолжительности сопоставимы с циклом дифференциров-ки функционирующего субклона гемопоэтических клеток, как и при ПД Ph+клеток 1типа [7].
В начале культивирования в некоторых случаях на короткое время P/D больше 1. По мере накопления нейтрофилов и выяснения неспособности данных Ph+ клеток к апоптозу P/D быстро снижается до 0,5-1,0 (рис. 2,2; 2,4 и 2,7). Это связано с отсутствием или низким содержанием нейтрофилов в свежевыделенных мононуклеарах. Падение P/D наблюдается при накоплении СЯ и нейтрофилов, а рост P/D - при расходовании СЯ (рис. 2,1г; 2,2г; 2,3в; 2,4б, в; 2,5б-в; результаты для образцов Ph+клеток № 2,6 и 2,7 в табл.). На этих рисунках видно, что концентрация созревающих клеток существенно выше, чем пролиферирующих незрелых. По ходу кинетических кривых скорости накопления и концентрации зрелых и незрелых клеток, как и индекс эффективности P/D, постоянно изменяются.
Отметим, что Ph+клетки ХМЛ № 2.7 с P/D = 1,5 для клеток из КМ и ПК и 0,5 для цельной ПК в нулевой момент ПД отнесены к 2 типу условно на основании характера кривой роста и гибели клеток (см. рис. 5г). На кривых видно накопление зрелых, временная активная гибель клеток с последующим характерным скачкообразным торможением пролиферации нейтро-филами. Кривая роста популяции Ph+клеток из КМ на 2 сут подавляется при гибели 18 % (мах на 1 сут), гибели 2-3% на 2-8 сут и 13 % на 9 сут.
Далее видны 2 максимума гибели клеток на 3 и 7 сут с минимумом на 4 сут. Рост Ph+клеток из ПК ингибирован при подавлении гибели до 7-8 сут. Возможность реализации 3 типа Ph+клеток не исключена при длительном периоде ПД 2 типа.
Пролиферация Ph+клеток 2 типа Из кривых пролиферации Ph+лейкоцитов и их дифференцировки (см. рис. 1-5; табл.) видно значительное увеличение концентрации клеток - от 1,5 до 4 крат. Однако увеличение клеток происходит не только в результате пролиферации клеток. Согласно кинетическим кривым дифференцировки основное увеличение клеточной массы определяет накопление нейтрофилов, созревающих без деления (см. рис. 1-5).
Основна+я характеристика пролиферации - распределение Ph+гранулоцитов 2 типа по фазам клеточного цикла (S+G2/M) показывает, что их распределение изменяется по ходу ПД, оно зависит от источника Ph+клеток - больного ХМЛ. То, что доля пролиферирующих Ph+клеток в фазах S+G2/M < 20 - 40 % а в G2/M фазах ~ 15 % видно на рис. 2,1 в, 2,2 г.
Другой показатель активности пролиферации -отношение S/(G2+M) равен 1,2. Видно, что максимальная доля клеток в S+G2/M фазе достигает 43 % а в S фазе ~ 30 % на 1 сутки и быстро понижается до 12 %. Индекс P/D при этом 0,6-0,8 (рис. 2,2 в). Доля пролиферирующих клеток на рис.2 близка таковой Ph+ клеток 1 типа [7] ). Однако длительность существования повышенной доли клеток в фазах S+G2/M у Ph+клеток 2 типа оказывается значительно короче (падает через
1 сут), чем при активной пролиферации Ph+клеток 1 типа. Доля последних в фазах S+G2/M > 43% поддерживается почти 6 сут. При этом отношение S/(G2+M) ~ 2,4-2,7 и индекс эффективности P/D 1,2-1,6. Это для ПД Ph+клеток 2 типа означает преимущество созревания над пролиферацией, которую подавляют нейтрофилы, скорость созревания которых оказывается выше скорости пролиферации.
Отметим, что при культивировании доля активно пролиферирующих злокачественных клеток К562, производных БК ХМЛ, в фазах S+G2/M достигает 44±3 % и мало изменяется в течение 7 сут, а отношение S/(G2+M) достигает 4,4 (результаты публикуются отдельно). Колебания доли пролиферирующих клеток отмечена ранее при острых лейкозах [11].
Несмотря на ингибирование пролиферация Ph+клеток 2 типа на 1-2 сут заметно активируется, затем уменьшается (на 3-5 сут). На границе 1 и 2 циклов ПД (на 6-8 сут) вновь наблюдается вторая, но более слабая активация пролиферации (рис. 3г, 4а). Перед второй активацией пролиферации на кривой (рис.3 в) видно значительное уменьшение концентрации всех клеток (незрелых и зрелых, миелоцитов и СЯ) и рост индекса P/D.
Итак, ПД Ph+клеток 2 типа характеризуется низким индексом P/D < 1 и содержанием пролиферирующих Ph+клеток в фазах клеточного цикла S+ G2/M < 20-40 % с укороченной продолжительностью пролиферации (менее 2-3 сут).
Дифференцировка Ph+клеток, апоптоз и накопление сегментоядерных нейтрофилов Кинетические кривые дифференцировки Ph+лей-коцитов показывают ~ 80% содержание гранулоцитов, но миелоцитов в их субпопуляциях не более 25 %. Содержание зрелых нейтрофилов, особенно СЯ (рис. 1-5), весьма велико. В процессе дифференцировки СЯ активно накапливаются и мало расходуются.
Дифференцировко
Время, сут
-Ph+лейкоциты------грану лоциты
-Миелоциты —•—Лимфоциты
Время, сут
-Миелоциты -Палочкоядерные -Бласты
- Сегменто ядерные
- Метамиелоциты
- Промиелоциты
Апоптоз и распределение по е клеточного циклл, ПК
Индекс P/D
Время, сут -Апоптоз —•—S
-G2M —S+G2 М
Время, сут -зрелые V незрелые
-PJD (н/з)
Рис. 1. Кинетические кривые дифференцировки Ph+ мононуклеаров ПК от ХФ ХМЛ № 2Д в культуре. Дифференцировка субпопуляций лейкоцитов (а), гранулоцитов (б), распределение гранулоцитов по фазам клеточного цикла и апоептоз гранулоцитов (в), индекс эффективности Р/D (г), накопление пролиферирующих клеток (Р [нз]), и нейтрофилов, созревающих без деления (D [з]), (г).
Днффе|>енцн|>0вк.| ленкоціїїов, КМ
Время, сут
-Ph+лейкоциты -----Гранулоциты
-Миелоциты —■—Лимфоциты
Индекс P D, KM Є
РЮ
Время, сут
-Миелоициты
-Се ПУЛЄНТО ядерные
-Промиелоциты
- м е т а м и е л о цм т ь і -Палочкоядерные -Бласты
Апоптоз и распределение по фазам клеточного иркла, НМ
Є
0J !■=: сч
5-
■П
е-
л ¥г
Л
£
■Незрелые ■ Р/D (н/з)
Время, сут
—й—Зрелые
Время, сут
-S + G2/M -G2/M
-S
-апоптоз
Рис. 2. Кинетические кривые дифференцировки Р1і+мононуклеаров из КМ от ХФ XMJ1. № 2,2 в культуре. Лейкоциты и гранулоциты (а б), индекс эффективности Р/D (в), накопление пролиферирующих клеток и созревающих нейтрофилов (в), распределение гранулоцитов в фазах клеточного цикла и апоптоз гранулоцитов (г).
Росї И гиоель ЛЄЙКОЦИТОВ КМ и ПК
Дифференцировка лейкоцитов ПК
Рост и гибель лейкоцитов КМ и ПК %
Время , сут
-Ph+лейкоциты КМ Ph+лейкоциты ПК
-Мертвые клетки КМ %—•—Мертвые клетки ПК %
Диференцировка гранулоцитов ПК 9
Время, сут
-Ph+лейкоциты-------гранулоциты
-Миелоциты » Лимфоциты
Индекс Р D
—живые КМ ♦ -живые ПК
—х—мертвые КМ,% —х—мертвые ПК%
Индекс PJD в
1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
э-
х
щ-
Время, сут
-Миелоциты • Се гтиенто ядерные
-Палочко ядерные о метамиелоциты
- Бласты » Промиелоциты
-зрелые
-Р£>
Время, сут
о незрелые
Время, сут -с;—незрелые -
Дифференщіровка
£
X
&
Время, сут -Се гменто ядерные —*—Миелоциты -Метамиелоциты —о—Палочко ядерные -Бласты т Промиелоциты
Рост и гибель лейкоцитов от 2 ХМЛ Н« 2.7
0,9
-РЮ _■
Время, сут
^Ph+ лейкоциты ПК и Ph+ лейкоциты КМ мертвые ПК, % —ж—мертвые КМ, %
Время, сут
—Ph+лейкоциты —Промиє лоциты+мт
— гранулоциты * Лимфоциты
—мертвые
Дифференцировал Q
гранулоцитов ПК
Время, сут
Промиелоциты+миелоциты » сегменто ядерные —о— палочкоядерные
—метамиелоциты
-Бласты
Индекс P.*D
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-незрелые -РЮ (н/з)
Время, сут —д—зрелые
Рис. 4. Кинетические кривые роста числа и гибели РИМононук- Рис. 5. Кинетические кривые роста числа и гибели (а, г) P1i+mo-леаров из ПК (а) от ХФ ХМЛ № 2,4 и дифференцировки субпо- нонуклеаров из КМ и ПК от ХФ ХМЛ № 2,5 и дифференцировки пуляций мононуклеаров из ПК в культуре (б г). гранулоцитов из ПК (б) в культуре.
Дифференцировка лейкоцитов и гранулоцитов (б, в), индекс эф- Индекс эффективности Р/D, накопление пролиферирующих кле-фективности Р/D (г), накопление пролиферирующих клеток и ток и созревающих нейтрофилов (в). Рост и гибель лейкоцитов нейтрофилов, созревающих без деления (г). от ХМЛ № 2,7 (г).
Рис. 3. Кинетические кривые дифференцировки Ph мононуклеаров из ПК от ХФ ХМЛ № 2,3 в культуре. Лейкоциты и гранулоциты (а б), индекс эффективности Р/D, накопление пролиферирующих клеток и созревающих нейтрофилов (в).
Максимальная концентрация СЯ в 2 раза больше, чем миелоцитов (см. рис. 1б, Зб-в; табл.). Это дополнительно указывает на роль зрелых клеток, особенно СЯ, в регуляции ПД Ph+ гранулоцитов 2 типа. Характеристики клеток 2 типа (см. табл.) свидетельствуют о повышенном в отдельных случаях отношении бластов к миелоцитам (Б/М) в 20 раз (0,01-0,21). Соотношение [СЯ]/[М], обычно малая величина, при ПД клеток 2 типа увеличивается, становится более единицы и тоже демонстрирует накопление СЯ нейтрофилов, синхронное ингибированию накопления миелоцитов.
Накопление зрелых по определению падает в ряду СЯ>ПЯ>ММ [10]. Их максимальное накопление на 2 или 4 сутки (рис. 2, 1 б, г; 2.4 в-г) соответствуют минимальному накоплению миелоцитов и низкому индексу P/D. На рис. 1-З виден рост индекса P/D при уменьшении на 4-е сут концентрации нейтрофилов. Содержание миелоцитов составляет при этом всего ~1/4 от всех Ph+лейкоцитов, приближая его к содержанию каждого из нейтрофилов или ниже.
На рис. 1б-в; Зб-в; .4 в, г видно, что при 2 типе дифференцировки Ph+ клеток СЯ нейтрофилы способны накапливаться отдельным пиком с максимумом на 2-6 сутки (при [СЯ] > 0,2 -0,3^106/мл)), которому соответствует низкий апоптоз и минимум накопления миелоцитов (рис. 1б-в). При этом кривая накопления миелоцитов прерывается на время значительного накопления СЯ (максимум на 2 сут), а индекс P/D, как следствие, понижается. При этом пролиферация миелоцитов подавлена до тех пор, пока не снизится концентрация СЯ в результате апоптоза, что наблюдается по согласующимся по времени кинетическим кривым расходования СЯ и роста апоптоза гранулоцитов (или общей гибели Ph+клеток). После гибели значительной части СЯ закономерность накопления популяции миелоцитов восстанавливается, а индекс P/D увеличивается (рис. 1 б-в). Такая зависимость воспроизводится на кривой роста Ph+ лейкоцитов от ХМЛ № 2,7 (табл.). Этот пример отнесен к 2 типу Ph+клеток по характеру кривых роста и гибели Ph+клеток с падением скорости пролиферации клеток с ее ингибированием во время активного созревания нейтрофилов.
На рис. 2б-г максимум накопления СЯ на 1 и З сут также соответствует минимуму накопления миелоцитов, уменьшению P/D и активации гибели клеток в этот период. Аналогичная активация накопления СЯ (на 2-З сут), как видно на рис.Зб-в, подавляет накопление миелоцитов, понижает P/D. Гибель СЯ на З сут восстанавливает рост концентрации миелоцитов и величину P/D. На рис. 2б видно, что максимум накопления СЯ соответствует минимуму накопления миелоцитов (т.е. максимальному расходованию миелоцитов). Максимумы накопления СЯ и апоптоза при этом совпадают (см. рис. 1б-в). Ингибирование накопления миелоцитов заметно при повышении концентрации СЯ > 0,2-0,3*106 клеток /мл, что видно на рис. 1б; 2б; Зб-в; 3б и частично на рис. 4в.
Поскольку последовательность нейтрофилов, созревающих без деления, по определению представлена превращением М^ММ^ПЯ^СЯ с выходом СЯ в апоптоз, то в культуре в отсутствие возможности транспорта в другие ткани, СЯ должны погибнуть по механизму апоптоза и, следовательно, значительное накопление СЯ указывает на блокирование апоптоза. Общая концентрация нейтрофилов в максимуме весьма высокая (0,7-2,4)х106/мл при колебании содержания каждого из них (табл.). Это согласуется с полученными результатами и объясняет пониженное содержание миелоцитов при дифференцировке Ph+ клеток 2 типа.
При концентрации СЯ < 2-3*10s клеток/мл и повышенном пуле клеток в S+G2/M фазах наблюдается
весьма низкий апоптоз (< 5-10 %). На 5 сут он едва достигает10 % (см. рис. 2б, г). Гибель клеток в других случаях (рис. 5а-в), определяемая окрашиванием с трипановым синим, также выявляет ингибирование гибели клеток. При концентрации СЯ выше 0,2-0,3*106 клеток /мл кинетические кривые дифференцировки РИ+ клеток 2 типа указывают на большую скорость накопления СЯ по сравнению со скоростью апоптоза и накопления миелоцитов, и тем большую, чем выше концентрация СЯ. На рис. 1б, в видно, что вначале апоп-тоз достигает максимума в 40 % на 1 и 60 % - на 6 сут, что соответствует увеличению накопления миелоцитов (см. рис. 1б). В случаях КМ (см. рис. 2-4) и ПК (табл., ХМЛ № 2,6) апоптоз не превышает 10-20 %.
Вероятно, ингибирование накопления миелоцитов зависит не прямо от блокирования апоптоза, а опосредовано СЯ клетками, накапливающимися вследствие ареста апоптоза. Это явление противоположно условиям индукции апоптоза при истощении в среде ци-токинов, отсутствие которых в норме стимулирует апоптоз [3; 4; 12;13; 29; 30].
В совокупности приведенные результаты позволяют заключить, что низкая эффективность ПД РИ+клеток 2 типа определяется блокированием апопто-
за, значительным накоплением нейтрофилов, особенно СЯ, ингибированием ими пролиферации РИ+ клеток и в частности - миелоцитов, вероятно, по механизму обратной связи. Ингибирование пролиферации РИ+клеток
2 типа нейтрофилами СЯ присутствует во всех рассмотренных примерах ПД РИ+клеток 2 типа и свидетельствует об участии СЯ в регуляции ПД. Эти результаты хорошо согласуются с данными о раздельном проявлении трансформирующей и антиапоптотической активности различных мутантов тирозинкиназы р210 Ьсг/аЬ1 благодаря изменениям путей сигнальной транс-дукции с участием р210 [19; 22; 34; 36].
Инверсия порядка (последовательности)
накопления неделящихся нейтрофилов
Нейтрофилы, созревающие без деления (клетки Б), по определению дифференцируются в ряду:
М^ММ^ПЯ^Ся с выходом СЯ в апоптоз. При одинаковых скоростях их дифференцировки можно ожидать тот же порядок накопления клеток этих субпопуляций. В отдельных случаях ПД такой порядок соблюдается. Однако в рассматриваемых кинетических кривых ПД РИ+клеток 2 типа порядок накопления созревающих без деления нейтрофилов изменяется. Скорость достижения максимумов на кинетических кривых СЯ, ПЯ и ММ замедляется, а накопление миелоцитов в области пиков нейтрофилов понижается. В максимуме накопления нейтрофилов наблюдается инверсия порядка накопления нейтрофилов. Последовательные изменения порядка накопления нейтрофилов по ходу дифференцировки видны на рис. 1-5.
Так, на рис. 1б, ряд М>ПЯ>ММ~СЯ на 1 сут последовательно инвертирует в СЯ>ММ~ПЯ>М на 2 сут, в М>ПЯ~СЯ>ММ на 3 сут и в ряд М>ММ>СЯ>ПЯ на 6 сут. На этом рис. видны частые изменения порядка с увеличением или уменьшением скоростей накопления нейтрофилов, что показывают пересечения кривых с изменением их направления. Одинаковые скорости накопления нейтрофилов на пересечении кривых на 4,5 сут позже приводят почти к обычному порядку накопления нейтрофилов - М>>ММ>СЯ>ПЯ. На рис. 2б видны: обычный порядок накопления - М>ММ>ПЯ>СЯ в нулевой момент культивирования, инверсия порядка в М>СЯ>ПЯ~ММ на 1 сут, в М>>ММ>СЯ>ПЯ на 4сут и позже к накоплению СЯ при убыли М, ММ и ПЯ. На рис. 3б порядок накопления М>>СЯ>ММ~ПЯ на 3 сут инвертирует в М~СЯ~ММ>ПЯ на 7 сут.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТА ТЬИ РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И... 9
Таблица
Характеристика пролиферации и дифференцировки РИ+клеток 2 типа в культуре. Скорости накопления и концентрация созревающих нейтрофилов больше, чем таковые пролиферации клеток, [зрелых] >[незрелых], поддерживаются в течение 6-9 сут. ___________________________________________________________________
№ пп, № рис. № образца ПК или КМ ХМЛ Рост числа Ph+клеток мах крат P/D,+[ro]/H [Нейтрофи-лов] = [зрелых], 10 /мл мах [СЯ]/ + [Миелоцты] [Бласты]/ [Миелоциты]+ Апоптоз /гибель/ клеток, % мах (на сут)
1/1 2,1 ПК 2,2 0,3-0,8 1,21 0,5-1,7-0,5 0-0,06 40 и 55 (1 и 6 сут)
2/2 2,2 КМ 1,6 0,8-1,5 0,7 0,05-0,2-0,42 0,03-0,21 4 и 11 (2 и 5 сут)
3/3 2,3 ПК 1,5 0,4-1,0 0,71 1,1-0,25 0,15 /0 и 34/ (4 и 10 сут)
4/4 2,4 ПК 4,0 3-1,2 2,36 0,5-2 0,06 /33/ (11 сут)
5/5 2,5 ПК 2,5 0,1-1,1-1,6 1,13 0,67-0,25-1,43 0,1-0,2 /5,3 и 17,4/ (2 и 7 сут)
6 7 2,6 ПК КМ - 0,2-1,0 0,3 -1,0 1,5 1.67-0,36-2 1.67-0,430,33-2 0,03 0,14 /3,2 и 23,8/ (В и 11 сут)
* * В9 2,7 КМ ПК исходная ПК** 2,8 2,7 1.5 1.5 0,4 0,15 0,15 0,66 0,17 0,1 0,93 0,19 0,05 0.04 /16 и 13/ (1 и В сут) /1,5 и 15/ (1 и 7 сут)
[] - концентрация. Все Ph+мононуклеары 2 типа выделены из КМ или ПК больных ХМЛ в хронической фазе. Характеристика Ph+ клеток и больных ХМЛ, а также типы мРНК bcr/abl приведена в [7]. *Ph+клетки отнесены к 2-му типу условно по кривым роста и гибели клеток, на которых видно асинхронное накопление зрелых клеток и их гибели с характерным скачкообразным торможением пролиферации. Индекс P/D определен только для начала культивирования. **ПК до выделения мононуклеаров. Даны интервалы изменения показателей по ходу кинетических кривых.
На рис. 4в почти равные скорости накопления
3 нейтрофилов на 4 сут: М>ПЯ~СЯ~ММ, на 8 сут инвертируют в ряд СЯ>>М>ПЯ> ММ. На рис. 5б скорость накопления М>СЯ>ММ>ПЯ на 4 сут инвертирует в СЯ>М >>ММ ~ПЯ на 8 сут.
Совокупность этих результатов означает, что изменения порядка накопления, т.е скоростей накопления нейтрофилов в сумме и относительно друг друга (или относительно миелоцитов), происходят достаточно часто по ходу кинетических кривых накопления нейтрофилов. Восстановление обычного порядка накопления нейтрофилов соответствует повышению содержания миелоцитов и индекса эффективности P/D, т.е. способствует ускорению пролиферации. Изменение скорости и инверсия порядка накопления нейтрофилов, будучи синхронно уменьшению индексов эффективности P/D (см. рис. 1 и 4г;
2, 3 и 5б), указывает на непосредственное участие нейтрофилов в регуляции ПД Ph+клеток 2 типа с ингибированием их пролиферации.
В итоге ПД Ph+клеток 2 типа происходит с низким индексом эффективности P/D < 1 и невысокой долей пролиферирующих Ph+клеток в фазах клеточного цикла S+G2/M < 20-40 % и/или с укороченным временем существования клеток в этих фазах. ПД Ph+клеток 2 типа сопровождается ингибированием апоптоза и значительным накоплением нейтрофилов, особенно СЯ, пониженным накоплением миелоцитов с заметным ингибированием пролиферации Ph+кле-ток, а также инверсией первоначального порядка накопления созревающих без деления нейтрофилов. Последние в условиях блокирования апоптоза опосредуют клеточную регуляцию пролиферации Ph+кле-ток и нарушают регуляцию своего созревания.
Инверсия порядка накопления нейтрофилов при ПД в условиях созревания Ph+ клеток обнаружена впервые. Она оказывается еще одним интересным свойством ПД Ph+клеток 2 типа в культуре.
Очевидно, что накопление СЯ в результате блокирования апоптоза по цепочке обратной связи ведет к последовательному накоплению предыдущих по ходу дифференцировки нейтрофилов ПЯ и ММ и к нарушению регуляции созревания самих нейтрофи-лов: накопление СЯ ведет к ингибированию созревания ПЯ, а ПЯ, в свою очередь, угнетают дифференци-ровку ММ. В конце концов, тормозится вся цепь созревания нейтрофилов, что сопровождается накоплением избытка всех нейтрофилов.
При этом созревающие нейтрофилы D угнетают пролиферацию и подавляют эффективность ПД. В следующий контрольный период индуцируется апоптоз или увеличивается его скорость, возможно, благодаря восстановлению индукции апоптоза в отсутствие цитокинов или выработкой цитокинов самими Ph+клетками.
Индукция апоптоза освобождает нейтрофилы от пресса обратной связи с торможением созревания, восстанавливает порядок накопления созревающих нейтрофилов, их концентрация падает, пролиферация клеток активируется, индекс эффективности P/D растет и регуляция пролиферации и созревания Ph+клеток восстанавливается.
Таким образом, в культуре первичных Ph+клеток 2 типа, происходящих от разных больных ХМЛ с их индивидуальными мутациями в гене bcr/abl, обнаружена клеточная регуляция пролиферации и диффе-ренцировки нейтрофилами, созревающими без деления и накапливающимися из-за ареста апоптоза.
При этом ингибируется пролиферация Ph+ клеток и нарушается регуляция созревания нейтрофилов, в которой участвует инверсия порядка созревания непролиферирующих нейтрофилов. +
Отметим, что в регуляции ПД Ph+клеток 2 типа можно выделить ряд взаимозависимых процессов, синхронно и асинхронно протекающих. Так, ингибирование апоптоза с накоплением нейтрофилов, созревающих без деления, происходит асинхронно накоплению миелоцитов и индукции апоптоза. Накопление миелоцитов синхронно индукции апоптоза, активации пролиферации с ростом индекса P/D и восстановлению регуляции созревания и пролиферации.
Кинетически кривые роста числа Ph+ лейкоцитов (мононуклеаров) 2 типа лишь частично отражают их пролиферацию, так как число Ph+клеток пополняется значительным накоплением зрелых нейтрофилов при блокировании их апоптоза. Отсюда ясно, что определение лейкоцитоза недостаточно для выявления Ph+клеток 2 типа при ХМЛ. Можно предположить, что, теряя способность выходить в апоптоз и накапливая соз+ревающие без деления нейтрофилы в процессе ПД, Ph клетки 2 типа способствуют торможению прогрессии ХМЛ. Действительно, Ph+клетки 2 типа были выделены из КМ и ПК больных исключительно в хронической фазе ХМЛ. При клинических наблюдениях за этими больными (более 3-8 лет) отмечены длительные клинико-гематологические и цитогенетические ремиссии, и не встречалось быстрой прогрессии ХМЛ из ХФ в ФА и БК [7].
Способность онкогена bcr/abl, и тирозинкиназы p210 определять туморогенные свойства, повышать жизнеспособность, активировать пролиферацию и блокировать апоптоз в линиях Ph+клеток детально исследовалась в [12-14; 16; 17; 19; 21; 29-31; 34-37; 39]. Экспрессия bcr/abl и p210 необходимы для обеих функций и даже как будто реализуют их одновременно. Для культур первичных Ph+клеток от больных ХМЛ соотношения активации пролиферации и ингибирования апоптоза более сложные, чем для клеточных линий. Несогласованность данных объясняют тонкими различиями в регуляции клеточных линий и первичных Ph+клеток [16; 17-19; 21; 22; 35; 39-41] и, как мы теперь видим, зависит от типа Ph+клеток, различающихся у разных больных ХМЛ.
В работе [17] при исследовании разных мутантов р210 показано, что функции p210 в активации пролиферации и ингибировании апоптоза проявляются раздельно и обязаны разным мутациям в bcr/abl, в том числе отвечающим за разные изменения в сигнальной трансдукции с фосфорилированием киназой р210 дополнительных белков.
Регуляция ПД ингибированием пролиферации Ph+клеток созревающими нейтрофилами, накапливающимися при блокировании апоптоза в Ph+клетках
2 типа, а также индукция апоптоза в Ph+клетках 1 типа, способствующая эффективной пролиферации в отсутствие нейтрофилов [7], хорошо согласуются с изложенными выше представлениями о роли р210 и его мутаций в функционировании Ph+клеток. Эти результаты также объясняют противоречия в регуляции пролиферации и ингибировании апоптоза в первичных клетках от больных ХМЛ. Обнаруженное здесь существование разных типов Ph+ клеток у разных больных ХМЛ с блокированием апоптоза или без блокирования снимают эти противоречия.
Ранее высказанная альтернативная гипотеза возникновения и прогрессии ХМЛ в качестве причины ХМ+ Л рассматривает не активацию пролиферации Ph+клеток из-за неуправляемой экспрессии р210 bcr/abl, а дисбаланс самоподдержания стволовых клеток и более
позднего созревания клеток. Основанием служат данные о том, что при ХМЛ клетки-предшественники образуются в меньшем количестве, чем в норме (или не больше), а их зрелых потомков в норме меньше, чем при ХМЛ [16; 18; 19; 40; 41].
Нарушение регуляции созревания Ph+клеток в качестве первичного биологического дефекта при ХМЛ рассматривали в ряде работ и ранее [17; 40]. Как видно из наших результатов такая регуляция ПД осуществляется устойчивыми к апоптозу СЯ нейтрофилами - потомками пролиферирующих клеток, активируемых bcr/abl, для Ph+клеток 2 типа, встречающихся у трети больных ХМЛ.
Отметим, что внутри 2 типа Ph+клетки также различаются количественными характеристиками P/D, ингибирования апоптоза, накопления СЯ и степенью ингибирования пролиферации по ходу ПД. Эти изменения можно рассматривать как некоторую регуляцию ПД в пределах, ограниченных условиями ПД Ph+клеток 2 типа, когда скорость созревания больше скорости пролиферации.
В работе [33] определена доля пролиферирующих Ph+клеток в фазах S+G2/M клеточного цикла для субпопуляций Ph+клеток от больных в ХФ ХМЛ, выделенных цитофлуориметрически на сортере и экспрессия онкогена bcr/abl в этих клетках. Доля пролиферирующих миелоидных CD34 клеток > 20%, миелоцитов и метамиелоцитов ~ 5 %, ПЯ+СЯ нейтрофилов < 3 %. Экспрессия онкогена bcr/abl была максимальной у CD34 предшественников и у смеси миелоцитов с метамиелоцитами. В ПЯ+СЯ нейтрофилах экспрессия bcr/abl - в два раза меньше; в миелобла-стах и промиелоцитах экспрессия имела промежуточное значение.
Однако линейная корреляция пула прол+ифери-рующих клеток и экспрессии онкогена для Ph+клеток 9 больных в ХФ ХМЛ оказалась прямой для CD34 клеток, миелобластов и промиелоцитов.
Для клеток более позднего созревания корреляция инвертировала. В данных корреляции [33] инвертирование корреляции можно оценить, скорее всего, как обратно пропорциональную зависимость. Это означает, что накопление пула пролиферирующих Ph+клеток в S+G2/M фазах пропорционально экспрессии bcr/abl только при пролиферации. При созревании (от миелоцитов до СЯ) доля клеток в S+G2/M фазах и экспрессия онкогена оказываются обратно пропорциональными. Кинетика в этой работе не изучалась, а использовались усредненные данные для 9 больных в ХФ ХМЛ, полученные для одной точки Ph+клеток от каждого больного.
Результаты данной работы хорошо объясняют причину инверсии корреляции в работе [33], которой является, согласно нашим данным, изменение регуляции пролиферации по мере созревания с накоплением нейтрофилов из-за блокирования апоптоза, и с ингибированием пролиферации нейтрофилами. Совокупность результатов работы [33] и нашей свидетельствуют о парадоксальном механизме действия bcr/abl на Ph+клетки. Экспрессия онкогена bcr/abl в пролиферирующих миелоидных Ph+клетках-предшественниках активирует пролиф+ерацию, а затем позже созревающие без деления Ph+ нейтрофилы, наследующие тот же онкоген bcr/abl, ингибируют его эффект, первоначально активирующий пролиферацию в клетках предшественниках.
Таким образом при ПД Ph+клеток 2 типа активирующий прол+иферацию эффект экспрессии онкогена bcr/abl в Ph+ клетках ранней дифференцировки подавляется экспрессией того же онкогена в Ph+ клетках более позднего созревания.
Выводы
1. Пролиферация и дифференцировка (ПД) Ph+ клеток 2 типа (мононуклеаров) длительно протекает с большей скоростью созревания, чем скорость пролиф ерации. Индекс эффективности этих клеток P/D = 0,2 - 1 при невысокой доле пролиферирующих Ph клеток в фазах S+G2/M клеточного цикла и/или укороченным временем существования клеток в этих фазах.
2. Пролиферация и дифференцировка Ph+клеток 2 типа сопровождается значительным ингибированием апоптоза, существенным накоплением СЯ нейтрофилов и ингибированием пролиферации. Блокирование апоптоза с накоплением нейтрофилов, созревающих без деления, происходит асинхронно накоплению миелоцитов, индукции апоптоза и росту индекса эффективности P/D.
3. При ПД Ph+клеток 2 типа обнаружена инверсия первоначального порядка (последовательности) накопления нейтрофилов: порядок М> ММ>ПЯ>СЯ последовательно инвертирует в ряд
СЯ>ПЯ>ММ>М, что ведет к постепенному накоплению всех нейтрофилов и нарушению регуляции созревания нейтрофилов, вероятно, по механизму обратной связи.
4. Повышенная концентрация созревающих нейтрофилов при ПД Ph+клеток 2 типа в условиях блокирования апоптоза опосредуют регуляцию пролиферации Ph+клеток и созревания самих нейтрофилов.
5. Значительный рост популяции Ph клеток 2 типа при ПД отражает неравномерное накопление зрелых нейтрофилов в большей степени, чем пролиферацию Ph клеток.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований, грант № 06-04-08372-офи.
Литература
1. Абдулкадыров К.М., Бессмельцев С.С., Рукавицын О.А. Хронический миелолейкоз. - СПб: Специальная литература, 1998. - 463 с.
2. Ахлынина Т.В., Герасимова Л.П., Саркисян Г.П. и др. Кинетика пролиферации, дифференцировки и транскрипции генов, регулирующих апоптоз, BCR/ABL+Ph+клеток человека в культуре // Цитология
- 2007. - Т. 49. - С. 889-900.
3. Владимирская Е.Б. Механизмы апоптоза клеток крови // Лабораторная медицина. -2001. - № 4.
- С. 47-54.
4. Владимирская Е. Б. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста. В кн. Биологические основы противоопухолевой терапии. - М.: Изд. Агат-Мед, 2001. - С. 5-32.
5. Руководство по гематологии. Под ред. А.И. Воробьева. - Т. 1. - М: Ньюдиамед, 2002. - 280 с.
6. Гринева Н.И., Барышников А.Ю., Герасимова Л.П. и др. Кинетика экспрессии антигенов в процессе пролиферации и дифференцировки Ph+клеток периферической крови при хроническом миелолейкозе в культуре // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6, № 2. - С. 21-32.
7. Гринева Н.И., Ахлынина Т.В., Герасимова Л.П. и др. Различия в пролиферации и дифференцировке Ph+клеток от разных больных ХМЛ в культуре.1. Три типа Ph+клеток при ХМЛ. Пролиферация и дифференцировка Ph+клеток с высокой эффективностью // Российский биотерапевтический журнал.
- 2009. - Т. 8. -С. 53-68.
8. Козинец Г.И., Котельников В.М. Кинетика гемопоэза и ее клиническое значение // Советская медицина. - 1983. - № 4. - С. 3-77.
9. Котельников В.М., Козинец Г.И., Касаткина В.В., Ковалевская Н.П. Кинетика гранулоцитопоэза. В кн. Кинетические аспекты гемопоэза. Изд. Томского государственного университета, 1982.
- С. 149-211.
10. Розмарин А.Д. Лейкоциты. В кн.: Шиффман Ф.Д. Патофизиология крови. BINOM Publishers, 2000. - С.123-48.
11. Шмаров Д.А., Кучма Ю.М.,Козинец Г.И. Изменение стабильности параметров клеточного цикла клеток костного мозга при гематологических заболеваниях // Терапевт. Архив. - 1997. - № 7. - С. 17-21.
12. Amarante-Mendes G.P., Naekyung Kim C., Liu L. et al. Bcr-Abl exerts its antiapoptotic effect against diverse apoptotic stimuli tyrough blockage of mitochondrial release of citochrome C and activation of cas-pase-3 // Blood. - 1998. - 91. - P. 1700-5.
13. Bedi A., Zehnbauer B.A., Barber J. et al. BCR-ABL-mediated inhibition of apoptosis with delay of G2/M transition after DNA damage: a mechanism of resistance to multiple anticancer agents // Blood. - 1994.
- 83. - P. 2038-44.
14. Bedi A., Barber J.P., Bedi G.C. et al. Inhibition of apoptosis by BCR-ABL in CML // Blood. - 1995.
- 86. - P. 1148-58.
15. Brandford S., Rudzki Z., Walsh S. et al. High frequency of point mutations clustered within ATP-binding region in CML or Ph+ AML patients who develop imanitib resistance // Blood. -2002. - 99. - P. 3472-5.
16. Buckle A.M., Mottram R., Pierce A. et al. The effect of Bcr-Abl protein tyrosine kinase on maturation and proliferation of primitive haematopoietic cells // Mol. Med. - 2000. - 6(10). - P. 892-902.
17. Clarkson B., Strife A. Linkage of proliferarive maturational abnormalities in CML and relevance to treatment // Leukemia. - 1993. - 7. - P. 1683-721.
18. Coppo P., BonnetM.L., Dusanter-Fourt I. et al. Constitutive and specific activation of STAT3 by BCR-AbL in embryonic stem cells //Oncogene. - 2003. - 22(26). - P. 4102-10.
12 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТА ТЬИ РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И...
19. Cortez D., Kadlec L., Pendergast A.M. Structural and signaling requeirments for bcr-abl mediated transformation and inhibition of apoptosis // Mol. cell. biology. - 1995. - 10. - P. 5531-41.
20. Deininger M.W.N., Goldman J.M., Melo J.V. The molecular biology of chronic myeloid leukemia // Blood. - 2000. - 96. - P. 3343-56.
21. Deininger M.W.N., Vieira S., Mendiola R. et al. BCR/ABL tyrosine kinase activity regulates the expression of multiple genes implicated in the pathogenesis of chronic myeloid leukemia // Cancer research.
- 2000. - 60. - P. 2049-55.
22. Dublez L., Eymin B., Sordet O. et al. ABL delays apoptosis upstream of procaspase-3 activation // Blood.
- 1998. - 91. - P. 2415-22.
23. Era T., Witte O.N. Regulated expression of P210 Bcr-Abl during embryonic stem cell differentiation stimulates multipotential progenitor expansion and myeloid cell fate // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.
- 2000. - 97. - P. 1737-42.
24. Guzman M.L., Jordan C.T. Considerations for targeting malignant stem cells in leukemia //Cancer Control. - 2004. - 11(2). - P. 97-104.
25. Holyoake T.L., JiangX., Eaves, A.C., Eaves C.J. Elucidating critical mechanisms of deregulated stem cell turnover in the chronic phase of chronic myeloid leukemia // Leukemia. - 2002. - 16. - P. 549-58.
26. Holyoake T.L., Jiang X., Jorgensen H.G. et al. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3 // Blood. - 2001. - 97. - P. 720-8.
27. Jaiswal S., Traver D., Miyamoto T. et al. Expression of BCR/ABL and BCL-2 in myeloid progenitors leads to myeloid leukemias // Proc.Nat. Acad. Sci. USA. - 2003. - 100. - P. 10002-7.
28. Jamieson C.H.M., Ailles L.E., Dylla S.J. et al. Granulocyte-macrophage progenitors as candidate leukemic stem cells in blast crisis CML // New England J Medicine. - 2004. - 351. - P. 657-67.
29. Lotem J., Sachs L. Control of apoptosis in hematopoiesis and leukemia by cytokines, tumor suppressor and oncogenes // Leukemia. - 1996. - 10. - P. 925-31.
30. Lugo T.G., Pendergast A.M., Muller A.J., Witte O.N. Tyrosine kinase activity and transformation potency of bcr-abl oncogene products // Science. - 1990. - 247. - P. 1079-82.
31. Melo J.V. The diversity of the BCR-ABL fusion proteins and their relationship to leukemia phenotype // Blood. -1996. - 88. -P. 2375-84.
32. Passegue E., Jamieson C.H.M., Ailles L.E., Weissman I.L. Normal and leukemic hematopoiesis: Are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? // Proc.Nat.Acad. Sci. USA.
- 2003. - 100. - P. 11842-9.
33. Primo D., Flores J., Quijano S .et al. Impact of BCR/ABL gene expression on the proliferative rate of different subpopulations of haematopoietic cells in chronic myeloid leukaemia // Brit. J. Haematol.
- 2006. - 135. - P. 43-51.
34. Satler M., Mohi M.G., Pride Y.B. et al. Critical role for Gab2 in transformation by bcr/abl //Cancer cell.
- 2002. - 1. - P. 479-92.
35. Selleri C., Maciejewski J.P., Pane F. et al. Fas-mediated modulation of bcr/abl in CML results in differential effects on apoptosis // Blood. - 1998. - 92. -P. 981-9.
36. Sherbenou D. W., Hantschel O., Turaga L. et al. Characterization of bcr-abl deletion mutants CML patients // Leukemia. - 2008. - 22. - P. 1184-90.
37. Sillaber C., Gesbert F., Frank D.A. et al. STAT5 activation contributes to growth and viability in Bcr/Abltransformed cells // Blood. - 2000. - 95. - P. 2118-25.
38. Skipper H.E., Perry S. Kinetics of normal leukemic leukocyte population and relevance to chemotherapy // Cancer Res. - 1970. - 30. - P. 1883-97.
39. Stoklosa T., Poplawski T., Koptyra M. et al. Bcr/abl inhibits mismatch repair to protect from apoptosis and induce point mutations //Cancer Res. - 2008. - 68. - P. 2576-80.
40. Strife A., Lambek C., Wisniewski et al. Discordant maturation as the primary biological defect in CML // Cancer Res. - 1988. - 48. - P. 1035-41.
41. Traycoff C.V., HaisteadB., Rice S. et al. Chronic myelogenous leukaemia CD34+cells exit G0/G1 phases of cell cycle more rapidly than normal marrow CD34+cells // Brit. J. Haematology. - 1998. - 102. - P. 759-67.
Издание 2-е, переработанное и дополненное
ЭНЦИКЛОПЕДИЯ
КЛИНИЧЕСКОЙ
ОНКОЛОГИИ
Готовится к печати Издательская группа РОНЦ
