CC BY
31
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И..
61
УДК 616-006.446.8-092.4:616-091.818:616.155.34:576.385.5
Н.И. Гринева, Т.В. Ахлынина, Л.П. Герасимова, Т.Е. Манакова, Т.Г. Сарычева, ДА. Шмаров,
А.М. Тимофеев, Н.М. Найденова, Г.П. Саркисян, Т.В. Боровкова, А.Р. Гавричкова, ЛЮ. Колосова,
Т.И. Колошейнова, Л.Г. Ковалева, С.В. Кузнецов, О.Ю. Виноградова, ЕЮ. Челышева, А.Г. Туркина РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ Ph+КЛЕТОК ОТ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ БОЛЬНЫХ ХМЛ В СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЕ:
3. Ph+КЛЕТКИ С ЧЕРЕДОВАНИЕМ ЭТАПОВ ЭФФЕКТИВНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ЭФФЕКТИВНОГО СОЗРЕВАНИЯ Гематологический научный центр РАМН, Москва
Контактная информация:
Гринева Нина Ивановна, д-р хим. наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории генной инженерии адрес: 125167, Москва, Новозыковский проезд, д. 4а; тел. +7(499)615-31-02; e-mail: nigrin27@mail.ru
Статья поступила: 19.06.2010, принята к печати 16.09.2010.
Резюме
При исследовании пролиферации и дифференцировки Ph+клеток 3 типа от разных больных XMЛ в суспензионной культуре обнаружена и изучена клеточная регуляция ПД этих клеток, которая осуществляется при чередовании этапов эффективной пролиферации и эффективного созревания с ингибированием пролиферации накапливающимися нейтрофилами при блокировании апоптоза. Чередование этапов состоит в замене этапа 1 - этапа эффективной пролиферации, протекающего с большей скоростью пролиферации Ph+клеток, чем скорость созревания нейтрофилов, на этап 2 - этап эффективного созревания, на котором скорость созревания нейтрофилов больше скорости пролиферации Ph+клеток. Неоднократное чередование этапов следует схемам: 1/2-1/2/1 или 2/1-2/1/2/1. При этом соотношение скоростей пролиферации и созревания - индекс эффективности P/D - на этапе пролиферации P/D1>1, а на этапе созревания P/D2<1. Кинетические кривые этапов чередования, пересекаясь проходят контрольные точки, в которых показатели этапов пролиферации и созревания одинаковы. В течение этапов чередований эти показатели, напротив, постоянно изменяются. Индексы эффективности P/D в контрольных точках равны 1,06+0,23, они не зависят от времени и порядка чередования, а также от концентрации клеток и от источника Ph+клеток - от больных XMЛ. На этапах пролиферации повышено содержание пролиферирующих незрелых и миелоцитов, понижено содержание созревающих нейтрофилов и индуцирован апоптоз. На этапах созревания, наоборот, блокирован апоптоз, повышено содержание нейтрофилов, особенно сегментоядерных, но понижено содержание незрелых. На этапе созревания нейтрофилы в повышенной концентрации ингибируют пролиферацию незрелых Ph+клеток и миелоцитов, претерпевают инверсию порядка созревания нейтрофилов с нарушением их созревания, вероятно, по механизму обратной связи. Чередования этапов пролиферации и созревания регулируют эффективность и поддерживают пролиферацию и дифференцировку Ph+клеток в оптимальном режиме. Ph+клетки 3 типа обнаружены у ~ половины исследованных больных XMЛ, все в XФ XMЛ.
Ключевые слова: XMЛ, культивирование Ph+клеток in vifro, кинетика пролиферации и дифференцировки, апоп-тоз, чередование этапов пролиферации и дифференцировки, эффективность пролиферации и дифференцировки.
N.I. Grineva, T V. Akhynina, L.P. Gerasimova, T.E. Manakova, DA. Schmarov,
N.G. Sarycheva,T.V. Borovkova, N.M. Nydenova, G.P. Sarkisyan, A.M. Tumofeev, L.Yu. Kolosova,
T.I. Kolosheynova, L.G. Kovaleva, S.V. Kusnetsov, O.Yu. Vinogradova, E.Yu. Chelysheva, A.G. Turkina THE PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION
OF Ph+CELLS FROM INDIVIDUAL CML PATIENTS GROW IN SUSPENSION:
3. THE INTERCHANGE BETWEEN PROLIFERATION AND MATURATION IN Ph+CELLS
GU Research Center for Hematology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Abstract
The characteristic features of the transition from chronic phase to blast crisis include proliferation, differentiation and resistance to apoptotic cell death. When grown in suspension Type 3 Ph+ cells from different patients, PD regulation occurs through the interchange between effective proliferation and effective maturation with the inhibition of accumulating neutrophyles as the results of apoptosis blockade. This becomes realizable because of substitution of effective proliferation, Step 1, for the effective maturation, Step 2. The characteristic feature of Step 1 is the high rate of Ph+cells proliferation against the background of neutrophyles maturation, while the characteristic hallmarker of Step 2 is the effective maturation rate of neutrophyles. The reiterated interchange these steps follows 1/2-1/2/1 or 2/1-2/1/2/1. The ratio of proliferative rate to maturation rate, so-called P/D is always higher than 1 on Step 1 and lower than 1 on Step 2. The kinetic curves of these steps crossed in control dot with the equal rate of proliferation and maturation. The efficacy index, P/D, in controls comes to 1.06+0.23 and does not depend on time, density of cells and the source of Ph+cells. When Ph+cells proliferate, the density of non-maturated cells and myelocytes is increased, the density of maturating neutrophyles is reduced, and the apoptosis is massive. On the other hand, when the Ph+cells maturate, the neutrophyles’ high density inhibits proliferation of non-maturated Ph+cells and myelocytes and introduces some disturbances inmaturation step. We conclude that the most reasonable mechanism is the feedback mechanism. Type 3 Ph+cells were indentified in half of patients with CML, all of them were patients with chronic phase of disease.
Key words: CLM, Ph+cells growth in vitro, the proliferative and differentiation kinetic, interchange between proliferation and differentiation.
62
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И..
Введение
Несмотря на многочисленные исследования кроветворных клеток, содержащих Ph-хромосому и участвующих в патологии ХМЛ, в культурах и in vivo [1; В; 13; 19; 20; 29; 31; Зб], а также в более поздних и обстоятельных работах [І0; ІІ; І5-І7; 21-2В; 30; 32; 33; 34; 37] отсутствует единая концепция биологических и молекулярных аспектов этих процессов и их связи между собой. Это в полной мере касается ПД Ph+клеток ex vivo и in vivo.
Pанее были выявлены 3 типа Ph+клеток от индивидуальных больных ХМЛ, которые различались разной эффективностью ПД и скоростью накопления пролиферирующих и созревающих без деления Ph+клеток. При 1 типе ПД с большей эффективностью протекает пролиферация миелоидных клеток, P, при очень низком накоплении неделящихся ней-трофилов, клеток D. При 2 типе ПД с большей скоростью накапливаются клетки D; их дифференци-ровка происходит с низкой эффективностью и с ингибированием пролиферации незрелых клеток P нейтрофилами, созревающими без деления. Пролиферация и дифференцировка 3 типа Ph+клеток за то же время протекает c неоднократным чередованием этапов пролиферации и созревания с частотой чередования от 0,5 до б сут [3; В].
Целью данной работы являлось изучение ПД Ph+клеток 3 типа от различных больных ХМЛ в суспензионной культуре и выяснение роли чередования эффективной пролиферации с эффективным созреванием в регуляции ПД Ph+клеток.
Материалы и методы
Материалы и методы детально приведены в Сообщении 1 и др. [В; 3]. Характеристика исходных Ph+мононуклеаров и больных ХМЛ, из ПК и КМ которых выделены клетки, дана в сообщении 1 [В]. Параметры ПД Ph+клеток 3 типа приведены в табл. 1-2.
Результаты и обсуждение
Для характеристики ПД Ph+клеток 3 типа от различных больных ХМЛ получали кинетические кривые ПД мононуклеаров в одинаковых условиях суспензионной культуры, и результаты анализировали, как описано в [3; В]. Популяция мононуклеа-ров при ХМЛ состоит из лейкоцитов (~90 %), содержащих 70-90 % миелоидных клеток, в основном гранулоцитов [1; 2; б; 7]. Поэтому исследовали рост популяции лейкоцитов, их гибель, апоптоз грану-лоцитов, ПД субпопуляций лейкоцитов и грануло-цитов, распределение гранулоцитов по фазам клеточного цикла. Также исследовали скорости пролиферации клеток P (бласты + промиелоциты + миелоциты) и созревания нейтрофилов D (ММ + ПЯ + СЯ). По соотношению скоростей накопления клеток P и клеток D определяли кинетические изменения индексов эффективности P/D.
Согласно [В] Ph+клетки 3 типа пролиферируют и дифференцируются с неоднократным чередованием этапов, поочередно протекающих то с большей скоростью пролиферации, то с большей скоростью созревания. Другими словами этап с «преимуществом скорости пролиферации» - эффективная пролиферация чередуется с эффективным созреванием - этапом с «преимуществом скорости созревания» или сокращенно - этап пролиферации чередуется с этапом созревания. При этом в каждом из этапов происходят оба процесса - и
пролиферация и созревание с разным соотношением их скоростей, следовательно, с разной эффективностью. При преимуществе пролиферации индекс эффективности Р/О > 1, при преимуществе созревания индекс Р/О < 1.
Результаты исследования ПД РИ+клеток 3 типа в культуре представлены в табл.1 и 2 и на рис. 1-8. Чередование этапов пролиферации и созревания видно по пересечению кинетических кривых накопления незрелых клеток, Р ([нз]), и созревающих клеток О ([з]), которые приведены на рисунках
(б) одновременно с кинетикой индексов эффективности Р/О, выражаемых отношением скоростей накопления клеток Р и О. При ПД встречаются одно- - четырехкратные чередования этапов по схемам 1/2-1/2/1 или 2/1-2/1/2/1 с частотой от 1 до 6 сут, изредка 0,2-8 сут (табл. 2), где 1 - этап пролиферации, 2 - этап созревания.
Индексы эффективности Р/Б
На рис. 1-8 и в табл. 1 и 2 видно, что чередование этапа пролиф1 ерации протекает с индекс2ом эффективности Р/О >1, а этапа созревания с Р/О2 <
1. При чередовании этапов по схеме 1/2- 1/2/1 скорости и, следовательно, концентрации клеток изменяются в ряду [нз] > [з] — [з] > [нз] — [нз] > [з] (рис. 1- 5 в, е). При чередовании этапов по схеме 2/1 - 2/1/2/1 скорости и концентрации изменяются в ряду: [з] > [нз]—* [нз] > [з]—* [з] > [нз] (рис. 6-8 в).
В табл. 1 даны показатели чередования в течение этапов пролиферации и созревания при ПД образцов РИ+клеток 3 типа, в табл. 2 характеристики в точках пересечения кинетических кривых этапов пролиферации и созревания - в «равновесных точках чередования».
В момент пересечения кривых накопления пролиферирующих клеток Р (скорость пролиферации) и созревающих без деления нейтрофилов О (скорость созревания) происходит смена этапов чередования, скоростей накопления РИ+клеток и других показателей ПД. В точках пересечения кривых клеток Р и клеток О скорости накопления клеток Р и О и индексы эффективности Р/О1 и Р/О2 одинаковы (в среднем 1,06+0,23, табл. 2).
Они не зависят от схемы, времени и последовательности чередования, а также от концентрации клеток и от их источника - от больного ХМЛ. Точки пересечения можно назвать равновесными или критическими. Другие характеристики пересечения на этапах пролиферации и созревания - концентрации незрелых клеток и зрелых/созревающих нейтрофилов (0,4-0,7х106/мл) и СЯ (0,1-0,4х106/ мл) также имеют довольно близкие значения. Однако наблюдаются и заметные колебания - 1,53-0,1х106/мл для КМ 3.5, ПК 3.10, 3.11 и КМ 3.12 (табл. 2). Возможно, эти показатели зависят от концентрации РИ+клеток
В течение этапов чередования показатели наоборот постоянно меняются, проходят повышение и понижение, минимумы и максимумы, которые, как правило, асинхронны друг другу (рис. 1-8, а-е, табл. 1).
Индексы Р/О зависят от этапа чередования. Они растут или уменьшаются в своих пределах: индекс Р/О1 >1, Р/О2 <1.
Так, на этапе пролиферации Р/О1 меняется в основном от 1 до 4 (табл. 1). Исключение составили клетки из КМ № 3.3, Р/О1 которых уменьшается от 11 до 1, что занимает 3 сут до момента равновесия и пе2рехода к этапу созревания. На этапе созревания Р/О колеблется от 0,1-1 до нового этапа пролиферации, где индексы Р/О1 >1.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И..
63
Это означает, что соотношение скоростей пролиферации и созревания - их индексы эффективности P/D и концентрации пролиферирующих и созревающих клеток и особенно СЯ являются весьма значимыми показателями ПД Ph+клеток.
В итоге попеременное чередование этапов пролиферации и созревания со сменой повышенных индексов эффективности на низкие приводит к умеренному росту и падению эффективности ПД Ph+клеток 3 типа и таким образом регулирует эффективность ПД. Этой регуляции на этапах пролиферации соответствует повышенное содержание пролиферирующих клеток и особенно миелоцитов, низкое содержание нейтрофилов при индукции апоптоза, а также P/D1 >1. На этапах созревания регуляция ПД опосредуется ростом концентрации созревающих нейтрофилов, особенно СЯ с ингибированием пролиферации, аналогично Ph+клеткам 2 типа [З], меньшими концентрациями незрелых по сравнению с данными на этапе пролиферации. Показатели чередования этапов ПД по схеме 1/2 или 1/2/1 отличаются от чередования по схеме 2/1 или 2/1/2, начинающегося в культуре с этапа созревания, пониженными индексами P/D2 на этапах созревания (рис. 1-5 и рис. 6-8, табл. 1).
Другие характеристика этапов чередования
Для ПД Ph+клеток 3 типа, как и 1 и 2 типов наблюдается общее+ свойство, наблюдаемое при культивировании Ph+клеток от больных ХФ ХМЛ, а именно рост популяции лейкоцитов и гранулоцитов с 1-4-кратным увеличением количества клеток на 25 сут ПД. Затем наступает уменьшение популяции и вновь ее небольшой рост на 7 сутки (или перегиб на кривой роста) (рис. 1 в; 3 в, е; 7 и 8 в). Последнее свидетельствует об активации пролиферации на следующем цикле дифференцировки Ph+клеток аналогично [2; 8]. Значительное уменьшение концентрации мононуклеаров ко второму циклу не препятствует чередованию этапов ПД с разными скоростями накопления P и D клеток. Рост популяции лейкоцитов при ПД Ph+клеток 3 типа происходит как в результате пролиферации незрелых, так и созревания нейтрофилов и их накопления из-за блокирования апоптоза. Это видно при дифференцировке грануло-цитов на рис 1-6, б, демонстрирующих неравномерное накопление СЯ и других нейтрофилов, ингибирующих накопление пролиферирующих клеток и миелоцитов на этапе созревания.
На рис. 1-6 и табл. 1 видно, что на этапах пролиферации концентрация незрелых Ph+клеток больше, чем на этапах созревания при индексах P/D >1 (3,4-1,0 и 11 в случае КМ № 3.3). Концентрация созревающих нейтрофилов и СЯ при этом ниже, чем на этапе созревания. Соответственно на этапе созревания эти показатели имеют противоположные значения: P/D < 1, концентрация нейтрофилов и СЯ больше, а концентрация незрелых и миелоцитов меньше, чем на этапе пролиферации. Соотношение СЯ/миелоциты изменяется от 0,2 до 9 в зависимости от образцов Ph+клеток и времени ПД.
На 1 этапе однократного чередования 1/2 видно повышенное содержание пролиферирующих клеток в фазах клеточного цикла S+G2/M > 30-45% на 1-2 сут (рис.1 и 2), что соответствует повышенному накоплению миелоцитов и низкому содержанию нейтрофилов: ММ, ПЯ и СЯ (Рис. 1, 2 и табл. 1). На этапе созревания индекс P/D < 1, концентрация нейтрофилов и СЯ повышается, миелоцитов падает, содержание Ph+клеток в фазах клеточного цикла S+G2/M оказывается < 25 %.
Позже с переходом на этап созревания содержание миелоцитов падает (< 20 %), а нейтрофилов возрастает. К моменту второй активации пролиферации - к 7 суткам, наблюдается рост клеток в Б+С2/М фазах (рис. 1 г). Если наступает следующий этап 1 пролиферации (1/2/1), то соответствующие показатели предшествующего этапа пролиферации восстанавливаются (рис. 1-8 и табл. 1). Чередование этапов пролиферации и созревания по показателям аналогичны ПД РИ+клеток 1 и 2 типов соответственно, но ПД РИ+клеток 3 типа ограничивается краткой продолжительностью пребывания РИ+клеток в данных условиях и сменой этапов чередования. Результатом оказываются умеренные колебания индексов эффективности ПД.
При чередовании по схеме 1/2/1 на этапах пролиферации максимальное накопление принадлежит миелоцитам. На этапах созревания накопление нейтрофилов ММ, ПЯ и СЯ больше, чем миелоцитов. Все исследованные показатели чередования по мере перехода от пролиферации к созреванию изменяются и проходят через соответствующие максимумы и минимумы на своих этапах чередования (рис. 1-8, табл. 1) и практически восстанавливаются на своем этапе чередования при достаточной его продолжительности.
Дифференцировка субпопуляций гранулоци-тов показывает изменение накопления миелоцитов, содержание которых на этапах пролиферации остается наибольшим.
На этапах созревания высокая концентрация нейтрофилов и СЯ соответствует очень низким значениям Р/О2 и минимальной концентрации миелоцитов (рис. 6-8 и табл. 2). Затем с падением концентрации СЯ начинается рост Р/О1, накопление миелоцитов и индукция апоптоза. Максимумы Р/О1 и накопления миелоцитов совпадают с минимумом концентрации СЯ на 5-е сутки. Накопление зрелых клеток и СЯ ведет к падению Р/О1 и уменьшению концентрации миелоцитов. СЯ в высокой концентрации ингибируют пролиферацию миелоцитов, вероятно, по механизму обратной связи, что понижает индекс Р/О. Именно уменьшение концентрации нейтрофилов и особенно СЯ определяет переход этапа созревания к этапу пролиферации при чередовании этапов 2/1, вероятно благодаря индукции апоптоза. Это вполне согласуется с характеристикой ПД РИ+ клеток 2 типа [3] и клеток других больных с 3 типом дифференцировки по схеме 2/1/2 (рис. 7 б-в, д; 8 б-в; табл. 1 и 2). Ингибирование апоптоза и пролиферации миелоцитов клетками СЯ видно на рис. 3-5, 6-8 б, г и в табл. 1. При этом, чем активнее пролиферация РИ+клеток и активнее апоптоз, тем выше индекс Р/О1, например рис. 3-5 и табл. 1.
Особенность ПД РИ+клеток по схеме 2/12/1/2/1 (рис. 6-8; другие примеры в табл. 1) состоит в быстром и значительном накоплении СЯ в начале этапа созревания и в зависимости дальнейшей пролиферации и дифференцировки клеток от уменьшения концентрации СЯ. Это можно объяснить накоплением ММ, ПЯ и СЯ в пробе РИ+клеток из-за торможения дифференцировки и ингибирования апоп-тоза нейтрофилами в предыдущем цикле дифферен-цировки функционировавшего клона. При чередованиях по схеме 2/1, 2/1/2 или 2/1/2/1, виден обычный рост пролиферации лейкоцитов с двумя максимумами: активным - на 1 сутки и пассивным - на 5-8 сутки. Апоптоз и гибель клеток с максимумом на 25 сут составляет ~ 35 % (рис. 6, а-в), что по времени соответствуют расходованию и гибели СЯ.
Показатели чередования этапов пролиферации и созревания при пролиферации и дифференцировке в культуре PH клеток 3 типа, полученных из КМ и ПК больных ХМЛ в хронической фазе. Данные Р1Г клеток и больных ХМЛ приведены в табл. 3 сообщения 1 [8]___________________________________________________________________
№ п/п и рис.№ № ХМЛ (*) Показатели этапа пролиферации Мах или интервал (сут) Показатели этапа созревания Мш, мах или интервал (сут) [СЯ]/ [миелоцитов] Апо птоз (гибель), %
РЮ1 106 клеток/мл РЮ2 М1п Мах, 106 клеток/мл
[нз] [з] [СЯ] [нз ] [з ] [СЯ ]
Чередование этапов по схемам 1/2 или 1/2/1 с изменением скоростей накопления и концентраций [нз > [з] — [з] > [нз] — [нз] > [з]
1. Рис. 1 3.1 КМ (1/2/1) 1,4-1,1 1,2-2,3 0,35-0,5 0,64-0,5 0,29-0,5 0,63-0,2 0,1-0,25 0,3-0,1 0,9 (3 сут) 0,71 (Зсут) 0,8 (3 сут) 0,4 (3 сут) 0,5-0,2 5-12
2. Рис. 2 3.2** ПК (1/2) 1,3-1,2 0,4 0,30 0,05 0,85 0,4-0,3 0,53 0,16 0,5-0,25 <5
3-4. Рис. 3 3.3 КМ ПК (1/2) 11- 2 1,32-1,5 0,46-0, 0,5-0,8 0,02-0,5 0,4-0,5 0,01-0,4 0,14 -0,25 од 1,0-0,2 0,5-0,1 0,5-0,1 0,6 (3 сут) 0,6 (7сут) 0,4-0,2 0,3-0,2 0,1-2,5 0,1-1-2,5 (7 на 11 сут)
5. Рис. 4 3.4 КМ (1/2/1) 1,2 1,53 0,4-0,8-0,5-1,1 0,34 0,17 0,52-0,34 0,57-0,34 1,1 0,7 0,4-1,3-2 (18 на 5 сут)
6. Рис. 5 3.5 КМ (1/2) 3,43-1,0 1,95 1,65 0,03-0,37 1,0-0,3 1,53-0,4 1,53-1,21 0,37-0,5 0,19 0,25 2,0 (30 на 11 сут)
7. 3.6 КМ (1/2) 1,61 0,61 0,52 0,24 0,28 0,13-0,56 0,52-0,4-0,6 0,24 0,13 -0,5-1,0 (22 на 11 сут)
8. 9. 3.7 КМ (1/2) ПК (1/2/1) 2,5-1,4 2,2 1,2 1,2-1,4 0.65-0,60 0,51-0,54 0,38-0,32 0,55 0,5-0,54 0,4-0,2 0,3 0,05-0,19 0,15-0,07 0,7-0,4 0,78 0,55 0,57-0,38 0,83 0, 73 0,53 0,27 0,1-0,5 (30 -35 на 10-11 сут)
10. 3.8 КМ (1/2) 3,9-1,5 0,53-0,35 0,14-0,35 0,02-0,22 1,5-0,5 0,35-0,23 0,35-0,44 0,2-0,4 0,04-0,3 (45 на 7сут)
Чередование этапов по схемам 2/1 или 2/1/2 с изменением скоростей накопленияи концентраций [з] >[нз] —> [нз] > [з — [з] > [нз]
11. Рис. 6 3.10* ПК (2/1)- 1,4 -3,1-2,0 0,3-0,6-0,4 0,3-0,2 0,17-0,25 0,2-0,5-1,4 0,13-0,3 0,5-0,8-0,3 0,35-0,7 8,5-0,3 34-22 на 2-5 сут
12. Рис. 7 3.11 ПК (2/1/2) <-► 1,15-1,63 0,8-0,6 0,6-0,8-0,1 0,43-0,3 0,33-1,15 0,75-0,8 0,2-0,8, 0,6 0.8 0,1 0,5-1,3-0,8, 0,8-0,1 0,16-0,75-0,4, 0,39-0,06 1,2-0,2 35 на 1сут, 63 на 4 сут
13. Рис. 8 3.12 КМ (2/1/2/1/2) 1,0-1,32 1,0 0,7-0,78 0,24 0,6 0,24 0,14-0,35 0,12 0,5-0,7-1,0 1,0-0,8-1,0 0,6-0,7 0,6 0,2 0,4-0,95 0,6 0,14-0,5 0,34 од 0,9-0,2 7, 22 на 6, 11 сут
14. 3.13 ПК (2/1) <-> 1,7-2,5 0,39 0,4-0,2 0,2-0,1 0,45-1,7 0,42 0,9-0.4 0,3-0,2 0,9-1-9 (48 на 8 сут)
15. 3.14 КМ (2/1) ~ 1,0-1,34 0,6-0,5 0,4 0,4-0,2 1,1-0,7 0,4-1,0 0,4-1,37 0,12-0,92 0,3-1,0 (45 на 5 сут)
* схемачередования; **фаза акселерации; КМ - костный мозг, ПК- периферическая кровь; [] - концентрация клеток; - интервал значений на кинетической кривой. указывает, что для чередования 2/1 и 2/1/2/1 данные приведены вначале для 1 этапа и далее для этапа 2 в соответствии с подзаголовками таблицы.
Характеристика пересечений при чередовании этапов пролиферации и созревания РІГ клеток 3 типа, выделенных из костного мозга и периферической крови больных ХФ ХМЛ, в культуре. См. примечания к табл. 1.______________________________________________________________________________________________________________________________
№ п/п Рис № № больного ХМЛ Схема чередования этапов Точки пересечения кривых скоростей накопления пролиферирующих [незрелых] (1этап) и созревающих клеток [зрелых] (2этап) Концентрация клеток в точках пересечения, 106 клеток /мл на этапах
Время пересечения, сут Продолжительность этапов, сут 1 2 Индексы P/D в точках пересечения № 1 2 3 Незрелых и зрелых 1 2 Сегменто ядерных (СЯ) 1 2
1. Рис. 1 3.1 КМ 1/2/1 2 3,5 2 1,5 2.5 1,1 1,2 0,5 0,65 0,24 0,34
2. Рис. 2 3.2 ПК 1/2 2,5 2,5 >4,5 1,06 0,4 - ОД -
3-4. Рис. 3 3.3 КМ ПК 1/2 1/2 2,5 5,5 2.5 8,5 5.5 5,5 ~ 2 - -1,0 0,49 0,53 - 0,26 0,38
5. Рис. 4 3.4 -КМ 1/2/1 0,2 6 ~ 0,2 5,8 1,15 1,2 - 0,37 0,8 0,17 0,58
6. Рис. 5 3.5 КМ 1/2 5- 5 3 1,0 1,53 - 0.37
7. 3.6 КМ 1/2 4,5 - 4,5 3,5 1,06 0,53 - 0,24 -
8. 9. 3.7 КМ ПК 1/2 1/2/1 2,5 -2,5 8,5 2.5 8,5 2.5 8,5 1,5 - -1,2 1,25 - 0,53 -0,54 0,4 0,4 -0,17 0,15
10. 3.8 КМ 1/2 5- 5 >2 1,5 - - 0,35 - 0,15 -
11. Рис. 6 3.10 ПК 2/1 3 - 4 3 1,4 - - 0,33 - 0,3 -
12. Рис. 7 3.11 ПК 2/1/2/1 5,5 7,5 11 2 5,5 0 3,5 1,15 1,15 0,80 0,75 0,6 од 0,43 0,3 0,06
13. Рис. 8 3.12 КМ 2/1/2/1/2 4,5 6 8 1,5 4,5 0 2,5 1 1,05 1,0 1,0 1,0 0,62 0,72 0,24 0,24 0,13 0,35 0,11 0,34
14. 3.13 ПК 2/1 4,0 1 4 1,7 - - 0,4 0,2
15. 3.14 КМ 2/1 4,0 1 4 1,0 0,6 0,4
Среднее значение индекса эффективности Р/D при пересечении кривых скоростей накопления на 1 и 2 этапах чередования 1,06 + 0,23 (21,7 %)
Рис. 1. Чередование этапов «преимущества пролиферации» и «преимущества созревания» по схеме 1/2/1 согласно кинетическим кривым пролиферации и дифференцировки в культуре Ph клеток (мононуклеаров), выделенных из КМ больного ХФ ХМЛ № 3.1 при установлении диагноза:
(а) - Дифференцировка (накопление и расходование) лейкоцитов;
(б) - Дифференцировка (накопление и расходование) гранулоцитов;
(в) - Индексы эффективности P/D, скорости пролиферации незрелых пролиферирующих клеток
и созревания нейтрофилов (зрелых);
(г) - Апоптоз и распределение гранулоцитов в фазах клеточного цикла.
Рис. 2. Чередование этапов пролиферации и созревания по схеме 1/2 согласно кинетическим кривым пролиферации и диф-ференцировки Ph+клеток из ПК от больного в ХФ ХМЛ № 3.2 в культуре:
(а-б) - Дифференцировка лейкоцитов, гранулоцитов;
(в) - Индексы эффективности P/D и скорости накопления пролиферирующих незрелых
и зрелых - созревающих без деления нейтрофилов;
(г) - Апоптоз и распределение гранулоцитов в фазах клеточного цикла.
а
%
е-
31
Э-
Время, сутки
—о— Ph+лейкоциты —*— миелоциты —х— ыертвые.%
- гранулоциты
- Лимфоциты
Дифференцировка и гибель лейкоцитов из ПК
Время, сутки
-Ph+лейкоциты-------Гранулоциты
- миелоциты —*— Лимфоциты
Время,сутки
— Бласты -*— миелоциты -п— палочкоядерные
- Прои/мелоциты
- метаилиелоциты
- сегментоядерные
Дифференцировка гранулоцитов из ПК
R-
В
-х—мертвые, %
■Бласты
■ миелоциты
■ палочкоядерные
Время,сутки
—■—Промиелоциты —о— метамиелоциты —•— се гменто ядерные
Индекс Р/D и скорости накопления зрелых и незрелых клеток из КМ
РЮ 12
Время, сутки
-незрелые —*—зрелые
-РУО (н/з)
Идекс РЮ и скорости накопления зрелых и незрелых клеток из ПК
е
P>D
Время, сутки
■ незрелые
■ РЮ (н/з)
■ зрелые
Рис. 3. Чередование этапов пролиферации и созревания (схема 1/2) по кинетическим кривым пролиферации и дифференцировки Ph клеток из КМ (а а) и ПК (г-е) от ХФ ХМЛ № 3.3 в культуре:
(а, г) - Дифференцировка лейкоцитов.
(б, д) - Дифференцировка гранулоцитов.
(в, е) - Индексы эффективности Р/D, скорости пролиферации и созревания.
%
,^ж------------*~|Х|
40
30
20
10
О
Р-
I
-живые КМ -апоптоз ПК,% -апоптоз КМ,%
2 4 6 8
Время, сут
-*— живые ПК
Индекс РЮ и скорость 0 накопления зрелых и НеЗреЛЫХКЛеТОКИЗКМ р£)
1,6 1,2 0,6 0,4 0,0
Время, сут
Время, сут
-х—мертвые КМ % -х— мертвые ПК%
-*—Сегментоядерные --О— Метамиелоциты ■ -■— Промиелоциты ■
- Миелоциты -Палочкоядерные -Бласты
-зрелые
-РЮ
-незрелые
Рис. 4. Чередование этапов пролиферации и созревания (схема 1/2) по кинетическим кривым пролиферации и дифференци-ровки Ph+клеток из КМ от больного в ХФ ХМЛ № 3.4 в культуре:
(а) - Рост и гибель популяции лейкоцитов из КМ и ПК.
(б) - Дифференцировка Ph+гранулоцитов из КМ.
(в) - Индексы P/D и скорости пролиферации незрелых и созревания нейтрофилов.
Рис. S. Чередование этапов пролиферации и созревания (схема 1/2) по кинетическим кривым пролиферации и диффе-ренцировки Ph+клеток из КМ (а) от больного ХФ ХМЛ № 3.5 в культуре:
(а) - Рост и гибель Ph+клеток.
(б) - Дифференцировка Ph+лейкоцитов.
(в) - Дифференцировка Ph+гранулоцитов.
(г) - Индексы эффективности P/D и скорости пролиферации незрелых и созревания нейтрофилов.
Дифференцировка гранулоцитов из ПК
&
JZ
а
е-
щи £
Время, сут
-Ph+лейкоциты-------Гранулоциты
■ Миелоциты —■— Лимфоциты
Индекс РЮ и скорости накопления незрелых и зрелых Ph + клеток из ПК
в
РЮ
Время, сут -Сегилентоядерные —*—Миелоциты - Бласты —■—Промиелоциты
-Метамиелоциты —0—Палочкоядерные
Апоптоз и распределение по g фазам клеточного цикла гранулоцитов из ПК
е-
%
8 ■ -т- - 3,5
7 /д д ■ 3 30
6 2,5
5 1 S*
12 Щ 20
4 - <D
- ' 1 ,5 ^
3 гт:
2 _ 1 "Sh -id
1 * 0,5
0 0 0
2 4
Время, сут
-Зрелые —&-
-РЮ
2 4
Время, сут
■ Незрелые
-Апоптоз -S
- sa;g2+m5
- S+G2M -G2+M
Рис. 6. Чередование этапов пролиферации и созревания по схеме 2/1 согласно кинетическим кривым пролиферации и диф-ференцировки Ph+клеток из ПК от больного в ХФ ХМЛ № 3.10 в культуре:
(а) - Дифференцировка лейкоцитов.
(б) - Дифференцировка гранулоцитов.
(в) - Индексы эффективности P/D и скорости пролиферации незрелых и созревания нейтрофилов.
(г) - Апоптоз и распределение гранулоцитов в фазах клеточного цикла.
Рис. 7. Чередование этапов пролиферации и созревания по схеме 2/1/2 согласно кинетическим кривым пролиферации и дифференцировки Ph+клеток из ПК от больного в ХФ ХМЛ № 3.11 в культуре:
(а) - Апоптоз и распределение гранулоцитов по фазам клеточного цикла.
(б) - Дифференцировка гранулоцитов.
(в) - Индексы эффективности P/D и скорости пролиферации незрелых клеток и созревания нейтрофилов.
Рис. 8. Чередование этапов пролиферации и созревания по схеме 2/1/2/1 согласно кинетическим кривым пролиферации и дифференцировки Ph+клеток из КМ от ХФ ХМЛ № 3.12 в культуре:
(а) - Дифференцировка Ph+лейкоцитов.
(б) - Дифференцировка Ph+гранулоцитов.
(в) - Индексы P/D и скорости пролиферации незрелых и созревания нейтрофилов
(г) - Апоптоз и распределение гранулоцитов в фазах клеточного цикла.
72
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И..
Первый максимум роста клеток на 2 этапе связан с накоплением и расходованием СЯ; второй максимум пролиферации Ph+клеток наблюдается уже при переходе к этапу пролиферации по мере значительной гибели СЯ (рис. 6 в). На 6-7 сутки пролиферируют миелоциты и истощаются нейтрофилы.
Доля клеток в фазах клеточного цикла также зависит от накопления СЯ. Повышенное накопление СЯ при начальном 2 этапе соответствует пониженному пролиферативному пулу S+G2/M клеток < 30 % на 1сут (клетки из ПК ХМЛ) и < 20 % для клеток из КМ ХМЛ (рис.7 а) и вместе с падением P/D2 указывает на ингибирование пролиферации Ph+клеток СЯ нейтрофилами. На 2-10 сут культивирования, т.е. при переходе к этапу пролиферации с ростом индекса P/D , доля клеток фазах S+G2/M <20 % (клетки из ПК) и < 10 % для клеток из КМ (рис. 7). Это указывает на ингибирование пролиферации всех Ph+клеток под действием СЯ в высокой концентрации, как и для ПД Ph+клеток 2 типа [3].
Нестабильность эффективности пролиферации в терминах соотношения клеток в S и S+G2/M фазах клеточного цикла отмечена ранее при ХМЛ [9].
Апоптоз и гибель клеток
при чередовании этапов ПД
Апоптоз на этапе созревания ингибирован, но он снова индуцируется на следующем этапе пролиферации, на котором концентрация СЯ активно уменьшается. С усилением апоптоза видна тенденция роста пролиферации на 10-11 сут. Апоп-тоз при этом возрастает от 10 % до 60 % , уменьшая концентрацию СЯ в 5 раз (от 0,7 до 0,15х106 клеток/мл). Отметим, что при концентрации СЯ > (0,3-
0,9)х106 клеток/мл на этапе созревания при чередовании по схеме 2/1/2 видны блокирование апоптоза, активация накопления СЯ (табл. 2 №№ 3.10-3.14) и ингибирование пролиферации и особенно миелои-тов, как и при ПД Ph+клеток 2 типа [3]. Так, на рис.6. б, г, видно существенное подавление пролиферации нейтрофилами СЯ в высокой концентрации (0,7х106 клеток/мл) на этапе созревания. В течение ~ 3 сут пролиферация всех клеток в фазах S+G2/M ниже 10 % (падает в 2,5-3 раза). Концентрация миелоцитов при этом падает ниже 0,1х106 клеток/мл. При переходе к этапу пролиферации содержание СЯ уменьшается, накопление миелоцитов увеличивается в 4 раза и растет индекс P/D1. Также видно увеличение апоптоза до >30% на 2-5 сут одновременно с истощением СЯ. При ПД Ph+клеток № .3.10-3.14 видно эффективное ингибирование пролиферации клеток под действием высокой концентрации СЯ и/или всех созревающих нейтрофилов (рис. 6-8 и табл. 1). На рис. 7 а, г апоптоз достигает 60 % и поэтому ингибирование пролиферации миелоцитов нейтрофилами СЯ уменьшается. На рис 8 в, г при чередовании этапов 2/1/2/1 видно значительное ингибирование пролиферации и уменьшение P/D2 до 0,1-0,9. За 11 суток в течение всех чередований 2/1/2/1 пролиферативный пул клеток в фазах клеточного цикла S+G2/M < 10 % . При низкой пролиферации на этапе созревания апоптоз ниже 10 % и его доля на 6-11 сут растет лишь до 20 % и только при переходе к 1 этапу. Общее пребывание Ph+клеток в условиях этапа созревания (рис. 8 и табл. 2) в три раза дольше, чем на этапе пролиферации. Это приводит к самому значительному ингибированию пролиферации и апоптоза из исследованных Ph+клеток 3 типа. На рис. 7 а-в максимум апоптоза также соответствует минимуму СЯ и максимумам накопления миелоци-
тов и значений P/D, что также означает заметное ингибирование апоптоза клетками СЯ.
Согласно мнению Т.В Ахлыниной и соавт., содержание СЯ >0,25-0,35 х106клеток/мл соответствует или даже ведет к подавлению апоптоза Ph+клеток 2 типа. Однако при ПД Ph+клеток 3 типа значительное подавление апоптоза происходит и при низкой [СЯ], если обеспечена высокая концентрация всех созревающих нейтрофилов:
(ММ+ПЯ+СЯ = 0,6-1,3х106клеток/мл).
Аналогичный эффект наблюдается также на рис. 8 при чередовании 2/1/2/1 (табл.1).
Роль чередования этапов ПД
Длительность этапов чередования, вероятно, также имеет значение для ПД Ph+клеток 3 типа. Продолжительность пребывания клеток на этапах пролиферации или созревания различна, но в сумме она больше на этапах пролиферации при чередовании по схеме 1/2/1 и меньше при чередовании 2/1/2 (табл. 2). При чередовании по схеме 2/1/2 пребывание на этапах созревания больше (4-9 сут), чем на этапах пролиферации, где оно ~ 1-3 сут (рис. 6 в, 7 в, 8 в и табл. 2).
При чередовании по схеме 1/2/1 продолжительность на этапах пролиферации составляет от 1 до 8 сут; на этапах созревания - от 3 до 8 сут, что зависит от исходных Ph+клеток, как и длительности этапов чередования.
На этапе созревания, кратком на рис. 2 и более продолжительном на рис. 1 и 3 видно, что с увеличением продолжительности этапа созревания усиливается ингибирование апоптоза, накопление СЯ (или всех нейтрофилов), ингибирование пролиферации и созревания Ph+клеток с уменьшением индекса P/D. Очевидно, что чем продолжительнее этап созревания, тем существеннее понижается эффективность ПД.
На 1-х этапах чередования 1/2 и 1/2/1 в начале цикла дифференцировки, когда наблюдается активация пролиферации на 1-3 сутки, видны разные, но часто повышенные значения P/D1 11; 3; 3,5; 2,5; 3,8-3,9 (табл. 1 образцы № 3.3, 3.5, 3.7 и 3.8 2. 1-й этап, следующий после этапа 2 с низкими P/D , имеет меньший индекс P/D1 от 1,0 до 2,4 для разных образцов Ph+клеток и по времени соответствует второй активации пролиферации в начале второго цикла дифф еренцировки (рис. 1, 2, 6-8). Это повышение P/D1 в начале 1 и 2 циклов дифференцировки по времени соответствует активной пролиферации в исследуемых Ph+клетках (на 1-3 и 6-8, 11-14 сутки). Оно предполагает зависимость регуляции 1 этапа пролиферации от содержания и пролиферативного потенциала миелоидных CD34 предшественников в Ph+клетках данного больного ХМЛ.
Судя по значениям P/D, пролонгирование этапа созревания способно подавить или отодвинуть следующий за ним этап пролиферации (табл.
2, № образцов 3.3, 3.7 КМ, 3.12).
Таким образом, чередование этапов ПД либо эффективной пролиферации Ph+клеток, либо эффективного созревания нейтрофилов, сменяющих друг друга с повышением или понижением эффективности P/D, участвуют в механизме регуляции и поддержания ПД в оптимальном режиме.
Нарушения механизма чередования, вероятно, являются причиной превращения ПД в одностадийную пролиферацию Ph+клеток 1 типа, ведущую к прогрессии ХМЛ, или к продолжительному этапу созревания Ph+клеток 2 типа со стойким угнетением пролиферации Ph+клеток [7; 3].
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И..
73
Инверсия порядка накопления нейтрофилов
при ПД Ph+клеток 3 типа
При чередовании на этапах созревания наблюдается последовательная инверсия обычного порядка (последовательности) накопления нейтрофилов М >ММ> ПЯ> СЯ в M>СЯ > ПЯ ~ ММ, аналогичная инверсии, наблюдаемой для ПД Ph+ клеток 2 типа [3]. Инверсия видна на рис. 1 б, в, 2 б, в и на рис. 6-8 для чередований: М > MM >СЯ >ПЯ в ——М > СЯ > ММ > ПЯ и снова —М > ММ > СЯ ~ПЯ. Отметим, что при 1 типе дифференцировки наблюдается обычный порядок созревания: последовательности накопления М>MM> ПЯ>СЯ без инверсии [8]. На этапах пролиферации Ph+клеток 3 типа - такой порядок также соблюдается.
Однако на этапах созревания+ рассматриваемых кинетических кривых ПД Ph+клеток 3 типа порядок накопления созревающих нейтрофилов изменяется. Скорость достижения максимумов на кинетических кривых СЯ, ПЯ и ММ замедляется, а накопление миелоцитов в области пиков нейтрофи-лов понижается. В максимуме накопления нейтро-филов наблюдается инверсия порядка (последовательности) накопления нейтрофилов. Последовательные изменения порядка накопления нейтрофи-лов по ходу дифференцировки видны на рис. 2-4, б, в. На рисунках видны частые изменения порядка накопления нейтрофилов с увеличением или уменьшением скоростей накопления, что показывают пересечения кривых накопления нейтрофилов с изменением направления и их пересечения. Одинаковые скорости накопления нейтрофилов на пересечении кривых позже на этапе пролиферации приводят к восстановлению обычного порядка накопления нейтрофилов, иногда неполного - М > ММ > СЯ > ПЯ.
Совокупность этих результатов означает, что изменения порядка накопления, иными словами скоростей накопления нейтрофилов в сумме и относительно друг друга, происходят достаточно часто по ходу кинетических кривых накопления ней-трофилов. Восстановление обычного порядка накопления нейтрофилов соответствует повышению содержания миелоцитов, индекса эффективности P/D и способствует ускорению пролиферации. Изменение скорости и инверсия порядка накопления нейтрофилов, будучи синхронно уменьшению индексов эффективности P/D (рис. 2-4, а, б), указывает на непосредственное участие нейтрофилов в регуляции ПД Ph+клеток с нарушением созревания самих нейтрофилов и с ингибированием пролиферации нейтрофилами, особенно СЯ.
Инверсия порядка накопления нейтрофилов при ПД в условиях созревания Ph+клеток обнаружена впервые в [3]. Она оказывается еще одним интересным свойством ПД Ph+клеток 2 типа в культуре. Очевидно, что накопление СЯ в результате блокирования апоптоза по цепочке обратной связи ведет к последовательному накоплению предыдущих по ходу дифференцировки нейтрофилов ПЯ и ММ и к нарушению регуляции созревания самих нейтрофилов. Так, накопление СЯ ведет к ингибированию созревания ПЯ, а ПЯ в свою очередь угнетает дифференцировку ММ. В конце концов, тормозится вся цепь созревания нейтрофилов, что сопровождается накоплением избытка всех нейтро-филов. При этом созревающие нейтрофилы в повышенной концентрации угнетают пролиферацию и понижают эффективность ПД. По достижении некоторого «критического» значения концентрации нейтрофилов индуцируется апоптоз, что освобож-
дает нейтрофилы от пресса обратной связи с торможением созревания. В результате концентрация нейтрофилов падает, восстанавливается порядок их накопления и регуляция их созревания, что ведет к росту индекса эффективности P/D и активации этапа пролиферации Ph+клеток.
Отметим, что в 3 случаях обнаружены различия в типах ПД Ph+клеток из ПК и КМ от одного больного ХМЛ. Так для 3.6 КМ обнаруживается 3 тип с чередованием 1/2, а в клетках из ПК 3.6 реализуется 1 тип ПД [8]. По 3 типу дифференцировались Ph+клетки из КМ 3.4 и 3.5 (рис. 4 и 5, табл.2) с чередованием 1/2/1 и 1/ 2. Клетки из ПК от этих же больных ХМЛ дифференцировались по 2 типу [3]. Можно предположить, что в ПК Ph+клетки 3 из 34 образцов потеряли способность к чередованию этапов пролиферации и дифференцировки по сравнению с клетками из КМ и что такие клетки, возможно, быстрее перемещаются из КМ в ПК. При этом все исследованные Ph+клетки КМ 3 типа были способны к чередованию этапов, а также большая часть клеток из КМ и ПК ХМЛ одновременно сохраняла эту способность.
Третий тип оказывается наиболее распространенным; он встречается у ~50% проб КМ и ПК исследованных больных ХМЛ, из которых две трети составляют Ph+клетки с чередованием этапов 1/2 и 1/2/1.
Результаты исследования ПД Ph+клеток 3 типа от разных больных ХМЛ в культуре выявили клеточную регуляцию ПД с чередованием ее этапов и активным участием в этой регуляции блокирования апоптоза и ингибирования пролиферации Ph+клеток созревающими нейтрофилами. Такие особенности ПД и апоптоза гемопоэтических клеток ранее не рассматривались [1; 4-6; 10; 11; 15-17; 21; 22; 24; 26; 27; 30].
Роль сегментоядерных нейтрофилов и особенно СЯ в ингибировании пролиферации Ph+клеток 2 типа ранее рассмотрена в [3].
При дифференцировке Ph+клеток 1 типа ранее наблюдали высокий уровень экспрессии антигена CD34. Максимальные эффективность P/D и экспрессия онкогена bcr/abl совпадали [2; 7]. До этих исследований сведения о клеточной регуляции ПД Ph+клеток нейтрофилами, созревающими без деления, и о регуляции чередованием этапов с высокой и низкой эффективностью ПД отсутствовали.
Зависимость активности пролиферации лейкоцитов от фаз ХМЛ, особенно при Бк, отмечена во многих работах [13; 19; 20; 29; 31; 38] и подтверждается нашими результатами, что подробно обсуждено в [3; 8].
При ПД Ph+клеток 1 и 2 типов наблюдаются нео+братимые процессы для ПД данного клона Ph+клеток, а при 3 типе изменения свойств остаются обратимыми, способными к чередованию типов ПД и к восстановлению свойств, изменяющихся на предыдущем этапе чередования. При 3 типе ПД Ph+клеток обнаруживается обратимое ингибирование пролиферации способных к делению Ph+клеток и обратимая инверсия обычного порядка созревания Ph+нейтрофилов под действием накопления СЯ и других нейтрофилов. Это предполагает, что генетическая регуляция ПД и чередование этапов пролиферации с созреванием о+посредуются клеточной регуляцией ПД зрелыми Ph+нейтрофилами при участии апоптоза. Ph+клетки 3 типа по регуляции ПД, вероятно, ближе к норме, чем Ph+ клетки 1 и 2 типа. При этом все три типа Ph+клеток, очевидно, зависят от особенностей bcr/abl, наследуемых Ph+клетками от разных больных ХМЛ.
74
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И..
Свойства ПД Ph+ клеток 3 типа показывают, что чередование этапа эффективной пролиферации с этапом эффективного созревания нейтрофилов является механизмом регуляции эффективности ПД (индекса P/D) и поддержания параметров ПД в оптимальном режиме.
Нарушения этого режима происходят при ПД Ph+клеток 1 типа, которые ведут к прогрессии ХМЛ, или к ПД Ph+клеток 2 типа с угнетением пролиферации Ph+ клеток соответственно [3; 8].
В работе A.M. Buckle и др. [12] при изучении клеточного цикла очищенных стволовых CD34+клеток от больных ХМЛ и от доноров показано, что стволовые Ph+клетки пролиферируют менее активно, чем стволовые клетки доноров, а более зрелые Ph+клетки накапливаются наоборот более активно. На этом основании авторы заключили, что причиной ХМЛ служит не управляемая экспрессией bcr/abl гена пролиферация Ph+клеток, а «дефект баланса самоподдержания и созревания этих клеток».
Противоречия в созревании нейтрофилов и ожидаемой активной пролиферацией Ph+клеток как первичного дефекта при ХМЛ активно обсуждались ранее при изучении колониеобразования Ph+клеток от больных ХМЛ [14; 35; 36] и других последующих исследованиях [19; 20; 29; 37].
Полученные нами результаты подтверждают «дисбаланс» пролиферации клеток-предшественников и позже созревающих нейтрофилов и выявляют и объясняют механизм этого «дисбаланса», заключающегося в регуляции эффективности ПД Ph+клеток чередованием этапов эффективной пролиферации и эффективного созревания при блокировании апоптоза и ингибировании пролиферации накапливающимися ней-трофилами. При этом характер «дисбаланса» зависит от наследуемых Ph+клетками от разных больных ХМЛ особенностей с его мутациями и изменениями сигнальных путей трансдукции с участием тирозинкиназы р210. Роль экспрессии bcr/abl онкогена в активации пролиферации Ph+клеток достоверно доказана многими исследованиями [10; 11; 15-18; 21-28].
Мы также наблюдали значительную экспрессию bcr/abl гена при ПД Ph+ клеток 1 типа № 1.1 [2] одновременно с ростом эффективности ПД и активной продукцией миелоидных CD34+клеток от этого больного ХМЛ [7].
Полученные результаты соответствуют данным [32] о корреляции экспрессии bcr/abl с накоплением пролиферирующих клеток-предшественников и инверсии этой корреляции вблизи этапа созревания и объясняют причину этой инверсии изменением механизма регуляции с активацией пролиферации при экспрессии bcr/abl онкогена на ингибирование пролиферации созревающими нейтрофилами в условиях блокирования апоптоза, что подробно обсуждается в [3]. Результаты перечисленных исследований в совокупности c нашими результатами способствуют формированию концепции клеточных и молекулярных механизмов ПД Ph+клеток in vitro для различных больных ХМЛ с их индивидуальными особенностями экспрессии bcr/abl онкогена.
Разработанный кинетический подход к исследованию ПД Ph+клеток от индивидуальных больных ХМЛ и полученные результаты позволяют оценивать эффективность ПД, пролиферативный потенциал Ph+клеток ex vivo и судить о способности Ph+клеток данного больного ХМЛ к прогрессии ХМЛ in vivo от момента отбора пробы до экспансии агрессивного мутантного клона. Предлагаемый подход может также служить элементом новой информативной модельной системы для изучения
лейкозов in vitro, пригодной для суждения о процессах in vivo, а также для оценки терапевтического эффекта новых и известных препаратов на разные этапы ПД Ph+клеток трех различающихся типов от индивидуальных больных ХМЛ.
Заключение
Обнаружена и исследована клеточная регуляция ПД Ph+клеток 3 типа, которая осуществляется при чередовании этапов эффективных пролиферации и созревания с ингибированием пролиферации накапливающимися нейтрофилами при блокировании апоптоза.
При ПД Ph+клеток 3 типа происходит неоднократное чередование этапов преимущественной пролиферации и преимущественного созревания, каждый из которых аналогичен ПД Ph+клеток 1 и 2 типов соответственно.
На этапе пролиферации скорость накопления пролиферирующих клеток выше скорости накопления созревающих без деления нейтрофилов. На этапе созревания, наоборот, скорость накопления нейтрофилов выше скорости пролиферации. При этом индекс эффективности P/D - соотношение скоростей пролиферации и созревания выше > или ниже < 1. Кинетические кривые показателей чередования пролиферации и созревания пересекаются и в точках пересечения (контрольные или равновесные точки) имеют одинаковые значения, так индекс P/D равен 1,06+0,23 и не зависит от времени и последовательности чередования, а также от источника Ph+клеток - разных больных ХМЛ.
На этапах чередования показатели напротив постоянно изменяются, увеличиваясь, уменьшаясь или проходя минимумы и максимумы. При возвращении к своему этапу чередования показатели восстанавливаются.
На эта+пе пролиферации P/D > 1, содержание незрелых Ph+клеток - миелоцитов и клеток в фазах клеточного цикла S+G2/M повышено, а зрелых ней-трофилов понижено. Апоптоз при этом индуцирован. При чередовании на этапах созревания, напротив, блокируется апоптоз, уменьшается эффективность P/D < 1 и содержание незрелых и миелоцитов. В результате повышается накопление созревающих нейтрофилов, особенно СЯ, ингибируется пролиферация Ph+клеток и уменьшается доля клеток в фазах клеточного цикла S+G2/M. В этих условиях инвертирует порядок (последовательность) накопления нейтрофилов в ряду от М > ММ > ПЯ> СЯ до СЯ > ПЯ >ММ >М и нарушается созревание нейтрофилов.
Чередование этапов ПД эффективной пролиферации и эффективного созревания нейтрофилов участвует в механизме клеточной регуляции эффективности P/D и поддержания ПД в оптимальном режиме. Механизм регуляции на этапе созревания опосредован ингибированием пролиферации миелоид-ных клеток-предшественников и нарушением созревания нейтрофилов накапливающимися в избытке нейтрофилами, особенно СЯ, при блокировании апоптоза. Ph+клетки 3 типа обнаружены у половины исследованных больных ХМЛ, все в ХФ ХМЛ. Ph+клетки 1 типа (~20 %) выделены от больных в прогрессирующих фазах ХМЛ, Ph+клетки 2 и 3 типов (~ 30 и 50 %) - от больных в хронической фазе ХМЛ с положительной реакцией на химиотерапию ХМЛ.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований, грант № 06-04-08372-офи.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РАЗЛИЧИЯ В ПРОЛИФЕРАЦИИ И..
75
Литература
1. Абдулкадыров КМ, Бессмельцев С.С., Рукавицын О А. Хронический миелолейкоз. - СПб: Специальная литература, 1998. - 463 с.
2. Ахлынина ТВ, Герасимова Л.П., Саркисян Г.П. и др. Кинетика пролиферации, дифференцировки и транскрипции генов, регулирующих апоптоз, BCR/ABL+Ph+клеток человека в культуре // Цитология. - 2007. - Т. 49. - С. 889-900.
3. Ахлынина ТВ, Гринева Н.И., Герасимова Л.П. и др. Различия в пролиферации и дифференцировке Ph+клеток в культуре. 2. Ph+клетки с низкой эффективностью пролиферации и способностью блокировать апоптоз // Российский биотерапевтический журнал - 2010. - Т. 9, № 2. - С. 3-12.
4. Владимирская ЕБ. Механизмы апоптоза клеток крови // Лабораторная медицина. - 2001. - № 4. - С. 47-54.
5. Владимирская Е.Б. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста. В кн. Биологические основы противоопухолевой терапии. - М.: Агат-Мед, 2001. - С. 5-32.
6. Руководство по гематологии под ред. А.И.Воробьева. - Т. 1. - М.: Ньюдиамед, - 2002. - 280 с.
7. Гринева Н.И., Барышников А.Ю., Герасимова Л.П. и др. Кинетика экспрессии антигенов в процессе пролиферации и дифференцировки Ph+клеток периферической крови при хроническом миелолейкозе в культуре // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т. 6, № 2. - С. 21-32.
8. Гринева НИ, Ахлынина ТВ., Герасимова Л.П. и др. Различия в пролиферации и дифференцировке Ph+клеток от разных больных ХМЛ в культуре.1. Три типа Ph+клеток при ХМЛ. Пролиферация и дифференцировка Ph+клеток с высокой эффективностью // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т. 10, № 4. - C. 53-68.
9. Шмаров Д.А., Кучма ЮМ, Козинец Г.И. Изменение стабильности параметров клеточного цикла клеток костного мозга при гематологических заболеваниях // Терапевт. Архив. - 1997. - № 7. - С. 17-21.
10. Bedi A., ZehnbauerB.A., Barber J. et al. BCR-ABL-mediated inhibition of apoptosis with delay of G2/M transition after DNA damage: a mechanism of resistance to multiple anticancer agents // Blood. - 1994. - Vol. 83. - P. 2038-44.
11. Bedi A., Barber J.P, Bedi G.C et al. Inhibition of apoptosis by BCR-ABL in CML//Blood. - 1995. - Vol. 86. - P. 1148-58.
12. Buckle A.M., Mottram R, Pierce A. et al. The effect of Bcr-Abl protein tyrosine kinase on maturation and proliferation of primitive haematopoietic cells // Mol. Med. - 2000. - Vol. 6. - P. 892-902.
13. Clarkson B, Strife A. Linkage of proliferarive maturational abnormalities in CML and relevance to treatment // Leukemia. - 1993. - Vol. 7. - P. 1683-721.
14. Clarkson B, Strife A., Perez A. et al. Integration of molecular and biological abnormalities in quest for selective treatment of CML // Leukemia & Limphoma. - 1993. - Vol. 11. - P. 81-100.
15. Cortez D, Kadlec L, Pendergast A.M. Structural and signaling requeirments for bcr-abl-mediated transformation and inhibition of apoptosis // Mol. cell. biology. - 1995. - № 10. - P. 5531-41.
16. Deininger M. W.N., Goldman J.M., Melo J. V The molecular biology of chronic myeloid leukemia//Blood. - 2000. - Vol. 96. - P. 3343-56.
17. Deininger M.W.N., Vieira S., Mendiola R. et al. BCR/ABL tyrosine kinase activity regulates the expression of multiple genes implicated in the pathogenesis of chronic myeloid leukemia // Cancer research. - 2000. - Vol. 60. - 2049-55.
18. Era T, Witte O.N. Regulated expression of P210 Bcr-Abl during embryonic stem cell differentiation stimulates multipotential progenitor expansion and myeloid cell fate // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol. 97. - P. 1737-42.
19. Golde D. W, Cline M.J. Human preleukemia: identification a maturation defect in vitro//New Engl. J. Med. - 1973. - Vol. 288. - P. 1083-6.
20. Golde D.W., Byers L.A., Cline M.J. Chronic myelogeneous leukemia cell growth and maturation in liquid culture // Cancer Research. - 1974. - Vol. 34. - P. 419-23.
21. Guzman M.L., Jordan C.T. Considerations for targeting malignant stem cells in leukemia//Cancer Control. - 2004. - Vol.
11, № 2. - P. 97-104.
22. Holyoake T.L., Jiang X., Eaves, A.C., Eaves C.J. Elucidating critical mechanisms of deregulated stem cell turnover in the chronic phase of chronic myeloid leukemia // Leukemia. - 2002. - Vol. 16. - P. 549-58.
23. Holyoake T.L., Jiang X., Jorgensen H.G. et al. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3 // Blood. - 2001. - Vol. 97. - P. 720-8.
24. Jaiswal S., Traver D., Miyamoto T. et al. Expression of BCR/ABL and BCL-2 in myeloid progenitors leads to myeloid leukemias // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2003. - Vol. 100. - P. 10002-7.
25. Jamieson C.H.M., Ailles L.E., Dylla S.J. et al. Granulocyte-macrophage progenitors as candidate leukemic stem cells in blast crisis CML // New England J Med. - 2004. - Vol. 351. - P. 657-67.
26. Lotem J., Sachs L. Control of apoptosis in hematopoiesis and leukemia by cytokines, tumor suppressor and oncogenes // Leukemia. - 1996. - Vol. 10. - P. 925-31.
27. Lugo T.G., Pendergast A.M., Muller A.J., Witte O.N. Tyrosine kinase activity and transformation potency of bcr-abl oncogene products // Science. - 1990. - Vol. 247. - P. 1079-82.
28. Melo J.V. The diversity of the BCR-ABL fusion proteins and their relationship to leukemia phenotype // Blood. - 1996. - Vol. 88. - P. 2375-84.
29. Niwa H., Burdon T., Chambers I., Smith A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells via activation of STAT3 // Genes & Development. - 1998. - Vol. 12. - P. 2048-60.
30. Ogawa M., Fried J., Sakai Y. et al . Studies of cellular proliferation in human leukemia. V1.The proliferative activity, generation time, and emergence time of neutrophilic granulocytes in CML // Cancer. - 1970. - Vol. 25. - P. 1031-49.
31. Passegrn E., Jamieson C.H.M., Ailles L.E, Weissman I.L. Normal and leukemic hematopoiesis: Are leukemias a stem cell
disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? // Proc.Nat.Acad. Sci. USA. - 2003. - Vol. 100. - P. 11842-9.
32. Perry S., Moxly J.H., Weiss G.H., Zelen M. Studies of leukocyte kinetics by liquid Scintillation counting in normal indi-
viduals and patients with chronic myeloid leukemia. // J. Clinical Investigation. - 1966. - Vol. 45, № 9. - P. 1388-99.
33. Primo D., Flores J., Quijano S .et al. Impact of BCR/ABL gene expression on the proliferative rate of different subpopulations of haematopoietic cells in chronic myeloid leukaemia // Brit.J.Haematol. - 2006. - Vol. 135. - P. 43-51.
34. Selleri C., Maciejewski J.P, Pane F. et al. Fas-mediated modulation of bcr/abl in CML results in differential effects on apoptosis //Blood. - 1998. - Vol. 92. - P. 981-9.
35. Stoklosa Т., Poplawski T., Koptyra M. et al. Bcr/abl inhibits mismatch repair to protect from apoptosis and induce point mutations // Cancer Res. - 2008. - Vol. 68. - P. 2576-80.
36. Strife A., Clarkson B. Biology of CML - is discordant maturation the primary defect? // Sem. Hematology. - 1988. -
Vol. 25. - P. 1-19.
37. Strife A., Lambek C., Wisniewski. et al. Discordant maturation as the primary biological defect in CML // Cancer Res. -1988. - Vol. 48. - P. 1035-41.
38. Traycoff C. V., HaisteadB., Rice S. et al. Chronic myelogenous leukaemia CD34+cells exit G0/G1 phases of cell cycle more rapidly than normal marrow CD34+cells // Brit. J. Haematology. - 1998. - Vol. 102. - P. 759-67.
