CC BY
37
УДК: 602.9:611.018:618.58
Малюк М.О., к. вет. н., доцент © E-mail: nikolai_malyuk@mail.ru Нацюналънийутверситет 6iopecypcie i природокористування Украгны, вул. Герою оборони, 15; Кыгв, 03041, Украгна
ПУПОВИННИЙ КАНАТИК - АЛЬТЕРНАТИВНЕ ДЖЕРЕЛО МЕЗЕНХ1МАЛБНИХ СТОВБУРОВИХ КЛ1ТИН У СОБАК
Мулътипотентт cmoe6ypoei клтыны ссавыгв, вгдкрытг росгысъкым вченим А. Я. Фщденштейном, отрымуютъ гз ргзных джерел, зокрема, гз кгсткового мозку, жыровог тканини, Kpoei пуповины. Остантм часом выявлена значна заыгкавлетстъ до отрымання мезенх1малъных стовбуровых ф1бробластопод1бных клтын гз пуповыны новонародженых. Пуповынныы канатык новонародженог тварыны е багатым джерелом клтын з высокою прол1фератывною здаттстю. Проыедура забору бюлог1чного матер1алу не потребуе додаткового хгрурггчного втручання i не несе будъ-якых етычных обмеженъ. Щ клтыны е аутолог1чнымы для новонародженого та ыого Mamepi, i ix, так само, як i cmoe6ypoei гемопоетычш клтыны гз пуповынног кровг, можна крюконсервуваты з метою подалъшого выкорыстання у клтынно-регенератывшы медыцыш пры захворюваннях опорно-рухового апарату тварын. Анал1зрезулътат1в прол1фератывного потенщалу стовбуровых клтын пуповыны собак на 0 - VI пасажах показав, що за допомогою мехашчног дезагрегацп тканын пуповыдного канатыка вдаетъся отрыматы ф1бробластопод1бш клтыны з высокымы адгезывнымы та клоногеннымы властывостямы. Пры цъому, ефект контактного галъмування росту клтынных культур пуповыдного канатыка проявлявся пры наростант клтынного моношару в кулътуралъных чашках nempi до 80 % конфлюентност1.
Ключое1 слова: мезенх1малът cmoe6ypoei клтыны, ф1бробластопод1бш клтыны, пуповынныы канатык, мехатчна дезагрегащя.
УДК: 602.9:611.018:618.58
Малюк Н.А.
Нацыоналъныыуныверсытет быоресурсов ы прыродополъзованыя Украыны
ПУПОВИННЫЙ КАНАТИК - АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ИСТОЧНИК МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК У СОБАК
Мулътыпотентные стволовые клеткы млекопытающых, открытые русскым ученым А.Я. Фрыденштеыном, выделяют ыз разных ысточныков, в частносты, ыз костного мозга, жыровоы тканы, пуповынноы кровы. В последнее время проявляется значытелъная заынтересованностъ к выделеныю мезенхымалъных стволовых фыбробластоподобных клеток ыз пуповыны новорожденных. Пуповынныы канатык новорожденных жывотных является богатым ысточныком клеток ыз высокой пролыфератывноы актывностъю. Процедура выделеныя быологыческого матерыала не нуждается в дополнытелъном хырургыческом вмешательстве ы не несет ныкакых этыческых
© Малюк М.О., 2014
219
ограничений. Эти клетки являются аутологическими для новорожденного и его матери и их, так же как и гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови, можно криоконсервироватъ, с целью дальнейшего использования в клеточно-регенеративной медицине при патологии опорно-двигательного аппарата животных. Анализ результатов пролиферативного потенциала стволовых клеток пуповины собак на 0 -VI пассажах показывает, что с помощью механической дезагрегации тканей пуповинного канатика удается получить фибробластоподобные клетки с высокими адгезивными и клоногенными свойствами. При этом, эффект контактного торможения роста клеточных культур пуповинного канатика проявляется при нарастании клеточного монослоя в культуральных чашках Петри до 80% конфлюентности.
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, фибробластоподобные клетки, пуповинный канатик, механическая дезагрегация.
UDC: 602.9:611.018:618.58
М. О. Malyuk
National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine UMBILICAL CORD - AN ALTERNATIVE SOURCE OF MESENCHYMAL
STEM CELLS IN DOGS
Multipotent stem cells of mammals was discovered by russian scientists A. Fridenshtein. They can be obtained from various sources, including bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood. Recently was indicated considerable interest in obtaining of mesenchymal stem cells from umbilical cord of newborns. Umbilical cord of a newborn animalis a richsource of cells with high proliferative capacity. The procedure of biological material sampling does not require additional surgery intervention and does not have any ethical restrictions. These cells are autologous to the newborn and his mother and, as well as hematopoietic stem cells from cord blood, can be cryopreserved for further usage in cell regenerative medicine for treating animals with musculoskeletal system diseases. Analysis of the proliferative potential of umbilical cord stem cells of dogs at 0 -VI passages showed that mechanical disaggregation of tissues allows to get a fibroblast-like cells with high adhesive and colony forming properties. Thus the effect of contact inhibition of cell growth in cell monolayer was manifested when 80 % of culture petri dishes square was filled.
Key words: mesenchymal stem cells, fibroblast-like cells, umbilical cord, mechanical disaggregation
Мезенх1мальш ф1бробластопод1бш стовбуров1 кл1тини, вщкрит1 росшським вченим А.Я. Фрщенштейном Г21, отримують ¿з р1зних джерел, зокрема, i3 юсткового мозку, жирово! тканини, кров! пуповини Г3, 4, 8, 91. Останшм часом виявлена значна защкавлешсть до отримання стовбурових ф1бробластопод1бних кл1тин i3 пуповини новонароджених Г1, 71. Пуповинний канатик новонароджених легкодоступний, е багатим джерелом високопрол1феративних кл1тин, а процедура вщбору бюлопчного матер1алу не потребуе додаткового xipypri4Horo втручання i не мае будь-яких етичних обмежень. Щ кл1тини е аутолопчними для новонароджено! тварини та И матери iix також, як i стовбуров1 гемопоетичш кл1тини пуповидно! кров1, можна
220
крюконсервувати i збер1гати з метою подальшого застосування. Вщомо, що стовбуров1 ф1бробластопод1бш кл1тини пуповидного канатика здатш диференцшватись в юсткову, хрящову, жирову тканини Г11, що дозволяе ix розглядати як альтернативний матер1ал для вщновлення структури i функцп тканин опорно-рухового апарату тварин. Також встановлено, що МСК отримаш ¿з Вартонового студня диференщюються в нейрони i гл1альш кл1тини Г51. Науково доведено, що СК пуповинного канатика не експресують комплексу ricTOcyMicHOCTi Hi I, Hi II класу, що е важливим обгрунтуванням для подальшого клмчного !х застосування, оскшьки вщсутшсть комплекЫв ricTOcyMicHOCTi забезпечуе повне приживления кл1тинного матер1алу у тварин - рецишенив Г61. 3 огляду на це, ¿снуе висока ймов1ршсть того, що стовбуров1 ф1бробластопод1бш кл1тини пуповидного канатика здатш замшити МСК к1сткового мозку, як1 ниш активно використовуються для вщновлення к1сткових дефект1в, суглоб1в, лжування серцево-судинно! системи, травматичних ушкоджень шюри тощо. Варто зауважити, що у ветеринарнш медицин! Украши так1 дослщження проводяться вперше.
Враховуючи наведеш вище факти, видшення мезенх1мальних стовбурових кл1тин ¿з пуповидного канатика тварин е досить актуальним i своечасним завданням. Це дасть можливкть збер1гати i'x в крюбанках кл1тинних культур, використовувати як аутолопчний матер1ал для кл1тинно! Tepanii'. Таким чином, МСК пуповини можуть стати ефективною альтернативою аналопчним кл1тинам, видшеним i3 юсткового мозку, жирово! тканини i пуповинно! кров1 тварин.
Мета дослщження: Вивчити особливост1 видшення та культивування мезенх1мальних стовбурових кл1тин пуповидного канатику собак, а також змши морфологи отриманих кл1тинних культур залежно вщ довготривалост1 культивування in vitro.
Матер1али i метод и дослщження. Мезенх1мальш кл1тини видшяли i3 матриксу (строми) пуповидного канатику собак. Останнш отримували в процес1 планового кесаревого розтину у собак р1зних порщ (французький бульдог, англшський бульдог, чихуахуа) на 59 - 63 день гестацп. Оперативне втручання проводили у Державнш установ1 «Центр охорони здоров'я тварин в м. КиевЬ> -клшшд ветеринарно! медицини Святошинського району м. Киева. Пуповину промивали фосфатно-буферним розчином (ФБР), вщпрепаровували apTepii' i вени та подр1бнювали пуповинний канатик за допомогою х1рурпчних ножиць на фрагменти розм1ром 2 - 3 мм, теля чого тддавали мехашчнш обробщ на магштнш електромшалщ (М-5, Украша) протягом 10 - 15 хв при юмнатнш температур!. Отриману кл1тинну суспензш фщьтрували через стерильний марлевий фшьтр, центрифугували, осад кл1тин ресуспендували в поживному середовищг Отриману суспензш кл1тинно! маси виавали у культуральш чашки Петр1 (d=60 мм) i культивували до отримання моношару 80 %-oi конфлюентностг Отриману культуру кл1тин пасажували.
Культивування кл1тин проводили за стандартною методикою в культуральних чашках Петр1 та С02-шкубатор1 (t 37°С, 5 % С02). Склад поживного середовища: 80 % - DMEM, 20 % - ембрюнальна сироватка теляти з додаванням 10 мкл/см3 середовища антибютика-антимжотика. Замшу середовища проводили через кожш три доби. При досягненш моношару 80 % -о! конфлюентност1, кл1тини переводили в суспензш, використовуючи 0,5/0,2 % - й розчин трипсину/ЕДТА i розЫвали у сшввщношенш 1 : 3. Готову культуру
221
кл1тин переносили для збер1гання в посудиш Дюара ¿з рщким азотом. Перед крюконсервуванням культуру кл1тин переносили у середовище, що складаеться ¿з фетально! телячо! сироватки та 10 % ДМСО.
Результати дослщжень. Нами апробований метод видшення мезенх1мальних стовбурових кл1тин ¿з пуповидного канатика собак шляхом його мехашчно! обробки. Встановлено, що за допомогою мехашчно! дезагрегаци тканин пуповидного канатика собак на магштнш електромшалщ вдаеться отримати ф1бробластопод1бш кл1тини з високими адгезивними та прол1феративними властивостями.
В отриманш культур! МСК ¿з пуповини собаки спостер1гався високий р1вень морфолопчно! гетерогенное^ цих кл1тин: поряд ¿з ФБТ-под1бними (ф1бробластопод1бними) кл1тинами виявлеш округл! кл1тини, прикршлеш до культурального пластику, яю, очевидно, е ендотел1альними кл1тинами (рис. 16). На I - II пасажах округл! кл1тини виткнялись ФБТ - под1бними кл1тинами. Наш1 дослщження узгоджуються ¿з дослщженнями Буруново! В.В. (2011 р.) [1].
У
X1
<42
гШ
кч
1-Я
и
1 я
Л
ш
л
и
к
Рисунок 1 - Стовбуров1 клггпнп пуповини собаки (0 - й пасаж): а - третш день культивувания; б - одннадцятнй день культивування, х 100.
В перюд адаптаци на нульовому та першому пасажах ФБТ- под1бш кл1тини ¿з пуповини (рис. 1а, 2а) були морфолопчно под1бш I характеризувались розпластаною формою ¿з приблизно однаковими розм1рами в повздовжньому I поперечному напрямках. При цьому, 1х форма значно вщр1знялась вщ веретенопод1бних кл1тин ккткового мозку (рис. 2а, б).
; щ
ш шШ
Рисунок 2 - Стовбуров1 клггини собаки (I - й пасаж): а - СК пуповини; б
СК ккткового мозку, х 100.
222
При пщвищенш конфлюентносп в процеЫ росту кл1тинних культур до 85-100 % моношару в ус1х випадках, незалежно вщ номеру пасажу, спостер1галось пом1тне зниження м1тотично! активное^ кл1тинних культур МСК пуповини (рис 3). Разом з тим, до 80 % - о! конфлюентносп контактне гальмування росту ФТП культур клпин не спостер1галось. Це, зокрема, обгрунтовуе необхщшеть переЫву кл1тинних культур пуповидного канатика не шзшше досягнення ними 80 %-о! конфлюентносп. Ефект контактного гальмування росту клпинних культур пуповидного канатика проявлявся не тшьки при наростанш гомогенного клпинного моношару в культуральних чашках Петр1 на першому I наступних пасажах, але I в окремих колошях росту на 0 пасажг
Рисунок 3 - Моношар кштин собаки (III - й пасаж): а - 80 % конфлюентносп; б - 100 % конфлюентносп, х 100.
Шсля II пасажу культура МСК ¿з пуповини ставала морфолопчно гомогенною I мютила, в бшьшосп, невелик! мпотично активш веретенопод1бш клпини (рис. 3).
Рисунок 4 - Стовбуров1 кштини пуповини собаки: а - 1У-й пасаж; б - VI
пасаж, х100.
3 часом в культур! юлтин вщбувався зворотний процес: теля декшькох (вщ V до VI) пасаж1в клпини поступово втрачали свою мпотичну актившеть, в
223
культур! знову з'являлись розпласташ кл1тини великих po3MipiB (рис. 46) i picT кл1тииио1 популяцп практично зупинявся.
Висновки:
1. Встановлено, що за допомогою мехатчно! дезагрегацп тканин пуповидного канатика собак вдаеться отримати ф1бробластопод1бш кл1тини з високими адгезивними та прол1феративними властивостями.
2. Ефект контактного гальмування росту кл1тинних культур пуповидного канатика проявлявся при наростанш кл1тинного моношару в культуральних чашках Петр1 до 80 % конфлюентностг
Перспективи подальших дослщжень будуть спрямоваш на вивчення ¿мунофенотипового профшю, а також карютипово! стабшьност1 мезенх1мальних стовбурових кл1тин пуповидного канатику собак на р1зних пасажах культивування in vitro.
Л1тература
1. Бурунова В. В. Проблемы стандартизациипри получении клеточных культур мезенхимального происхождения: экспериментальный и теоретический анализ. Автор. дис. канд. биол. наук. / Бурунова В. В. // -Москва, 2011. - 27 с.
2. Лупатов А.Ю. Цитофлюорометрический анализ фенотипов фибробластоподобных клеток из костного мозга и пуповины человека /Лупатов А.Ю., Каралкин П.А., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В. В., Ярыгин К.Н.// Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2006. - № 4. - С. 1-8.
3. Фриденштейн А.Я. О фибробластоподобных клетках в культурах кроветворных тканей морских свинок. / Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., ЛалыкинаК.С. // Цитология. - 1970. - №12. - С. 1147—1155.
4. Broxmeyer H.F.Cord blood stem cell and progenitor cells. / Broxmeyer H.F., Srour E., Orschell C. et al. // Methods Enzymol.- 2006.- Vol. 419.- P. 439473.
5. Minguell J.J. Mesenchymal stem cells. / J.J. Minguell // Exp. Biol. Med. -2001. - Vol. -226. - P. 507-520.
6. Mitchell K.E.Matrix cells from Whar-ton's jelly form neurons and glia / Mitchell K.E., Weiss M.L., Mitchell B.M. et al. // Stem Cells.- 2003.- Vol. 21.- P. 50-60.
7. Sarugaser R.Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. / Sarugaser R., Lickorish D., Baksh D., Hosseini M.M., Davies J.E. // Stem Cells.- 2005.- Vol. 23.- P. 220-229.
8. Wang H.S. Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord. / Wang H.S., Hung S.C., Peng S.T. et al. // Stem Cells. 2004. - Vol. 22 - P. 1330 - 1337.
9. Zuk P.A. Human adipose tissue is a sourse of multipotent stem cells. / Zuk P. A., Zhu M., Ashjian P. et. al. // Mol. Biol. Cell. - 2002. - Vol. 13. - P. 4279 -4295.
10. Zuk P.A. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. / Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., et. al.// Tissue Eng. - 2001. -Vol. 7. P. 211 - 228.
Рецензент - д.вет.н., професор Коцюмбас Г.1.
224
