CC BY
52
УДК 576.3:616-006.446
Клеточная регуляция пролиферации и дифференцировки ex vivo клеток, содержащих Ph хромосому, при хроническом миелолейкозе
Н.И. Гринева*, Т.В. Ахлынина, Л.П. Герасимова, Т.Е. Манакова, Т.Г. Сарычева, Д.А. Шмаров, А.М. Тимофеев, Н.М. Найденова, Л.Ю. Колосова, Т.И. Колошейнова, Л.Г. Ковалева, С.В. Кузнецов, А.В. Воронцова, А.Г. Туркина
Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва, 125167, Новый Зыковский пр-д, 4а *E-mail: nigrin27@mail.ru
РЕФЕРАТ Обнаружена и изучена регуляция пролиферации и дифференцировки Ph+клеток от разных больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) ex vivo. Регуляция осуществляется при чередовании эффективных этапов пролиферации и созревания с ингибированием пролиферации Ph+клеток накапливающимися нейтрофилами при блокировании апоптоза. Чередование этапов состоит в переключении этапа 1 — эффективной пролиферации на этап 2 — эффективного созревания и протекает по схемам: 1/2—1/2/1 или 2/1—2/1/2/1. Кинетические кривые чередований проходят контрольные точки пересечения кривых, в которых показатели этапов пролиферации и созревания одинаковы. Индексы эффективности P/D равны 1.06 ± 0.23, они не зависят от времени, порядка чередования и от источников Ph+клеток — больных ХМЛ. На этапах пролиферации повышено содержание пролиферирующих клеток, понижено содержание нейтрофилов и индуцирован апоптоз. На этапах созревания, напротив, апоптоз блокирован, повышено содержание нейтрофилов и понижено содержание незрелых. При этом нейтрофилы в повышенной концентрации ингибируют пролиферацию Ph+клеток и нарушают свое созревание инверсией порядка созревания нейтрофилов, вероятно, по механизму обратной связи. Различия в регуляции выявляют три типа Ph+клеток больных ХМЛ, которые отличаются числом и продолжительностью этапов чередования. Ph+клетки 1-го и 2-го типов характеризуются одним длительным этапом эффективной пролиферации или эффективного созревания с индексами эффективности P/D1 = 1—20 или P/D2 < 1. Для Ph+клеток 3-го типа за тот же период чередование этапов протекает неоднократно с P/D1 = 1—4 или P/D2 < 1. Ph+клетки 1-го типа (~ 20 %) выделены от больных в прогрессирующих стадиях ХМЛ, Ph+клетки 2-го и 3-го типов (~ 30 и 50 %) — от больных в хронической фазе ХМЛ с положительной реакцией на химиотерапию ХМЛ.
Ключевые слова: регуляция пролиферации и дифференцировки Ph+клеток зрелыми нейтрофилами, культивирование гемопоэтических Ph+мононуклеаров, кинетика пролиферации и дифференцировки Ph+клеток in vitro, апоптоз Ph+клеток, распределение Ph+клеток в фазах клеточного цикла, эффективность пролиферации и дифференцировки Ph+клеток, инверсия порядка накопления созревающих нейтрофилов, хронический миелолейкоз.
Список сокращений: ПД — пролиферация и дифференцировка; ХМЛ — хронический миелолейкоз; Ph — Филадельфийская хромосома; СЯ, ПЯ, ММ — нейтрофилы сегментоядерные, палочкоядерные и метамиелоциты; Ph+клетки — гемопоэтические (кроветворные) клетки, содержащие Филадельфийскую хромосому; ПК — периферическая кровь; КМ — костный мозг; ХФ, ФА, БК — хроническая фаза, фаза акселерации и бластный криз ХМЛ; ЭТС — эмбриональная сыворотка теленка.
введение
Лейкозы составляют 1 % всех причин смертности населения и 4-10 % смертности от злокачественных новообразований. Встречаемость лейкозов и лимфом колеблется от 3 до 9 на 100 тыс. населения и сильно зависит от стран и регионов. При неблагополучной радиационной обстановке и экологии их встречаемость возрастает на полтора порядка. В США лейкозы являются основной причиной смерти детей до 15 лет.
Большинство лейкозов является результатом генетических перестроек: хромосомных аномалий, транслокаций, инверсий, делеций и многочисленных мутаций в процессе болезни [1-3, 6]
Клетки, содержащие Филадельфийскую хромосому (Ph+клетки) и экспрессирующие активную тирозинкиназу р210 или р185 (онкобелки, кодируемые геном Ьсг/аЫ), участвуют в патогенезе хронического миелолейкоза (ХМЛ). Хромосомная транслокация ^9;22)^34д11) протекает в ге-мопоэтической (кроветворной) полипотентной стволовой клетке с образованием Ph хромосомы и онкогена Ысг/аЫ1 в ее составе. Деление и дифференцировка этой клетки -моноклональный процесс - ведет к замене нормальных гемопоэтических клеток Ph+клетками и способствует возникновению и прогрессии ХМЛ [1- 8, 10, 12].
По диагностике и отношению к терапии течение ХМЛ у разных больных различается. Клеточные и молекуляр-
ные механизмы этих различий у больных ХМЛ не изучены. Представления о течении и прогрессировании ХМЛ in vivo составлены усреднением результатов многих анализов многочисленных параметров в отдельные моменты большого числа больных в разных фазах ХМЛ. ХМЛ протекает через хроническую фазу (ХФ), фазу акселерации (ФА) и острую, быстротечную фазу бластного криза (БК) с летальным исходом. В настоящее время в терапии лейкозов применяются высокоспецифичные (таргетные) препараты, блокирующие агрессивную тирозинкиназу р210, -иманитиб и его аналоги. Иманитиб увеличивает 6-летнюю выживаемость у 88 % пациентов. Из них 66 % продолжают принимать препарат, у 14 % ХМЛ продолжает прогрессировать, и 5 % больных прерывают лечение из-за токсичности препаратов. При этом наблюдаются новые мутации bcr/abl онкогена, которые ведут к резистентности при терапии и, хотя созданы новые поколения специфичных к ти-розинкиназе препаратов, проблема остается, т.к. ни один из них не уничтожает покоящихся лейкозных стволовых клеток. Менее 5 % пациентов в ХФ ХМЛ излечивается, у остальных возникают рефрактерные рецидивы ХМЛ [6]. В связи с этим необходимы новые подходы выбора препаратов, действующих на лейкозные стволовые клетки.
Несмотря на многочисленные исследования гемопоэти-ческих клеток, содержащих Ph хромосому и участвующих в патологии ХМЛ, в культурах и in vivo [4, 5, 7-12, 15-20,
23, 27], многое остается неясным в процессах, протекающих в первичных Ph+клетках от больных ХМЛ и при прогрессии ХМЛ. Отсутствует единая концепция биологических и молекулярных процессов при ХМЛ in vitro и in vivo и их связи между собой. Мало известно о закономерностях пролиферации и дифференцировки (ПД) Ph+клеток даже in vitro.
Неоднократно отмечались противоречия в процессах на клетках ХМЛ ex vivo по сравнению с клеточными линиями. При ХМЛ гемопоэтических пролиферирующих незрелых клеток образуется меньше, а нейтрофилов, созревающих без деления, больше, чем в норме [13, 14, 20-23, 26]. Стволовые Ph+клетки пролиферируют менее активно, чем стволовые клетки доноров, а более зрелые Ph+клетки накапливаются, наоборот, более активно [20, 23,
24, 27]. На этом основании предполагается, что причиной ХМЛ служит дисбаланс самоподдержания (self-renewal) стволовых клеток и пролиферации миелоидных клеток-предшественников с созреванием их поздних потомков, а не пролиферация Ph+клеток под действием тирозинки-назы р210 bcr/ abl, как это следует из многих других работ [4-7,10-12, 15, 16, 19, 24-29, 31].
Отметим, что представления о блокировании апоптоза в Ph+клетках также неоднозначны. Очевидно, что не все особенности клеточной и молекулярной регуляции Ph+клеток при ХМЛ ясны, хотя способность онкогена bcr/abl, кодирующего тирозинкиназу p210, определять ту-морогенные свойства, повышать жизнеспособность клеток, активировать в линиях Ph+клеток пролиферацию и блокировать апоптоз детально изучалась [7, 4, 17, 18, 25-27, 29, 30, 35, 43-45].
В работе [27] исследована роль разных мутантов р210 в клеточной пролиферации, туморогенности и апоптозе Ph+клеток, полученных трансфекцией генно-инженерными
конструкциями с различными мутациями в онкогене bcr/ abl. Показано, что функции p210 в активации пролиферации клеток и ингибирования апоптоза проявляются раздельно и обязаны разным мутациям в bcr/abl, в т.ч. отвечающим за изменения путей сигнальной трансдукции с участием разных СТАТ белков. Предполагается, что соотношение активации пролиферации и блокирования апоптоза и их баланс могут смещаться в разных направлениях и в разной степени в зависимости от мутаций в онкогене bcr/abl. Для Ph+клеток от больных ХМЛ такие свойства не изучены по причине отсутствия удобных моделей и подходов, хотя мутации в гене bcr/abl активно исследуются и используются для диагностики и выбора терапии при ХМЛ [19, 29, 30-32]. На основании изложенного мы предположили, что кинетика пролиферации и дифференцировки (ПД) Ph+клеток может обнаружить различия в регуляции ПД Ph+клеток индивидуальных больных ХМЛ ex vivo.
Целью данной работы являлось изучение механизма ПД ex vivo Ph+клеток от индивидуальных больных ХМЛ в суспензионной культуре с помощью разработанного нами ранее кинетического подхода к исследованию ПД Ph+клеток [33, 39]. При этом Ph+клетки от ХМЛ в культуре пролифе-рируют и дифференцируются аналогично схеме усиленного миелопоэза ХМЛ (кроветворения миелоидного отдела клеток) in vivo и для ПД можно определить эффективность ПД, влияние ростовых факторов, экспрессию гена bcr/abl и экспрессию дифференцировочных антигенов Ph+клеток.
экспериментальная часть
Использованы материалы: гепарин (Flow, Англия); Lim-phoprep, среда альфа-МЕМ (MP Biomedical, США); DEPC, Hepes, Трис, PBS, эмбриональная бычья сыворотка (ЭБС), цитрат Na, лаурилсаркозил (ICN, США); краситель трипа-новый синий, L-глутамин и 2-меркаптоэтанол (Serva, Германия), пенициллин и стрептомицин (ОАО «Биохимик», Саранск, Россия); Г-КСФ (F.Hoffmann-La Roche Ltd, Франция); PBS (10мМ фосфатный буфер + 0.13 М NaCl + 2.7 мМ KCl, pH 7.4) таблетированный, НПЦ «Эко-сервис», Россия.
Исследовали Ph+ мононуклеары, выделенные из ПК и КМ от больных ХМЛ в ХФ до лечения и в процессе лечения в ХФ, ФА и БК ХМЛ. При ХМЛ основное содержание мононуклеаров составляют лейкоциты и гранулоци-ты. Именно они исследовались в работе. Характеристики Ph+клеток и больных ХМЛ, из ПК и КМ которых получены мононуклеары, даны в табл. 1—3. В Ph+ клетках определены типы мРНК bcr/abl: b3a2, b2a2 или e1a2 с помощью метода RT-PCR (обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции) как указано в [33, 35].
Ph+мононуклеары из ПК и КМ получали, отбирая 1015 мл крови из вены или 1-2 мл КМ из заднего гребешка подвздошной кости больного на разных стадиях ХМЛ, во флакон с гепарином (50 ед/мл), наслаивали на Лимфо-преп или фиколл с плотностью 1.077 г/см3. Легкую фракцию Ph+клеток выделяли центрифугированием (30 мин при 1500 об/мин), дважды промывали буфером PBS, pH 6.8, затем а-МЕМ средой, суспендировали в а-МЕМ среде и использовали для анализа и культивирования. Фракция содержала клетки-предшественники (бласты), лимфоциты, гранулоциты и моноциты, а также некоторое количество созревающих нейтрофилов, что характерно для монону-
клеаров ХМЛ. Содержание живых и мертвых клеток анализировали трижды на мазках, окрашенных 0.2 %-ным трипановым синим по Романовскому, с подсчетом клеток в камере Горяева.
Культивирование Ph+клеток проводили аналогично [33]. 2-8 • 106 клеток/мл культивировали в суспензии с а-МЕМ средой, содержащей 10-20 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, 2 мМ L-глютамина, 10-4 М 2-меркапто-этанола, 100 ед/мл пенициллина и 50 ед/мл стрептомицина, 25 мМ HEPES-NaOH), pH 7.2-7.4 в 25 см2 пластиковом матрасе 2-3 ч, затем неадгезированные клетки центрифугировали 7 мин при 1500 об/мин разбавляли до концентрации [0.8-1.4 • 106] клеток/мл той же средой, переносили в 24- или 96-ячеечные платы по 12 ячеек на каждую пробу и инкубировали при 37 0С в условиях абсолютной влажности и 5 %-ного содержания СО2 в течение 2 ч без ЭТС. Затем добавляли ЭТС до 10-20 %, и клетки культивировали 6-14 сут, отбирая пробы отдельными ячейками. Ph+клетки в пробах отмывали от ЭТС центрифугированием в среде альфа-МЕМ и анализировали их морфологию и состав субпопуляций, распределение в фазах клеточного цикла и апоптоз. Отдельно определили, что 2-часовое выдерживание клеток без ЭТС и последующее культивирование с ЭТС замедляет рост клеток в течение ~ 6 ч. Далее скорость роста клеток восстанавливается, и через 12 ч культивирования состав субпопуляций не отличается от полученного без удаления ЭТС.
В отбираемых пробах анализировали число живых и погибших клеток, морфологический состав клеток на мазках в трех зонах по 100 клеток в каждой по методу Романовского и идентифицировали морфологию клеток по Абрамову [34], определяя содержание каждого вида клеток в каждой пробе. Концентрацию клеток в пробах вычисляли по их содержанию в расчете на 106 клеток/мл и получали кинетические кривые накопления и расходования субпопуляций Ph+лейкоцитов, гранулоцитов, а также суммы пролиферирующих клеток P (бластов, промиелоцитов и миелоцитов) и суммы нейтрофилов, созревающих без деления, клеток D - метамиелоцитов (ММ), палочкоядерных (ПЯ) и сегментоядерных (СЯ) нейтрофилов. Кривые отражали скорость образования одного вида дифференцирующихся клеток (накопления) с последовательным или параллельным его превращением (расходованием) в следующую субпопуляцию, известную для данной дифференцировки. Средняя ошибка составляла ± 5-11 %. В пробах также анализировали апоптоз и распределение клеток по фазам клеточного цикла с помощью цитофлуориметрии.
Ph хромосома в клетках ПК и КМ от больных идентифицирована цитогенетически для 100 митозов или методом FISH в лаборатории кариологии ГНЦ РАМН.
Цитофлуориметрический анализ кинетических кривых апоптоза и распределения Ph+клеток в фазах клеточного цикла при культивировании Ph+клеток.
Пробы Ph+клеток (по 5000 клеток) после выделения из КМ и ПК в градиенте плотности фиколла и пробы, отобранные в процессе культивирования, центрифугировали 7 мин при 2000 об/мин и 4 оС, промывали буфером PBS и по каплям фиксировали охлажденным 70 %-ным этанолом в течение 30 мин при 4 оС. Перед измерением полученную взвесь промывали PBS, центрифугировали и осадок ин-
кубировали в 0.5 мл PBS, содержащего 5 мкг/мл пропи-дий иодида и 50 мкг/мл рибонуклеазы А, в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте [36, 37]. Измерения проводили в проточном флуориметре EPICS-XL. Клетки гранулоцитарного гейта анализировали с помощью прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния и одновременно регистрировали флуоресценцию FL2 пика по амплитуде и площади импульса (это позволяло отсекать слипшиеся клетки, конгломераты и обрывки клеток) в линейном и логарифмическом масштабе и определяли клетки в апопто-зе. К клеткам, вышедшим в апоптоз, относили FL2-H частицы с гиподиплоидным набором ДНК, располагающиеся в виде пика влево от пика клеток с диплоидным набором ДНК (уменьшение размера клеток не более 2 порядков). Долю гранулоцитов, находящихся в апоптозе, определяли для клеток, анализируемых в гранулоцитарном гейте, где отсутствуют обрывки клеток. В тех же пробах Ph+клеток получали ДНК-гистограммы и в них анализировали распределение клеток по фазам клеточного цикла (S, G2/M, G1/0). Для анализа ДНК-гистограмм использована разработанная нами ранее специальная программа компьютерной обработки данных. В основу был положен алгоритм, разработанный для асинхронных пролиферирующих клеточных популяций (SFIT-метод) [38].
Кинетические кривые пролиферации Ph+лейкоцитов (кривые роста популяции Ph+клеток и их гибели) получали согласно доле живых и мертвых клеток, определяемых, как указано выше, и отнесенных к 106 клеток/мл. О скорости пролиферации лейкоцитов и гранулоцитов судили по кинетическим кривым их накопления и расходования при культивировании, а также по сумме их субпопуляций, определяемых по морфологии. Кинетические кривые показывали, что параллельно образованию/накоплению клеток соответствующей морфологии протекает превращение их в следующие субпопуляции. Расходование СЯ нейтрофи-лов указывало на их гибель.
Кинетические кривые дифференцировки Ph+лейкоцитов и их субпопуляций: миелоидных клеток, лимфоцитов, гранулоцитов и субпопуляций гранулоцитов: бластов, промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов, па-лочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов строили, вычисляя концентрацию соответствующих клеток в пробах и умножением их доли, определяемой по морфологии на мазках, на число клеток х 106/мл. Морфологию на мазках определяли, как указано выше. Состав клеток на мазках анализировали в трех зонах по 100 клеток в каждой. Отметим, что кроме морфологии Ph+клетки от ХМЛ № 1.1 и 2.6 идентифицировали по экспрессии антигенов CD с набором моноклональных антител, как указано в работе [39], где приведены результаты идентификации клеток и кинетики по экспрессии антигенов, согласующиеся с данными морфологии [33, 39].
Кинетические кривые индекса эффективности P/D гранулоцитов при культивировании Ph+лейкоцитов определяли как отношение скоростей накопления и расходования суммы пролиферирующих клеток, P [незрелые] (бла-сты, промиелоциты, миелоциты), и суммы нейтрофилов, созревающих без деления, D [условно зрелые], получаемые из кинетических кривых P и D клеток, как указано выше.
Индекс эффективности P/D определяли как соотношение скоростей накопления клеток P, пролиферирующих c дифференцировкой (скорость пролиферации), и клеток D, дифференцирующихся без деления (скорость созревания), эквивалентное соотношению концентрации клеток P и D на том основании, что Vp/VD = Kp [P] t/KD [D] t = KP/ KD • [P]/[D], где Vp и VD - скорости накопления клеток P и D, Kp и KD - константы скоростей, [P] и [D] -концентрации клеток. Кр/ KD = К - константа удельной эффективности ПД.
результаты исследования
Для изучения различий ПД в культуре Ph+клеток, выделенных из КМ и ПК больных в разных фазах ХМЛ, были получены кинетические кривые ПД 34 образцов Ph+мононуклеаров, выделенных из КМ и ПК 23 больных ХМЛ, при культивировании в строго одинаковых условиях. Ph+мононуклеары КМ и ПК содержат кроветворные клетки, способные при ПД в культуре к самоподдержанию (self-renewal - клонированию) и к ПД в течение 2-3 циклов ПД с образованием полного набора Ph+клеток [33, 39].
Бласты — Промиелоциты
—щ Миелоциты Метамиелоциты
■ от Палочкоядерные Сегментоядерньк
.2 КМ I
S 0.8 1 с 0.6 !> 0.4
Q.O
ИТ 0.2 j
о 0
* 0 2 4 6 8 I0
Время, сутки
Миелоциты Метамиелоциты
Бласты Палочкоядерные
Сегментоядерные Промиелоциты
.3 КМ 0.8 | 0.6 I I 0.4 0.2
I 0|_
о 0 2 4 6 8 Время, сутки
_f. миелоциты —*—бласты
метамиелоциты сегментоядерные
промиелоциты —палочкоядерные
\
\
0 2 4 6 8 I0 I2 I4 Время, сутки
Незрелые 4 Зрелые P/D (Н/3)
0 0.8
Е 0.6
ц 0.4
0,0 0.2
0
£
А
\
q.O
4 6 8
б P/D I.8 I.5 I.2 0.9 0.6 0.3
6 8 I0
Промиелоциты Метамиелоциты Сегментоядерные
I
0.8
0
| 0.6 | х0.4 |S0J
1 0
,_Незрелые
I-P/D (Н/3)
б P/D
Миелоциты
Палочкоядерные
Промиелоциты
0 2 4 6 Время, сутки
— Незрелые ш^^Зрелые —P/D (Н/3)
I.I ПК
1.2. ПК
a
0 2
10
Незрелые P/D (Н/3)
Сегментоядерн Метамиелоциты
езрелые
Рис. 1. Кинетические кривые образования и превращения субпопуляций Ph+клеток 1-го типа в составе мононуклеаров, выделенных из клеток костного мозга (КМ) и/или периферической крови ПК больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ), в суспензионной культуре: а — дифференцировка гранулоцитов с образованием субпопуляций пролиферирующих миелоидных клеток-предшественников (бластов), промиелоцитов, миелоцитов и созревающих без деления нейтрофилов: метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов; б — накопление и расходование пролиферирующих незрелых Ph+клеток — клеток P (суммы пролиферирующих миелоидных клеток-предшественников (бластов), промиелоцитов, миелоцитов) и созревающих без деления нейтрофилов — клеток D (суммы метамиелоцитов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов), а также изменения индекса эффективности P/D как соотношения скорости пролиферации клеток P и скорости созревания клеток D; в — кривые апоптоза и распределения Ph+гранулоцитов по фазам клеточного цикла при культивировании; 1. 1 ПК — Ph+клетки ПК от ХМЛ № 1.1, хроническая фаза (ХФ) до лечения с быстрой прогрессией ХФ ХМЛ в бластный криз; 1. 2 ПК и 1. 2 КМ — Ph+клетки от ХФ ХМЛ № 1.2; 1. 3 КМ и 1. 3 ПК — Ph+клетки в момент отбора пробы от ХМЛ в фазе акселерации (ФА) в процессе лечения и далее с быстрой прогрессией в бластный криз. Характеристика образцов и показатели пролиферации и дифференцировки Ph+клеток 1-го типа приведены в табл.1
Основную часть Ph+моно-нуклеаров при ХМЛ составляют лейкоциты [1, 7], и поэтому в составе мононуклеаров именно их рассматривали и анализировали в качестве Ph+ клеток. Субпопуляции лейкоцитов включают миелоидные клетки, гранулоциты, лимфоциты, моноциты; субпопуляции гранулоцитов содержат миелоидные клетки-предшественники (бласты), промие-лоциты, миелоциты и нейтрофилы включают: метамиелоциты (ММ), палочкоядерные (ПЯ) и сегментоя-дерные (СЯ).
Характеристика Ph+клеток и их источников - больных ХМЛ даны в табл. 1—3. В пробах клеток по ходу культивирования получены кинетические кривые роста популяции Ph+лейкоцитов и их гибели в культуре, их пролиферации, а также кривые дифференцировки субпопуляций Ph+гранулоцитов: бластов, промиелоцитов, миелоци-тов и нейтрофилов: ММ, ПЯ и СЯ. В тех же пробах получены также кривые апоптоза и распределения Ph+клеток в фазах клеточного цикла (рис. 1—4). В опытах наблюдалось повышенное содержание грануло-цитов, характерное для ХМЛ [1, 6, 14]. Характер полученных кривых указывает на скорость образования (накопления) данного вида клеток и их последовательно-параллельные превращения (расходование) с образованием следующей субпопуляции и в конце гибель клеток. Полученные кривые, таким образом, отражают основные процессы дифференци-ровки (рис. 1—4 и табл. 1—3). Диф-ференцировка лейкоцитов соответствует известным для ХМЛ данным [1-3, 21, 22, 40-42].
Кроме скорости дифферен-цировки отдельных субпопуляций (рис. 1—4 а) рассматривались кривые скоростей пролиферации и созревания. В первом случае это кривые накопления клеток Р, дифференцирующихся одновременно с делением и включающих бласты - предшественники миелоидных клеток, промиелоциты, миелоциты. Во втором случае это кривые накопления нейтрофилов, клеток D, созревающих (дифференцирующихся) без деления и включающих ММ, ПЯ и СЯ клетки (рис. 1—4 б).
Таблица 1. Пролиферация и дифференцировка Ph+клеток 1-го и 2-го типов в культуре
2-й тип Ph+клеток, P/D2 < 1. Эффективное созревание (скорость накопления нейтрофилов (зрелых) больше скорости накопления незрелых Ph+клеток. Концентрация [з] > [нз].
Образцы мононуклеаров, выделенных из ПК или КМ больных ХМЛ Показатели пролиферации и дифференцировки
№ п/п № образца ПК или КМ ХМЛ Диагноз, лечение до отбора пробы Тип bcr/abl РНК. Лейкоциты • 109/ л; % бластов P/D, [нз]/ [з] Продолжительность этапа P/D, сут [СЯ]/ [Миелоциты] СЯ • 106 клеток/ мл, мах /на сут Нейтрофилы • 106 клеток /мл мах /на сут Апоптоз (гибель), % /на сут
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1-й тип Ph+клеток, P/D' > 1. Эффективная пролиферация (скорость накопления незрелых Ph+клеток больше скорости созревания нейтрофи-лов). Концентрация [нз] > [з].
1 1.1 ПК ХФ b3a2 L115; 3 %; 12-4 4-1 14 0.140.0 -0.27 0.17 0.53/ 7 -0.32 -0,65/ 14 (28/ 7 50/ 14)
2 3 1.2 КМ ПК ХФ, ГОМ* b3a2 L 72 бласты 3 % 1.2-1.6 2.4-1 8 8 0.41 0.5 0.2 0.2 / 3 0.67 0.58 / 3 33 / 4 (30/ 9)
4 5 1.3 КМ ПК ФА ПХТ** b2a2 бласты 17 % 3-9 1-13 > 8 0.1-0.54 0.1-0.31 0.13 / 8 0.17/ 0-4 (14/ 8)
6 1.4 ПК БК лимфоид-ного типа, ПХТ** b2a2 бласты 30 % > 20- 2 > 6 0.0 0/ 0-6 0.4 / 6 (47/ 6)
7 1.5 ПК ХФ, ГОМ* b3a2 L 175 Бласты 5 % 1.2-2.5 < 8 0.14-0.53 0.08 / 4 0.32-0.2 / 4, 8 (21 / 7)
1 2.1 ПК ХФ^ БК ГОМ* b3a2, L 188-145, 2 % 0.3-0.8 > 6 1.0-1.62 -0.4 0.47/ 2 1.2/ 2 40/1 4/ 3 55/6
2 2.2 КМ ХФ ГОМ* 4сут b3a2 0.8-1.5 > 5 0.8-0.4-1.0 0.5 / 2 0.7/1 0.6/5 (4/1 11/ 5)
3 2.3 ПК ХФ b3a2 0.4-1.0 - 6 0.4-0.8 0.25/3 0.7/3 (2/3 19/7)
4 2.4 ПК ХФ, 2-я группа риска, *** b3a2, L 165, бласты 2 % 0.3-1.2 - 7 0.73/4 2.4/ 8 0.86/8 2.4/4 1.3/8 (2/4 33/11)
5 2.5 ПК ХФ b2a2 0.1-1.11.6 - 7 1.4/5 0.7/5 1.13/5 (3/2 2/5 17/7)
6 7 2.6 ПК КМ ХФ b3a2 0.2-1.0 0.3 -1.0 > 9 8/6 24/11 0.41/6 0.7/6 0.1/11 (2/6 24/11)
8 9 2.7 КМ ПК ХФ b2a2 1.5 1.5 - 4-6 - - 1.1/3 1.3/7 (15/1 2/2-7 2/ 3 12/8)
Лечение до отбора пробы: *гидроксимочевина; **полихимиотерапия; *** реаферон.
ПК, КМ — периферическая кровь, костный мозг — источник мононуклеаров. ХФ, ФА и БК — хроническая фаза, фаза акселерации и бластный криз — фазы развития ХМЛ.
типы ph+ клеток от больных хмл
При миелопоэзе (ПД миелоидного отдела кроветворения) вначале пролиферируют с одновременной дифференци-ровкой гемопоэтические клетки-предшественники и их незрелые потомки. Затем по мере ПД без деления созревают нейтрофилы [3, 40, 41]. В данной работе получены и исследованы кинетические кривые ПД ex vivo 34 образца Ph+клеток из костного мозга (КМ) и периферической крови (ПК) 23 больных ХМЛ. Кривые демонстрируют заметные различия в ПД Ph+клеток от индивидуальных больных ХМЛ.
Кинетические кривые отражают скорость двух ключевых процессов, составляющих ПД: пролиферацию с одновременной дифференцировкой и дифференцировку без деления клеток (созревание нейтрофилов). При этом соотношение скоростей пролиферации (накопления клеток P) и созревания (клеток D) отражает эффективность пролиферации Ph+клеток относительно созревания нейтрофилов и выражается индексом P/D, который является мерой эффективности ПД. Как видно, скорость пролиферации может быть выше или ниже скорости созревания, и, следовательно, ПД протекает с преимуществом пролиферации
P/D
2 4 6 Время, сутки
Миелоциты Сегментоядерные
1.2 %
0.6 0.4./ 0.2il 0,-
2 4 Время,сутки
-P/D(H/3)
2 4 6 Время, сутки
2 4 6 Время, сутки
2 4 6 Время, сутки
Сегментоядерные — Метамиелоциты _ Промиелоциты
_ Зрелые - P/D
Сегментоядерные
— Метамиелоциты —
— Бласты —
Миелоциты — Палочкоядерные Промиелоциты
— Зрелые -P/D
Рис. 2. Кинетические кривые образования и превращения субпопуляций РНг+клеток 2-го типа в составе мононуклеаров, выделенных из клеток КМ и/или ПК больных ХМЛ, в суспензионной культуре. Обозначения а, б и в даны на рис. 1. Обозначения 2 . 1 ПК, 2. 2 КМ, 2. 4 ПК и 2. 5 ПК - образцы Р1п+клеток от ХФ ХМЛ № 2.1, 2.2, 2.4 и 2.5 соответственно. При длительном наблюдении больных прогрессии ХМЛ не отмечено. Характеристика образцов и показатели пролиферации и дифференцировки РН|+клеток 2-го типа приведены в табл. 1
2.1 ПК
Незрелые
S
S+G2/M
G2/M
Время, сутки
Миелоциты Палочкоядерны
Незрелые
Незрель
(эффективная пролиферация) или с преимуществом созревания (эффективное созревание). Индексы эффективности в первом случае P/D1 > 1, во втором случае индексы эффективности P/D2 < 1 (рис.1—4, табл.1—3).
У ~ 20 % больных ХМЛ при ПД длительно протекает исключительно эффективная пролиферация. Это Ph+клетки 1-го типа, их P/D1 = 1-20 (рис. 1, б, табл. 1). При ПД Ph+клеток от других больных протекает только эффективное созревание с P/D2 < 1. Это Ph+клетки 2-го типа, их обнаружено ~ 30 % (рис. 2, б, табл. 1). По ходу ПД индексы P/D этих клеток изменяются в границах своих P/D. На рис. 1, 2 и табл. 1 видно, что по продолжительности ПД Ph+клеток 1-го и 2-го типа (7-14 сут) сопоставима с 1-2 циклами дифференцировки клона гемопоэтических клеток [3, 40, 41].
Однако ПД Ph+клеток от большинства больных протекает с неоднократным чередованием эффективной пролиферации и эффективного созревания. Другими словами, чередование этапов либо с преимуществом скорости пролиферации и повышенным индексом P/D P/D1 > 1-4, либо с преимуществом созревания и c низким индексом P/D < 1 (рис. 3, б, 4, б и табл. 2 и 3). Эти Ph+клетки составляют 3-й тип. Чередования эффективной пролиферации (1-й этап) и эффективного созревания нейтрофилов (2-й этап) видны по пересечениям кинетических кривых накопления про-лиферирующих клеток (незрелых) и созревающих нейтро-филов (зрелых) (рис. 3 и 4, б, табл. 3). При ПД Ph+клеток 3-го типа встречаются одно-, двух- и трехкратные чередования этапов, которые сменяют друг друга по схемам: 1/2 -1/2/1 или 2/1-2/1/2/1 с частотой чередования от 0.2-6 сут (табл. 2 и 3). При чередовании этапов ПД по схеме 1/ 2 - 1/2/1 скорости и, следовательно, концентрации клеток изменяются в ряду [нз] > [з] ^ [з] > [нз] ^ [нз] > [з] (рис.3: 3.1—3.4, б). При чередовании этапов по схеме 2/1 - 2/1/2
скорости и концентрации изменяются в ряду: [з] > [нз]^ [нз] > [з]^ [з] > [нз] (рис. 4: 3.10-3.12, б). пД Ph+клеток 1-го и 2-го типов можно рассматривать как частные случаи пролонгированных этапов чередования пролиферации и созревания ПД Ph+клеток 3-го типа.
В момент пересечения кривых эффективной пролиферации и эффективного созревания происходит смена этапов чередования, скоростей накопления Ph+клеток и других показателей ПД. В точках пересечения скорости пролиферации и созревания одинаковы, как и их индексы эффективности. При этом P/D = 1.06 ± 0.23, и это значение не зависит от схемы, времени и последовательности чередования, а также от концентрации клеток (табл. 2 и 3). Точки пересечения можно назвать равновесными или критическими. Другие характеристики этапов пересечения, которые можно ожидать совпадающими, такие как концентрации незрелых клеток, зрелых нейтрофи-лов (0.4-0.7 • 106/мл) и СЯ (0.1-0.4 - 106/ мл), также имеют близкие значения (табл. 3). Однако заметные колебания (1.53-0.1 • 106/мл для КМ 3.5, ПК 3.10,3.11 и КМ 3.12 в табл. 3) предполагают зависимость от концентрации.
В течение чередований характеристики этапов, напротив, постоянно меняются (табл. 2). Показатели увеличиваются или понижаются, проходят минимумы и максимумы. Эти события на этапах, как правило, происходят асинхронно друг другу (рис. 1—4 и табл. 2). Характер изменения индексов P/D зависит от этапа чередования. Они растут или уменьшаются в своих пределах: P/D1 = 1-4, P/D2 < 1. Исключение составили клетки из КМ № 3.3, P/D1 которых уменьшается от 11 до 1, что занимает 3 сут до момента равновесия и перехода к этапу созревания. На этапе созревания P/D2 колеблется от 0.1-1 до нового этапа пролиферации, где индексы P/D1 > 1. Это означает, что соотно-
Таблица 2. Показатели чередования этапов эффективной пролиферации и эффективного созревания при пролиферации и дифференцировке РНг+клеток 3-го типа в культуре
№ п/п и № рис. № ХМЛ (*) Показатели этапа пролиферации Max или интервал (сут) Показатели этапа созревания Min, мах или интервал (сут) [СЯ]/ [миелоци-тов] Апоптоз (гибель), %
P/D1 106 клеток/мл P/D2 Min Max, 106 клеток/мл
[нз] [з] [СЯ] [нз] [з] [СЯ]
Чередование этапов по схемам 1/2 или 1/2/1 с изменением скоростей накопления и концентраций [нз] > [з] ^ [з] > [нз] ^ [нз] > [з]
1, Рис. 3 3.1 КМ (1/2/1) 1.4-1.1 1,2-2,3 0.35-0.5 0.64- 0.5 0.29-0.5 0.63-0.2 0.1-0.25 0.3 -0.1 0.9 (на 3-е сут) 0,71 (на 3-е сут) 0.8 (на 3-е сут) 0.4 (на 3-е сут) 0.5-0.2 5-12
2, Рис. 3 3.2** ПК (1/2) 1.3-1.2 0.4 0.30 0.05 0.85 0.4-0.3 0.53 0.16 0.5 -0.25 < 5
3 4 Рис. 3 3.3 КМ ПК (1/2) 11- 2 1.32-1.5 0.6-0.46 0.5-0.8 0.02-0.5 0.4-0.5 0.01-0.4 0.14 -0.25 0.1 1.0-0.2 0.5-0.1 0.5- 0.1 0.6 (3 сут) 0.6 (7 сут ) 0.4-0.2 0.3-0.2 0.1-2.5 0.1-1-2.5 (7 на 11-е сут)
5 Рис. 3 3.4 КМ (1/2/1) 1.2 1.53 0.4-0.80.5-1.1 0.34 0.17 0.52-0.34 0.57-0.34 1.1 0.7 0.4-1.3-2 (18 на 5-е сут)
6 3.5 КМ (1/2) 3.43-1.0 1.95 1.65 0.03-0.37 1.0-0.3 1.53-0.4 1.53-1.21 0.37-0.5 0.190.25-2.0 (30 на 11-е сут)
7 3.6 КМ (1/2) 1.61 0.61 0.52 0.24 0.28 0.13-0.56 0.52 -0.4-0.6 0.24 0.13 -0.5-1.0 (22 на 11-е сут)
8 9 3.7 КМ (1/2) ПК (1/2/1) 2.5-1.4 2.2-1.2 1.2-1.4 0.65-0,60 0.51-0.54 0.38-0.32 0.55 0.5 -0.54 0.4-0.2 0.3 0.05-0.19 0.15-0.07 0.7-0.4 0.78 0.55 0.57-0.38 0.83 0,.73 0.53 0.27 0.1-0.5 (30 -35 на 10-11-е сут)
10 3.8 КМ (1/2) 3.9-1.5 0.53-0.35 0.14-0.35 0.02-0.22 1.5-0.5 0.35-0.23 0.35-0.44 0.2-0.4 0.04-0.3 (45 на 7-е сут)
Чередование этапов по схемам 2/1 или 2/1/2 с изменением скоростей накопления и концентраций [з] > [нз] ^ [нз] > [з] ^ [з] > [нз]
11, Рис. 4 3.10* ПК (2/1)« 1.4 -3.1-2.0 0.3-0.6 -0.4 0.3-0.2 0.17-0.25 0.2-0.5 0.13-0.3 0.5-0.8-0.3 0.35-0.7 8.5-0.3 34-22 на 2-5-е сут
12, Рис. 4 3.11 ПК (2/1/2)« 1.15-1.63 0.8-0.6 0.6-0.8-0.1 0.43-0.3 0.33-1.15 0.75-0.8 0.2-0.8, 0.6-0.8-0.1 0.5-1.3-0.8, 0.8-0.1 0.16-0.75-0.4, 0.39-0.06 1.2-0.2 35 на 1-е сут, 63 на 4-е сут
13, Рис. 4 3.12 КМ (2/1/2/1/2) « 1.0-1.32 1.0 0.7-0.78 0.24 0.6 0.24 0.14-0.35 0.12 0.5-0.7-1.0 1.0-0.8-1.0 0.6-0.7 0.6 0.2 0.4—0.95 0.6 0.14-0.5 0.34 0.1 0.9-0.2 7, 22 на 6, 11-е сут
14 3.13 ПК (2/1) « 1.7-2.5 0.39 0.4-0.2 0.2-0.1 0.45-1.7 0.42 0.9-0.4 0.3-0.2 0.9-1-9 (48 на 8-е сут)
15 3.14 КМ (2/1) « 1.0-1.34 0.6-0.5 0.4 0.4 - 0.2 1.1-0.7 0.4-1.0 0.4-1.37 0.12-0.92 0.3-1.0 (45 на 5-е сут)
Примечания: *схема чередования; **фаза акселерации; КМ — костный мозг, ПК — периферическая кровь; скобки [] обозначают концентрацию клеток; дефис — интервал значений на кинетической кривой. Стрелка ^ указывает, что для чередования 2/1 и 2/1/2/1 данные приведены вначале для 1-го этапа и далее для этапа 2 в соответствии с подзаголовками таблицы.
шение скоростей пролиферации и созревания - их индексы эффективности P/D и концентрации пролиферирующих и созревающих клеток, особенно СЯ, являются весьма значимыми показателями ПД Ph+клеток.
Анализ кинетики образования субпопуляций грану-лоцитов, кинетики апоптоза и распределения Ph+клеток в фазах клеточного цикла в сочетании с различиями в ин-
дексе эффективности P/D и в скоростях этапов ПД: пролиферации и созревания Ph+клеток приводит к следующим результатам.
ПД Ph+клеток 1-го типа протекает в условиях длительной эффективной пролиферации с индексами P/D > 1-2 - 20 и долей Ph+клеток в S+G2/M фазах клеточного цикла > 20-45 % со скоростью пролиферации большей, чем
к, 0.6
а
! = 0.4 0.2 i 0l
о 0 2 4 6 Время, сутки
Миелоциты Сегментоядерные
Метамиелоциты Палочкоядерные Бласты Промиелоциты
К
4
о
Ü! 3
S J 2 Р 1 t 0
£ 0 2 4 6 Время, сутки
Миелоциты Метамиелоциты
Сегментоядерные Палочкоядерные
Промиелоциты
2 4 6 Время, сутки
p/D 2.5 2
1.5 1
0.5 0
-P/D 6
54
1
0
0 2 4 6 Время, сутки
-S+фаза —G2/M -S+G2/M —»- апоптоз
2 4 Время, сутки
30
2 4 6 Время, сутки
Бласты
3.3 КМ
—Зрелые Незрелы»
-P/D (Н/P)
-S+Gi/М _ Gi/М
0.4
0
Ü 0.3
16 0.2 S.2 £ 0.1 з
1 0
* 0 2 4 6 8 10
Время, сутки
Сегментоядерные а Миелоциты
— Палочкоядерные ^^^Бласты
- Метамиелоциты ■ Промиелоциты
б P/D
0 2 4 6 8 10 Время, сутки
- Зрелые —Незрелые -P/D (Н/З)
0 2 4 6 Время, сутки
Сегментоядерные Палочкоядерные Промиелоциты
Миелоциты
Метамиелоциты
Бласты
Зрелые P/D
P/D 2.0 1.6 1.2
0.8 0.4 0
2 4 6 Время, сутки
Незрелы
Рис. 3. Кинетические кривые дифферен-цировки в культуре РН|+клеток 3-го типа в составе мононуклеаров с чередованием эффективной пролиферации и эффективного созревания по схеме 1/2 и 1/2/1. Обозначения а, б и в даны на рис. 1. Обозначения 3.1 КМ, 3.2 ПК, 3. 3 КМ, 3. 3 КМ и 3. 4 КМ соответствуют номерам образцов РН|+клеток от больных в ХФ ХМЛ. Характеристика образцов и показатели пролиферации и дифференцировки РНг+клеток 3-го типа приведены в табл. 2 и 3
КМ
Незрел
б
20
10
0
3.4 КМ
б
а
0
скорость созревания (рис. 1.2, 1.3 а, б, е). ПД ведет к повышенному накоплению миелоцитов, промиелоцитов и/или бластов и низкому накоплению нейтрофилов (рис. 1, а, б: 1.1-1.3 и № 1.4 в табл.1) при активном апоптозе (рис. 1, е). Чем ниже содержание нейтрофилов, созревающих без деления, тем выше индекс P/D (рис.1: 1.1-1.3, б) и тем серьезнее прогрессия ХМЛ (табл. 1). Эти Ph+клетки выделены из КМ или ПК от больных ХМЛ в фазах ФА, БК и ХФ с активной прогрессией ХМЛ и составляют пятую часть исследованных проб Ph+клеток.
ПД Ph+клеток 2-го типа длительно протекает при эффективном созревании с низкой эффективностью P/D < 1 при скорости созревания нейтрофилов выше скорости пролиферации в условиях блокирования апоптоза (рис. 2, табл. 1). ПД Ph+клеток 2-го типа ведет к значительному накоплению нейтрофилов, которые ингибируют пролиферацию Ph+клеток и миелоцитов. Блокирование апоптоза при созревании нейтрофилов происходит асинхронно накоплению миелоцитов и индукции апоптоза. Падение индекса P/D сопровождается накоплением СЯ, а рост P/D - расходованием СЯ (рис. 2, а, б, е, и № 2.1 - 2.7 в табл. 1). Видно, что концентрация нейтрофилов существенно выше, чем пролиферирующих Ph+клеток.
Важная характеристика пролиферации - распределение клеток по фазам клеточного цикла. Кинетические кривые распределения Ph+гранулоцитов 2-го типа в фазах S и G2/М показывают, что их изменения по ходу ПД зависят от источника Ph+клеток - больного ХМЛ. На рис. 2.1, 2.2, е видно, что доля пролиферирующих Ph+клеток в фазах S+G2/M < 20-40 %, а в G2/M фазах ~ 15 %. Другой показатель пролиферации - отношение S/(G2+M) равно 1.2. Максимальная доля клеток в S+G2/M фазе на 1 сут составляет 43 %, а в S фазе ~ 30 % и затем быстро понижается до 12 %. Индекс P/D при этом 0.6-0.8 (рис. 2.2, б). Доля про-
лиферирующих клеток 2-го типа (рис. 2.2, е) близка доле Ph+клеток 1-го типа (рис. 1.2, е). Однако продолжительность существования повышенной доли клеток в фазах S+G2/M у Ph+клеток 2-го типа короче, чем при пролиферации Ph+клеток 1-го типа, где доля пролиферирующих клеток > 43 % поддерживается почти 6 сут с отношением S/(G2+M) ~ 2.4-2.7 и эффективностью P/D 1.2-1.6. Для ПД Ph+клеток 2-го типа это означает преимущество скорости созревания над пролиферацией. При культивировании доля пролиферирующих злокачественных клеток линии К562 (производной от бластного криза ХМЛ), в фазах S+G2/M достигает 44 ± 3 % и мало изменяется в течение 7 сут. Отношение S/(G2+M) при этом достигает 4.4. По сравнению с этими величинами ПД Ph+клеток 2-го типа характеризуется пониженной долей клеток в фазах клеточного цикла S+ G2/M (< 20 - 40 %) при укороченной продолжительности пролиферации (< 3 сут) и низким индексом эффективности P/D < 1 (рис. 2.1 и 2.2, б, е).
Кинетические кривые дифференцировки Ph+лейкоцитов 2-го типа показывают до 80 % содержания гранулоцитов, а миелоциты в субпопуляциях Ph+лейкоцитов составляют не более 25 %. Содержание зрелых нейтрофилов, особенно СЯ, при этом достигает ~ 40 % (рис. 2.1-2.5, б и № 2.1-2.6 в табл. 1). В процессе ПД СЯ и все нейтрофилы активно накапливаются и мало расходуются. Максимальная концентрация СЯ временами в 2 раза больше, чем миелоцитов (рис. 2.1 —2.5, а, б, е и табл. 1), что указывает на роль зрелых клеток, особенно СЯ, в регуляции ПД Ph+ клеток 2-го типа.
В совокупности обнаруживается, что популяция Ph+лейкоцитов этого типа увеличивается в 2-4 раза при низких индексах эффективности P/D и скорости пролиферации ниже скорости созревания. При этом накапливаются нейтрофилы, особенно СЯ, падает содержание миелоцитов при пониженном апоптозе. В совокупности
Таблица 3. Характеристика пересечений при чередовании этапов пролиферации и созревания РНг+клеток 3-го типа в культуре
№ п/п (№ Рис.) № больного ХМЛ Схема Точки пересечения кривых скоростей накопления пролифери-рующих [незрелых] (1-й этап) и созревающих клеток [зрелых] (2-й этап) Концентрация клеток в точках пересечения, 106 клеток /мл на этапах
этапов Время пересечения, сут Продолжительность (сут) этапов 1 2 Индексы P/D в точках пересечения № 1 2 3 Незрелых и зрелых 1 2 Сегменто-ядерных (СЯ) 1 2
1 (3) 3.1 КМ 1/2/1 2; 3.5 2 1.5; 2.5 1.1; 1.2; - 0.5; 0.65 0.24; 0.34
2 (3) 3.2 ПК 1/2 2.5; - 2.5 > 4.5 1.06; - - 0.4; - 0.1; -
3 (3) 4 3.3 КМ ПК 1/2 1/2 2.5; 5.5; - 2.5; 5.5; 8.5 5.5 - 2; 1.0; - - 0.49; 0.53; - 0.26; 0.38; -
5 (3) 3.4 КМ 1/2/1 0.2; 6 - 0.2; 5.8 1.15; 12; - 0.37 0.8 0.17; 0.58
6 3.5 КМ 1/2 5; - 5; 3 1.0; - - 1.53 0.37; -
7 3.6 КМ 1/2 4.5; - 4.5; 3.5 1.06; - - 0.53 0.24; -
8 9 3.7 КМ ПК 1/2 1/2/1 2.5; 2.5; 8.5 2.5; 2.5 ; 8.5 8.5 1.5; 1.2; 1.25 - 0.53 0.54; 0.4 0.4; 0.17; 0.15
10 3.8 КМ 1/2 5; 5; > 2 1.5; - - 0.35 - 0.15; -
11 3.10 ПК « 2/1 3; 4 3 1.4; - - 0.33 - 0.3; -
12 Рис. 7 3.11 ПК « 2/1/2/1 5.5; 7.5; 11 2; 5.5 0; 3.5 1.15 1.15 0.80 0.75 0.1 0.6 0.43; 0.06 0.3
13 3.12 КМ « 2/1/2/1/2 4.5; 6 ; 0; 8 1.5; 0; 4.5; 2.5 1 1.05; 1.0 1.0; 1.0 0.62; 0.24; 0.72 0.24 0.13; 0.11; 0.35 0.34
14 3.13 ПК « 2/1 4.0; - - 1; 4 1.7; - - 0.4 0.2
15 3.14 КМ « 2/1 4.0; - - 1; 4 1.0; - - 0.6 0.4
Примечания: КМ — костный мозг, ПК — периферическая кровь; Стрелка ^ указывает, что для чередования 2/1 и 2/1/2/1 данные приведены вначале для 1-го этапа и далее для этапа 2 в соответствии с подзаголовками таблицы.
Среднее значение индекса эффективности P/D при пересечении кривых скоростей этапов пролиферации и созревания на 1-м и 2-м этапах чередования 1.06 ± 0.23 (21.7 %).
это означает, что нейтрофилы, накапливаясь в избытке при блокировании апоптоза, ингибируют пролиферацию клеток, из которых сами образуются, а также тормозят дифференцировку самих нейтрофилов в ряду СЯ, ПЯ и ММ, вероятно, по механизму обратной связи.
Соотношение [СЯ]/[М] (обычно малая величина) при ПД клеток 2-го типа увеличивается, становится более единицы и демонстрирует накопление СЯ нейтрофилов, синхронное уменьшению накопления миелоцитов. Обращает внимание максимальное накопление нейтрофилов на 2-е или 4-е сут (рис. 2 2.1 и 2.4, а, б), которое соответствует минимальному накоплению миелоцитов и низкому индексу P/D. На рис. 2.1—2.5, а, б, виден рост индекса P/D при уменьшении концентрации созревающих без деления нейтрофилов на четвертые сутки ПД.
Количество Ph+клеток 2-го типа составляет треть исследованных образцов, все они выделены от больных ХМЛ в хронической фазе (ХФ). Клиническое наблюдение за больными ХМЛ с 2-м типом ПД показывает повышенную продолжительность их жизни при успешной терапии.
ПД Ph+клеток 3-го типа происходит при неоднократном чередовании эффективной пролиферации (1-й этап) с эффективным созреванием (2-й этап) и изменениями индексов эффективности P/D1 > 1 на P/D2 < 1 (табл. 2 и 3). На 1-х этапах чередования накопление миелоцитов в условиях индукции апоптоза больше накопления созревающих нейтрофилов. На 2-х этапах чередования апоптоз блокируется, нейтрофилы накапливаются в повышенной концен-
трации и ингибируют пролиферацию Ph+ клеток (рис. 3, 4, табл. 2 и 3). При этом, кроме того, наблюдается инверсия порядка накопления нейтрофилов, как и при ПД Ph+ клеток 2-го типа (рис. 2—4, а, б, в), что рассматривается ниже.
Переход к следующему этапу чередования 1 по схемам 1/2/1 и 2/1/2 сопровождается индукцией апоптоза, истощением СЯ и накоплением пролиферации незрелых Ph+клеток. Таким образом, при прохождении контрольного пересечения кривых скоростей пролиферации и созревания происходит смена этапов чередования и изменение эффективной пролиферации на эффективное созревание, или наоборот, характеристики и показатели ранее пройденного такого же этапа чередования восстанавливаются.
Индексы эффективности P/D зависят от этапа чередования ПД), что обсуждалось выше (табл. 2 и 3).
Первый этап чередования ведет к росту индекса эффективности P/D1 > 1, следующее чередование - к низкому индексу P/D2 < 1. В итоге попеременное чередование высокоэффективной пролиферации Ph+клеток с низкоэффективным созреванием нейтрофилов приводит к умеренному росту и падению эффективности ПД Ph+клеток (табл. 3 и рис. 3 и 4). Таким путем поддерживается умеренная эффективность ПД в целом. Этому механизму чередования соответствуют попеременное изменение параметров ПД Ph+клеток 3-го типа (табл. 2 и 3). Совокупность этих результатов означает участие СЯ и других созревающих нейтрофилов в регуляции ПД Ph+клеток 3-го типа с инги-бированием пролиферации Ph+клеток на этапе эффектив-
* 6
0
1 с 4
! 5
2
¡3 0 2 4 6
Время, сутки
Сегментоядерные Миелоциты
_ Бласты ^Н^Промиелоциты
- Метамиелоциты О Палочкоядерные
х 8 , б p/d
MVA
P/^ 3.5
3
2.5 2
1.5
1
0.5
0
0 2 4 6 Время, сутки
- Зрелые -P/D
2 4 6 Время,сутки
A1 -и— S+G2/M
S —S—G2+M
S/(G2+M)
_ а X 1.5
v\ 0 1.2 0.9
V |> 0.6
" i а.2 0.3 ■
■ :J _в.я 0 о Тп а: 0 0
в
2 4 6 8 10 Время, сутки
0 2 4 6 8 10 Время, сутки
Сегментоядерные Метамиелоциты Промиелоциты
12 КМ 7 6
° 5 L 4 !> 3 |2 2
! 1 о 0
а: 0 2 4 6 8 Время, сутки
Миелоциты Сегментоядерны
..О— Палочкоядерные Метамиелоциты
♦ Бласты —«— Промиелоциты
Зрелые _P/D
— Незрелые
P/D 1.4 1. 1
* 10 A4. 4 25 г в
ШИ
i 0 —_.______0 0
2 4 6 8 Время,сутки
0 2 4 6 8 10 Время, сутки
Рис. 4. Кинетические кривые образования и превращения субпопуляций РН|+клеток 3-го типа с чередованием эффективной пролиферации и эффективного созревания дифференцировки по схеме 2/1 и 2/1/2 в составе мононуклеаров, выделенных из клеток КМ и/или ПК больных ХФ ХМЛ. Обозначения а, б и в даны на рис. 1. РН|+клетки 3.10 ПК, 3 . 11 ПК и 3.12 КМ - от больных в ХФ ХМЛ № 3.10, 3.11 и 3.12
ного созревания. При ПД Ph+клеток 2-го типа наблюдается такая же регуляция, как на этапе эффективного созревания Ph+клеток 3-го типа.
Чередование этапов эффективных пролиферации и созревания по схеме 1/2, начинаясь с 1-го этапа (рис. 3.6, табл. 2), по характеристикам согласуется с 1-м типом ПД Ph+клеток. Содержание миелоцитов и пролиферирую-щих клеток в фазах клеточного цикла S+G2/M > 30-45 % на 1-2-е сут (рис. 3) повышается, а содержание нейтрофи-лов падает. На 2-м этапе чередования концентрация ней-трофилов СЯ повышается, индекс P/D2 падает < 1, содержание миелоцитов уменьшается. Доля Ph+клеток в фазах клеточного цикла S+G2/M оказывается < 25 %. К моменту становления следующего 1-го этапа - этапа пролиферации к 7-м сут доля клеток в S+G2/M фазах снова растет (рис. 3, в) и остальные показатели 1-го этапа восстанавливаются. По показателям чередование 1-го и 2-го этапов аналогичны ПД Ph+клеток 1-го и 2-го типов соответственно, но ограничены меньшей продолжительностью. В сумме клетки на 1-м этапе пребывают в течение 4-5 сут - в 3 раза дольше, чем на 2-м этапе (табл. 3).
Второму этапу чередования ПД 3-го типа Ph+клеток -созреванию Ph+клеток соответствуют значения P/D2 < 1, высокая концентрация СЯ и минимальная концентрация миелоцитов (рис. 4, а, б, в, и № 3.10-3.14 в табл. 2). С индукцией апоптоза и уменьшением концентрации СЯ снова
начинается рост P/D1 и накопление миелоцитов. Максимумы P/D1 и накопления миелоцитов совпадают с минимумом концентрации СЯ на пятые сутки. Накопление зрелых нейтрофилов ведет к падению P/D1 и уменьшению концентрации миелоцитов и становлению этапа эффективного созревания. Это согласуется с характеристикой ПД Ph+ клеток 2-го типа и клеток других больных с 3-м типом дифференцировки по схеме 2/1/2 (рис. 4, а, б, в; данные других образцов Ph+ клеток в табл. 2).
Ингибирование апоптоза и пролиферации миелоци-тов клетками СЯ видно на рис. 3 и 4, а, б, в, и др. в табл. 2. При этом чем активнее пролиферация Ph+клеток и активнее апоптоз, тем выше индекс P/D1 (например, рис. 3, а, б, в, и табл. 2).
Особенность ПД Ph+клеток по схеме 2/1/2, которая начинается с этапа 2, состоит в быстром и значительном накоплении СЯ в начале дифференцировки и значительном блокировании апоптоза, подавлении пролиферации Ph+клеток и торможении дифференцировки. Апоптоз и гибель клеток с максимумом на 2-5-е сут составляет ~ 35 % (рис. 4, а-в), что по времени соответствует расходованию и гибели СЯ. Вначале максимум роста клеток на этапе созревания связан с накоплением и расходованием СЯ; второй максимум пролиферации Ph+клеток наблюдается уже при переходе к пролиферации по мере гибели СЯ (рис. 4: 3.10, в).
Доля клеток в фазах клеточного цикла для чередования 2/1 и 2/1/2 также связана с накоплением СЯ, которое соответствует пониженной доле клеток в S+G2/M фазах. Так, на рис. 4, а-в видны максимумы на 1-е сут ~ 10 % (рис. 4: 3.10 КМ), ~ 25 % (3.11 ПК) и менее 5 % (3.12 КМ). На 2-10-е сут доля пула заметно уменьшается. При очередном непродолжительном этапе пролиферации на 10-11-е сут доля пула незначительно увеличивается одновременно с ростом индекса P/D1. Вместе с падением P/D2 это означает ингибирование пролиферации Ph+клеток нейтрофилами, и тем большее, чем чаще наблюдается чередование этапов созревания с большей продолжительностью.
На рис. 4: 3.12, а-в, при чередовании 2/1/2/1 видно значительное ингибирование пролиферации с P/D2 = 0.1-0.9. За 11 сут при чередованиях 2/1/2/1 доля клеток в фазах клеточного цикла S+G2/M оказывается ниже 5 %. При низкой пролиферации на этапе эффективного созревания апоптоз ниже 10 %; его доля на 6-11-е сут растет лишь до 20 %, и то при переходе к 1-му этапу. Суммарное пребывание Ph+клеток в условиях эффективного созревания клеток № 3.12 в три раза дольше, чем на 1-м этапе. Это приводит к самому значительному ингибированию пролиферации и апоптоза из исследованных Ph+клеток 3-го типа. На рис. 4: 3.11, а, б, в максимум апоптоза соответствует минимуму накопления СЯ, максимуму накопления миелоци-тов и росту индекса P/D1.
Третий тип пролиферации и дифференцировки обнаружен у ~ 50 % исследованных Ph+клеток (все от больных в хронической фазе ХМЛ). Из них 2/3 составляют Ph+клетки с чередованием этапов 1/2 и 1/2/1.
Блокирование апоптоза, накопление сегментоядер-ных нейтрофилов (СЯ) и ингибирование пролиферации Ph+клеток 2-го и 3-го типа нейтрофилами на этапе эффективного созревания. Последовательность дифференци-ровки клеток, созревающих без деления, по определению
3.10 ПК
ПК
60
3 40
20
0
Время, сутки
S+Gi/М 32/М
Апоптоз
5/Ю2+М)
б
Незрелые
Зрелые
P/D
S+Gi/М
представлена превращениями в ряду М ^ ММ ^ ПЯ ^ СЯ с выходом СЯ в апоптоз. Накопление созревающих нейтрофилов падает в ряду СЯ > ПЯ > ММ [3]. В культуре при отсутствии возможности транспорта СЯ в другие ткани СЯ должны погибнуть по механизму апоптоза, и значительное накопление СЯ означает блокирование апоптоза.
При созревании Ph+клеток 2-го типа и на 2 этапах чередования ПД Ph+клеток 3-го типа обнаруживаются подавление апоптоза, повышение концентрации созревающих нейтрофилов, ингибирование накопления миелоцитов и понижение доли пролиферирующих клеток в фазах S+G2/M клеточного цикла и/или уменьшение их пребывания в этих фазах. Эти события объясняют ингибирование пролиферации нейтрофилами на стадии созревания в условиях блокирования апоптоза. Отметим, что обычно индукция апоптоза наблюдается при истощении в среде цитокинов [16-18, 25, 26, 29, 43-45]. При ПД Ph+клеток на этапах созревания апоптоз блокируется без введения цитокинов в среду.
При концентрации СЯ ~ 2-3 • 105 клеток/мл и повышенном пуле клеток в S+G2/M фазах наблюдается весьма низкий апоптоз (< 5-10 %); на 5-е сут он едва достигает 10 % (рис. 2.2, а,в). Гибель клеток в других случаях, определяемая окрашиванием трипановым синим, также ингибирова-на. В случаях клеток 2.2-2.4 КМ и 2.6 ПК апоптоз не превышает 10 - 20 % (табл. 1). В случае рис. 2.1, а, в, на 1-е сут пролиферации апоптоз достигает максимума в 40 % и 60 % на 6-е сут при синхронном увеличении накопления миелоцитов. Это означает, что ингибирование накопления миелоцитов зависит не прямо от блокирования апоптоза, а опосредовано нейтрофилами, накапливающимися вследствие ареста апоптоза.
При ПД 2-го типа Ph+клеток СЯ нейтрофилы даже способны накапливаться отдельным пиком с максимумом на 2-6-е сут (при [СЯ] > 0.2-0.3 •106/мл), что видно на рис. 2.1, 2.5 и 2.4, а, б. Этому соответствует низкий апоптоз и минимум накопления миелоцитов (рис. 2.1, б, в). При этом кривая накопления миелоцитов прерывается на время значительного накопления СЯ (максимум на 2-е сут), а индекс P/D, как следствие, понижается. Пролиферация миелоцитов подавлена до тех пор, пока не снизится концентрация СЯ в результате апоптоза. После гибели значительной части СЯ закономерность накопления популяции миелоцитов восстанавливается, а индекс P/D увеличивается (рис. 2.1, б), но остается < 1. На рис. 2.1, а, б, в максимум накопления СЯ на 1-е и 5-е сут также соответствует минимуму накопления миелоцитов, уменьшению P/D и активации гибели клеток в этот период. Аналогичное накопление СЯ (на 2 -5-е сут) подавляет накопление миелоцитов и понижает P/D, что видно на рис. 2.5, а, б. Гибель СЯ на 5-е сут восстанавливает рост концентрации миелоцитов и значение P/D. На рис. 2.2, а, б также видно, что максимум накопления СЯ соответствует минимуму накопления миелоцитов, т.е. максимальному ингибированию накопления миелоцитов. При этом максимумы накопления миелоцитов и активность апоптоза на рис. 2.1, а, б, в синхронны. При ПД Ph+клеток 3-го типа на этапах эффективного созревания видны те же закономерности.
Итак, низкая эффективность ПД Ph+клеток 2-го и 3-го типа на стадиях эффективного созревания в условиях блокирования апоптоза ведет к значительному накопле-
нию нейтрофилов, к уменьшению скорости пролиферации по сравнению со скоростью созревания и к ингибированию пролиферации Ph+клеток. Ингибирование пролиферации Ph+клеток нейтрофилами происходит при чередовании на всех этапах эффективного созревания и означает участие нейтрофилов в регуляции ПД Ph+клеток.
В регуляции ПД Ph+клеток 2-го и 3-го типа можно выделить ряд взаимозависимых процессов, синхронно и асинхронно протекающих. Так, ингибирование апоптоза с накоплением нейтрофилов, созревающих без деления, происходит асинхронно накоплению миелоцитов, индукции апоптоза и росту эффективности. Накопление миелоцитов синхронно индукции апоптоза, активации пролиферации и росту эффективности P/D.
Инверсия порядка (последовательности) накопления созревающих нейтрофилов. Нейтрофилы, созревающие без деления (клетки D), по определению дифференцируются в ряду: М ^ ММ ^ ПЯ ^ СЯ с выходом СЯ в апоптоз [3, 40, 41, 45]. При одинаковых скоростях их дифференцировки можно ожидать тот же порядок накопления этих субпопуляций. В отдельных случаях ПД - при ПД Ph+клеток 1-го типа и на этапах эффективной пролиферации Ph+клеток 3-го типа - такой порядок соблюдается.
При чередовании на этапах созревания Ph+клеток 2-го и 3-го типов значения максимумов накопления нейтрофи-лов на кинетических кривых указывают на изменение порядка их накопления (рис. 2, 3 и 4, а 3.10-3.14; табл. 1—3). Это означает, что скорость накопления СЯ, ПЯ и ММ изменяется неравномерно и порядок их накопления при ПД инвертирует. Накопление миелоцитов в области пиков нейтрофилов при этом понижается. Более того, порядок накопления нейтрофилов из одних и тех же Ph+клеток инвертирует в процессе их созревания, а при переходе к пролиферации восстанавливается.
На рис. 2, а видно, что изменения порядка с увеличением или уменьшением скоростей накопления нейтрофилов происходят часто. Это показывают пересечения кривых накопления отдельных нейтрофилов с изменением их направления. Так, ряд М > ПЯ > ММ ~ СЯ, видимый на 1-е сут, последовательно инвертирует в СЯ > ММ ~ ПЯ > М на 2-е сут, в М > ПЯ ~ СЯ > ММ на 3-е сут и в ряд М > ММ > СЯ > ПЯ на 6-е сут. На этом рисунке одинаковые скорости накопления нейтрофилов позже пересечения кривых на 4.5-е сут приводят почти к обычному порядку накопления нейтрофилов - М >> ММ > СЯ > ПЯ. На рис. 2:2.1, б видны: обычный порядок накопления - М > ММ > ПЯ > СЯ в нулевой момент культивирования, но инверсия этого порядка приводит к М > СЯ > ПЯ ~ ММ на 1-е сут, затем к М >> ММ > СЯ > ПЯ на 4-е сут и позже к накоплению СЯ при убыли М, ММ и ПЯ. На рис. 2:2.4, а почти равные скорости накопления 3-х нейтрофилов на 4-е сут (М > ПЯ ~ СЯ ~ ММ), на 8-е сут приводят к СЯ >> М > ПЯ > ММ. На рис. 2:2.5, а порядок накопления М > СЯ > ММ.> ПЯ на 2-е сут переходит в СЯ > М >> ММ ~ ПЯ на 5-е сут.
Совокупность этих результатов означает, что изменения порядка накопления, т.е скоростей накопления нейтрофи-лов в сумме и относительно друг друга (или относительно миелоцитов), происходят достаточно часто по ходу кинетических кривых накопления нейтрофилов. Восстановление обычного порядка накопления нейтрофилов соответствует
повышению содержания миелоцитов и индекса эффективности P/D и тем способствует переходу к эффективной пролиферации. Изменение скорости и инверсия порядка накопления нейтрофилов, будучи синхронными уменьшению индексов эффективности P/D (рис. 1 и 4, г; 2, 3 и 4, б), указывают на непосредственное участие нейтрофилов в регуляции ПД Ph+клеток 2-го типа с ингибированием их пролиферации.
На этапе созревания Ph+ клеток 3-го типа при чередовании по схемам 1/2, 1/2/1 на рис. 3, а инверсия последовательностей накопления видна при изменении рядов М > MM > СЯ > ПЯ в М > СЯ > ММ > ПЯ и затем снова в М > ММ > СЯ ~ ПЯ. При чередованиях по схеме 2/1 и 2/1/2 инверсия порядка накопления нейтрофилов заметна на рис. 4, а. При этом концентрации нейтрофилов уменьшаются в ряду [СЯ] >> [М] > [ПЯ] > [ММ], как и индекс P/D (рис. 4, б).
Итак, при созревании в максимуме накопления нейтро-филов наблюдается инверсия порядка накопления нейтро-филов, которая способна восстанавливать исходный порядок их накопления при переходе к этапу эффективной пролиферации. Степень инверсии и восстановления порядка накопления нейтрофилов зависит от продолжительности этапов созревания и пролиферации. Инверсия порядка накопления М, ММ, ПЯ и СЯ оказывается еще одним интересным свойством ПД Ph+клеток 2-го и 3-го типов в культуре. Первыми изменяют скорость и степень накопления СЯ нейтрофилы, затем следуют ПЯ и ММ нейтрофилы.
Нейтрофилы при эффективном созревании накапливаются в значительных концентрациях в результате блокирования апоптоза (рис. 2) и участвуют в регулировании ПД Ph+клеток 2-го и 3-го типов не только ингибированием пролиферации Ph+клеток, но и торможением дифферен-цировки самих нейтрофилов. Торможение дифференци-ровки нейтрофилов Ph+клеток 2-го и 3-го типов выявляется при инверсии первоначального порядка накопления нейтрофилов с повышением их концентрации (рис. 2, 3 и 4, а также в табл. 1—3). Инверсия первоначального порядка накопления нейтрофилов ведет к постепенному изменению последовательности накопления нейтрофилов М > ММ > ПЯ > СЯ в последовательность СЯ > ПЯ > ММ > М и к росту их концентрации в том же порядке, вероятно, по механизму обратной связи. Наблюдаемая инверсия порядка накопления и рост концентрации нейтрофилов являются, очевидно, следствием поэтапного торможения дифференцировки последовательно каждого нейтрофила по цепочке обратной связи и ведут последовательно к их накоплению по ходу дифференцировки ПЯ и ММ и, тем самым, к торможению (нарушению регуляции) созревания самих нейтрофилов. Иными словами, накопление СЯ инги-бирует созревание ПЯ, а ПЯ в свою очередь угнетает созревание ММ. В конце концов, тормозится вся цепь созревания нейтрофилов, что повышает их концентрацию. При этом нейтрофилы угнетают пролиферацию Ph+ клеток и подавляют эффективность ПД. В следующий период по достижении «критической» концентрации нейтрофилов индуцируется апоптоз. Это освобождает нейтрофилы от пресса обратной связи, восстанавливает первоначальный порядок накопления нейтрофилов, их концентрация уменьшается и регуляция созревания нейтрофилов восстанавливается,
что сопровождается ростом индекса эффективности P/D и переходом к эффективной пролиферации Ph+клеток.
Роль чередования пролиферации и созревания. Чередование активной пролиферации и созревания с ингиби-рованием пролиферации, происходящих с разной эффективностью и с преимуществом скорости то пролиферации, то созревания нейтрофилов, имеет периодичный или волновой характер. Их параметры проходят через максимумы и минимумы синхронных и асинхронных процессов. Активация пролиферации и накопление миелоцитов синхронны индукции апоптоза, росту эффективности P/D1 > 1, но асинхронны накоплению нейтрофилов, ингибированию ими пролиферации, инверсии порядка созревания нейтро-филов и изменению индекса эффективности P/D2 в пределах < 1 (рис. 2—4, табл. 1—3).
Отметим, что в регуляции ПД Ph+клеток можно выделить ряд взаимозависимых процессов, синхронно и асинхронно протекающих. Так, ингибирование апоптоза с накоплением нейтрофилов, созревающих без деления, происходит асинхронно накоплению миелоцитов и индукции апоптоза. Накопление миелоцитов синхронно индукции апоптоза, активации пролиферации с ростом индекса P/D и восстановлению регуляции созревания и пролиферации.
В точках пересечения чередований параметры ПД выравниваются. При ПД Ph+клеток 1-го и 2-го типов наблюдается «необратимая» регуляция ПД данного цикла диф-ференцировки. Изменения свойств Ph+клеток 3-го типа обратимы: при чередовании этапов ПД свойства, ингиби-руемые на предыдущем этапе чередования, способны восстановиться. Возможно, Ph+клетки 3-го типа по регуляции ПД ближе к норме, чем Ph+клетки 1-го и 2-го типов. Все три типа Ph+клеток, очевидно, зависят от наследуемых особенностей гена bcr/abl у разных больных ХМЛ. Отметим, что регуляция ПД Ph+клеток внутри трех обнаруженных типов Ph+клеток от разных больных ХМЛ различается по количественным характеристикам эффективности P/D, ингибирования апоптоза, накопления СЯ и степени инги-бирования пролиферации Ph+клеток. При ПД Ph+ клеток 1-го и 2-го типов индексы эффективности P/D изменяются в своих границах: P/D1 > 1 или P/D2 < 1 соответственно (рис. 1 и 2, табл. 1). Это указывает на некоторую степень регуляции ПД Ph+клеток в пределах P/D1 > 1 или P/D2 без изменения исходного преимущества скорости либо пролиферации, либо созревания.
Различия в регуляции ПД связаны со свойствами Ph+клеток от разных больных ХМЛ в разных фазах ХМЛ. Очевидно, что эффективность ПД определяют предшественники миелоидных клеток, содержащиеся в Ph+мононуклеарах и наследующие мутации в гене bcr/ abl и тирозинкиназе p210 от разных больных ХМЛ. Мутации, которые способны в линиях Ph+клеток определять туморогенность, жизнеспособность клеток, активность пролиферации и блокирование апоптоза, исследованы в работах [7, 17, 18, 25, 27, 29, 30].
Чередование пролиферации и созревания Ph+клеток ex vivo с повышением и понижением эффективности ПД участвует в регуляции и поддержании оптимального режима ПД Ph+клеток. Чередование попеременно включает при блокировании апоптоза ингибирование пролиферации созревающими нейтрофилами, особенно СЯ, являющимися
потомками тех же пролиферирующих Ph+клеток. Клеточная регуляция СЯ нейтрофилами, очевидно, опосредует генную регуляцию с участием гена bcr/abl. Эти результаты хорошо согласуются с данными о раздельной трансформирующей и антиапоптотической активности различных мутантов тирозинкиназы р210 bcr/abl в клеточных линиях, происходящих благодаря изменению путей сигнальной трансдукции с участием тирозинкиназы р210 [8, 9, 15, 17, 18, 20, 27, 30, 31].
В итоге попеременное чередование эффективной пролиферации и эффективного созревания со сменой повышенных индексов эффективности на весьма низкие приводит к уменьшению общей эффективности ПД Ph+клеток 2-го и 3-го типов и таким путем поддерживает умеренный, возможно оптимальный, режим ПД. На этапах созревания регуляция ПД опосредуется ростом содержания нейтрофи-лов, особенно СЯ, ингибированием пролиферации с уменьшением индексов эффективности и нарушением порядка созревания нейтрофилов Ph+клеток 2-го и 3-го типов.
результаты и обсуждение
Обнаруженная регуляция ПД Ph+клеток ex vivo выявляет клеточные аспекты генной регуляции ПД. Клеточная регуляция, как следует из данной работы, опосредуется чередованием пролиферации Ph+клеток с их созреванием и осуществляется ингибированием пролиферации созревающими без деления нейтрофилами - потомками тех же пролиферирующих Ph+клеток-предшественников в условиях блокирования апоптоза.
Ранее в литературе клеточная регуляция ПД гемопоэ-тических клеток и такой ее механизм не рассматривались [4-7, 9-12, 15, 16, 21-23, 27, 30]. Сведения о клеточной регуляции ПД Ph+клеток нейтрофилами, созревающими без деления, и о регуляции чередованием этапов с высокой и низкой эффективностью ПД до наших исследований отсутствовали. Нет также данных об относительных скоростях пролиферации и созревания, эффективности этих этапов ПД и ее количественном выражении в виде индекса P/D. Соотношение содержания пролиферирую-щих гемопоэтических клеток и созревающих нейтрофи-лов в отдельных пробах ПК ранее обозначалось индексом созревания [2].
Пролиферации миелоидных клеток-предшественников, начального звена регуляции ПД Ph+клеток, изучались многими исследователями [4, 5, 7, 8, 10-12, 15, 16, 20, 23-25, 26]. Она определяется пролиферативным потенциалом и концентрацией CD34 миелоидных клеток-предшественников. Активация пролиферации Ph+клеток зависит от экспрессии онкогена bcr/abl, его мутаций и большей скорости выхода полипотентных стволовых Ph+клеток из G0 в Gj фазу клеточного цикла по сравнению с клетками без Ph хромосомы [20, 23, 24]. Регуляция пролиферации - первого звена механизма ПД Ph+ клеток охарактеризована в некоторой степени и в настоящей работе с помощью кинетического подхода к исследованию ПД. Это видно из параметров ПД Ph+клеток 1-го типа и чередований с эффективной пролиферацией ПД Ph+клеток 3-го типа. В работах [33, 39] показано участие CD34+миелоидных клеток-предшественников и экспрессии онкогена bcr/abl Ph+клеток из ПК ХМЛ № 1.1, исследованного здесь в регуляции ПД Ph+ клеток
1-го типа. При этом максимально высокие уровни экспрессии антигена CD34 и экспрессии онкогена bcr/abl совпадают с высокой эффективностью в начале ПД Ph+клеток.
В работе [28] при исследовании субпопуляций Ph+клеток от больных в ХФ ХМЛ, выделенных цитофлуориметриче-ски на сортере, показана прямая зависимость пролиферации миелоидных Ph+клеток-предшественников в ХФ ХМЛ от экспрессии bcr/abl онкогена. Авторы установили уменьшение пролиферирующего доли Ph+клеток в фазах S+G2/M клеточного цикла для субпопуляций Ph+клеток в 4 раза для миелоцитов и в 7 раз для ПЯ + СЯ нейтрофилов по сравнению c CD34+клетками. Прямая линейная корреляция доли Ph+клеток в фазах S+G2/M клеточного цикла и экспрессии bcr/abl наблюдалась для CD34 клеток, миелобластов и промиелоцитов. Но далее по ходу дифференцировки корреляция инвертировала. Это означало, что активное накопление пула пролиферирующих Ph+клеток в S+G2/M фазах в начале пролиферации прямо пропорционально увеличению экспрессии bcr/abl гена, а при ПД от миелоцитов к ПЯ и СЯ и приобретает обратно пропорциональную зависимость. Кинетика в этой работе не изучалась. Использовались данные для каждого из 9 больных в ХФ ХМЛ. Наши результаты хорошо объясняют инверсию этой корреляции в работе [28] изменением механизма пролиферации Ph+клеток из-за ингибирования пролиферации Ph+клеток нейтрофилами, в избытке накапливающимися из-за блокирования апоптоза.
Совокупность данных работы Primo et al. [28] и результатов настоящей работы свидетельствует о парадоксальном механизме действия bcr/abl на Ph+клетки. Экспрессия онкогена bcr/abl в пролиферирующих миелоидных Ph+клетках-предшественниках активирует пролиферацию, но позже созревающие Ph+нейтрофилы, наследующие тот же онкоген bcr/abl, ингибируют пролиферацию. Иными словами, активирующий пролиферацию эффект экспрессии онкогена bcr/abl в Ph+клетках ранней диф-ференцировки подавляется экспрессией того же онкогена в потомках тех же Ph+клеток более позднего созревания. Это можно объяснить, например, изменением путей сигнальной трансдукции с участием тирозинкиназы p210 и изменением спектра СТАТ белков, продуцируемых в ней-трофилах и по силе эффекта зависящих от концентрации одного из нейтрофилов.
В ряде работ высказана альтернативная гипотеза возникновения и прогрессии ХМЛ, которая в качестве причины ХМЛ рассматривала не активацию пролиферации Ph+клеток из-за неуправляемой экспрессии р210 bcr/abl, а дисбаланс самоподдержания стволовых клеток и более поздней дифференцировки клеток [20-24, 13-14, 26]. Клеток-предшественников при этом образуется меньше, чем в норме (или не больше), а их потомков оказывается в норме меньше, чем при ХМЛ. Нарушение регуляции созревания Ph+клеток в качестве первичного биологического дефекта при ХМЛ рассматривали давно [13, 14, 21, 22, 42]. На примере ПД Ph+клеток 2-го и 3-го типов в нашей работе видно, что такой «дисбаланс» осуществляется нейтрофилами, ингибирующими пролиферацию Ph+клеток на стадии созревания в условиях блокирования апопто-за. Обнаруженные здесь различия в регуляции ПД с ин-гибированием пролиферации нейтрофилами в условиях
блокирования апоптоза и чередования пролиферации с созреванием Ph+клеток от разных больных ХМЛ, наследующих различные мутации в гене bcr/abl, вполне объясняют противоречия, касающиеся «дисбаланса самоподдержания и созревания» Ph+клеток.
Возможно, что ингибирование пролиферации нейтро-филами в процессе чередования пролиферации и созревания при блокировании апоптоза также регулирует ПД гемопоэтических клеток в норме. При ХМЛ этот механизм, вероятно, является попыткой Ph+клеток защититься от активации пролиферации при экспрессии гена bcr/abl, ведущей к прогрессии ХМЛ. Угроза прогрессии ХМЛ видна на примере ПД Ph+клеток 1-го типа при индукции апоптоза и отсутствии избытка нейтрофилов.
выводы
1. Регуляция пролиферации и дифференцировки ex vivo Ph+клеток от разных больных ХМЛ осуществляется при чередовании эффективной пролиферации с эффективным созреванием. На этапе созревания протекает ингибирование пролиферации Ph+клеток накапливающимися нейтрофила-ми при блокировании апоптоза, что прерывает пролиферацию и поддерживает ПД в оптимальном режиме.
2. Чередование этапов состоит в переключении этапа 1 -этапа эффективной пролиферации, протекающего с большей скоростью пролиферации Ph+клеток, чем скорость созревания нейтрофилов, на этап 2 - этап эффективного созревания, при котором блокируется апоптоз и скорость созревания нейтрофилов больше скорости пролиферации Ph+клеток. Чередование протекает по схемам: 1/2 -1/2/1
или 2/1-2/1/2. Этапы чередований проходят контрольные точки пересечения, в которых показатели этапов пролиферации и созревания одинаковы. Индексы эффективности Р^ в контрольных точках пересечения равны 1.06 ± 0.23 и не зависят от времени и порядка чередования, а также от источника Ph+клеток - больных ХМЛ. На этапах чередования эти показатели постоянно изменяются.
3. На этапах пролиферации повышено содержание проли-ферирующих клеток, понижено содержание нейтрофилов, особенно СЯ, и индуцирован апоптоз. На этапах созревания, напротив, апоптоз блокирован, повышено содержание ней-трофилов, особенно СЯ, и понижено содержание незрелых. На этапе эффективного созревания нейтрофилы, накапливаясь в повышенной концентрации, ингибируют пролиферацию незрелых Ph+клеток, претерпевают инверсию порядка созревания нейтрофилов и торможение своего созревания, вероятно, по механизму обратной связи.
4. По различиям в регуляции ПД идентифицированы три типа Ph+клеток у больных ХМЛ, которые отличаются числом и продолжительностью этапов чередования. Это Ph+клетки, ПД которых протекает либо с одним длительным этапом эффективной пролиферации, либо с одним длительным эффективным созреванием, либо с неоднократным чередованием эффективных этапов пролиферации и созревания. Первые соответствуют прогрессирующим фазам ХМЛ, вторые и третьи относятся к хронической фазе ХМЛ с положительной реакцией на химиотерапию ХМЛ. •
Работа поддержана РФФИ, (грант 06-04-08372-офи).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Абдулкадыров К.М., Бессмельцев С.С., Рукавицын О.А. Хронический миелолейкоз: СПб.: Специальная литература, 1998. 463 с.
2. Руководство по гематологии. / Ред. А.И. Воробьев. Т. 1. М.: Ньюдиамед, 2002. 280 с.
3. Патофизиология крови. / Ред. Ф.Д. Шиффман. BINOM Publishers. 2000. 446 c.
4. Deininger M.W.N., Goldman J.M., Melo J.V. // Blood. 2000. V. 96. P. 3343-3356.
5. Deininger M.W.N., Vieira S., Mendiola R., et al. // Cancer research. 2000. V. 60. P. 2049-2055.
6. Медведева Н.В. Хронический миелолейкоз в 50-м ежегодном конгрессе американского гематологического общества. // Клиническая онкогематология. 2009. Т. 2.
№ 1. С. 85-88.
7. Melo J.V. // Blood. 1996. V. 88. P. 2375-2384.
8. Holyoake T.L., Jiang X., Eaves A.C., Eaves C.J. // Leukemia. 2002. V. 16. P. 549-558.
9. Holyoake T.L., Jiang X., Jorgensen H.G. et al. // Blood. 2001. V. 97. P. 720-728.
10. Jamieson C.H.M., Ailles L.E., Dylla S.J. et al. // New England J Medicine. 2004. V. 351. P. 657-667.
11. Jaiswal S., Traver D., Miyamoto T. et al. // Proc.Nat.Acad. 2003. Sci. USA. V. 100. P. 10002-10007.
12. Passegue E., Jamieson C.H.M., Ailles L.E., Weissman I.L. // Proc.Nat.Acad. Sci. 2003. USA. V. 100. P. 11842-11849.
13. Strife A., Lambek C., Wisniewski D. et al. // Blood. 1983. V. 62. P. 389-397.
14. Strife A., Lambek C., Wisniewski., et al. // Cancer Res. 1988. V. 48. P. 1035-1041.
15. Era T., Witte O.N. // Proc. Nat. Acad. 2000. Sci. USA. V. 97. P. 1737-1742.
16. Guzman M.L., Jordan C.T. //Cancer Control. 2004. V. 11, № 2. P. 97-104.
17. Bedi A., Zehnbauer B.A., Barber J.et al. //Blood. 1994. V. 83. P. 2038-2044.
18. Bedi A., Barber J.P., Bedi G.C et al. // Blood. 1995. V. 86. P. 1148-1158.
19. Brandford S., Rudzki Z., Walsh S.et al. // Blood. 2002. V. 99. P. 3472-3475.
20. Buckle A.M., Mottram R., Pierce A.et al. // Mol. Med. 2000.V. 6. P. 892-902.
21. Clarkson B., Strife A., Perez A. et al. // Leukemia & Limphoma. 1993. V. 11. P. 81-100.
22. Clarkson B., Strife A. // Leukemia. 1993. V. 7. P. 1683-1721.
23. Coppo P., Bonnet ML., Dusanter-Fourt I. et al. // Oncogene. 2003. V. 22(26). P. 41024110.
24. Traycoff C.V., Haistead B., Rice S. et al. // Brit. J. Haematology. 1998. V. 102. P. 759-767.
25. Lotem J., Sachs L. // Leukemia. 1996. V. 10. P. 925-9313.
26. Lugo T.G., Pendergast A.M., MullerA.J., Witte O.N. // Science. 1990. V. 247. P. 1079-1082.
27. Cortez D., Kadlec L., Pendergast A.M. // Mol.cell. biology. 1995. № 10. P. 5531-5541.
28. Primo D., Flores J, Quijano S. et al. // Brit.J. Haematology. 2006. V. 135. P. 43-51.
29. Amarante-Mendes G.P., Naekyung Kim C., Liu L. et al. // Blood. 1998. V. 91. P. 1700-1705.
30. Selleri C., Maciejewski J.P., Pane F., et al. // Blood. 1998. V. 92. P. 981-989.
31. Sherbenou D.W., Hantschel O., Turaga L. et al. //Leukemia. 2008. V. 22. P. 1184-1190.
32. Stoklosa T., Poplawski T., Koptyra M., et al. // Cancer Res. 2008. V. 68. P. 2576-2580.
33. Ахлынина Т.В., Герасимова Л.П., Саркисян Г.П. и др. // Цитология. 2007. Т. 49. С. 889-900.
34. Абрамов М.Г. Гематологический атлас. М.: Медицина, 1985. 344 с.
35. Герасимова Л.П., Манакова Т.Е., Ахлынина Т.В. и др. // Росс. Биотерапевт. журнал. 2002. Т. 1. № 4. С. 29-38.
36. Пинегин Б.В.,Ярилин А.А., Симонова А.В. и др, Цитофлуориметрический метод оценки апоптоза активированных лимфоцитов периферической крови человека
с помощью пропидиум иодида. // В кн. : Применение проточной цитофлуориметрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека. М., МЗ РФ, 2001. С. 48-53.
37. Шмаров Д.А., Козинец Г.И. Способы анализа клеточного цикла при помощи проточной цитофлуориметрии. // В кн.: Лабораторно-клиническое значение проточного цитометрического анализа крови. М. : Медицинское информационное агентство, 2004. С. 49-65.
38. Dean P.N.// Cell Tissue Kinet. 1980. V. 13. P. 299-302.
39. Гринева Н.И., Барышников А.Ю., Герасимова Л.П. и др. // Росс. биотерапевт. журнал. 2007. Т. 6. № 2. С. 21-32.
40. Козинец Г.И., Котельников В.М. // Советская медицина. 1983. № 4. С. 3-77.
41. Котельников В.М., Козинец Г.И., Касаткина В.В., Ковалевская Н.П. Кинетика гранулоцитопоэза. // В кн.: Кинетические аспекты гемопоэза. Изд-во Томского гос. ун-та, 1982. С. 149-211.
42. Golde D.W., Cline M.J. // New Engl. J. Med. 1973. V. 288. P. 1083-1086.
43. Владимирская Е.Б. Механизмы апоптоза клеток крови. // Лабораторная медицина. 2001. № 4. С. 47-54.
44. Владимирская Е.Б. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста. // В кн.: Биологические основы противоопухолевой терапии. М.: Агат-Мед, 2001. С. 5-32.
45. Dublez L., Eymin B., Sordet O. et al. // Blood. 1998. V. 91. P. 2415-2422.
46. Goldman J.M., Th'ng K.G., Catovsky D., Galton D.A.D.. // Blood. 1976. V. 47. P. 381-388.
