CC BY
109
Орипнальна стаття
УДК 611-013.7/.8:576.3/.4-013.8
Цимбалюк В.1.1, Деряб'ша О.Г.2, Шувалова Н.С.2, Маслова О.О.2, Похоленко Я.О.3, Топорова О.К.3, Шпильова С.П.3, Кирик В.М.4, П1чкур Л.Д.1, Касяненко Ю.А.1, П1чкур О.Л.1, Кордюм В.А.3
1 Вщдшення вщновлювальноТ нейрохiрургiT, 1нститут нейрохiрургiT iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
2 Вщдт генних технологiй, 1нститут генетичноТ та регенеративноТ медицини НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
3 Вiддiл регуляторних механiзмiв клiтини, 1нститут молекулярноТ бюлогп i генетики НАН УкраТни, КиТв, УкраТна
4 Лабораторiя клiтинних та тканинних культур вщдшу клiтинних та тканинних технологш, 1нститут генетичноТ та регенеративноТ медицини НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
Фенотиnовi змши i пролiферативний потенцiал мезенхiмальних стовбурових клiтин з вартонових дра^в пуповини людини в умовах культивування
Анотац1я
Мета. Розробити протокол отримання мезенхiмальних стовбурових кл^ин (МСК) з вартонових драглiв пуповини людини, дослщити Тх фенотиповi змши i пролiферативний потенцiал в умовах культивування.
Матерiали i методи. МСК пуповини людини культивували протягом 6 пасажiв. Для дослщження морфологiчних характеристик ^тин у культурi застосовували методики забарвлення гематоксилшом та еозином, адаптоваш для використання у культурах ^тин, за Романовським-Гiмзе, толуТдиновим синiм. Для забарвлення ядерноТ ДНК використовували реагентиЧнтеркалятори: Hoechst 33342, DAPI та Ethidium bromid. Експресiю поверхневих маркерiв МСК (CD105, CD90, CD73 , CD34) дослщжували за допомогою FACS-аналiзу.
Результати. В культурi МСК зберiгають морфолопчну iдентичнiсть протягом 2 пасажiв. В подальшому спостерiгають тенденцiю до зменшення iнтенсивностi експресiT маркерiв МСК, ознаки деградаци культури, появу на тзшх пасажах спонтанного адипогенного та хондрогенного диференшювання.
Висновки. При культивуваннi МСК пуповини людини протягом 2 пасажiв збер^ають морфологiчнi характеристики i пролiферативний потенцiал, в подальшому вони втрачають мезенхiмальний мультипотентний фенотип.
Ключовi слова: мезенх/мальн/ стовбуровi клтини; пуповина людини; культивування; прол'феративний потенцал.
Укр. нейрохiрург. журн. — 2015. — №2. — С.17-24.
Над/йшла до редакцИ 07.12.14. Прийнята до публ/кацП20.04.15.
Адреса для листування: П/чкур ОлександрЛеонщович, В/ддлення вщновлювально/ нейрох/рургИ, 1нститутнейрох/рурп/ iM. акад. А.П. Ромоданова, вул. Платона Майбороди, 32, Ки/в, Укра/на, 04050, e-mail: o.pichkur@gmail.com
Вступ. Регенеративна медицина з кожним роком вимагае все бтьшоТ гаранти безпечносп та ефектив-носп кл^инноТ терапи, тому обрання оптимальних джерел отримання кл^ин е одним з ТТ ключових етапiв. Сьогодш в клiтиннiй терапiТ використовують рiзноманiтнi клiтини (як дорослого органiзму, так i ембрiональнi), особливе мiсце серед яких поадають мезенхiмальнi стовбуровi (мультипотентш стро-мальнi) клiтини (МСК). Це зумовлене, насамперед, Тх iмунокоригувальними властивостями, здатшстю диференцiюватись в рiзнi типи ^тин, можливiстю отримання великоТ кшькосп клiтин за короткий час, вщносною простотою культивування. Опублiкованi данi про виявлення та устшне видiлення МСК практично з уах тканин оргашзму [1, 2], проте, основну увагу придтяють таким джерелам ^тин, як юстко-вий мозок, жирова тканина, провiзорнi ембрюналь-нi тканини (плацента, пуповина тощо). Описуючи
культури МСК, найчастше мають на увазi клiтини, отриманi з кiсткового мозку або жировоТ тканини [3, 4]. Ц клiтини належать до категорп дорослих стовбурових клiтин, вщповщно, iснують деякi обмеження щодо застосування алогенного матерiалу в медицинi, пов'язаш з особливостями реакцiТ на них iмунноТ сис-теми реципiента. Незважаючи на спiльну назву, МСК з рiзних джерел значно рiзняться за доступшстю та безпечнiстю.
Вартоновi драт пуповини (пупкового канатика), на вщмшу вiд кiсткового мозку та жировоТ тканини, м^тять клiтини, що збереглися з раншх етапiв емб-рюгенезу.
Пуповина як похiдне жовткового мшка та алантоТсу, мiстить примiтивну форму позазародковоТ мезенхiми — мукозну сполучну тканину (вартоновi драглi) [7], яка за складом ^тин та будовою посiдае промiжне мiсце мiж ембрюнальною мезенхiмою та
Стаття м/стить рисунки, якi в'щображаються в друкован/й версИ у в/дт/нках срого, в електронн/й — у кольорi.
© Цимбалюк В.1., Дерябна О.Г, Шувалова Н.С., Маслова О.О., Похоленко Я.О., Топорова О.К., Шпильова С.П., Кирик В.М., Пчкур Л.Д., Касяненко Ю.А., Пчкур О. Л., Кордюм ВА., 2015
сполучною тканиною дорослих [7]. В и складi пе-реважають фiбробластоподiбнi клiтини, що активно синтезують глiкозамiноглiкани, та, на думку деяких авторiв, зберiгають не мультипотентний (на вщмшу вiд кiсткового мозку та жировоТ тканини, якi е МСК дорослого органiзму), а нав^ь плюрипотентний стовбуровий потенцiал [8]. Встановлено можлив^ть експресiТ ними ембрiональних маркерiв Oct4 i Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-1, SSEA-4) [9]. Вони мають дещо вщмш-ний вiд зрiлого iмунофенотип, що вiдкривае додатковi можливостi для алотрансплантаци [10, 11].
Отримання ^тин з пуповини не спричиняе мо-рально-етичний конфлiкт, процедура iзолювання МСК з пупкового канатика досить проста. В дослщах на тваринах тсля iмуносупресiТ доведено, що внутрш-ньовенне або тдшюрне введення таких кл^ин не спричиняе Тх вiдторгнення або критичний негатив-ний вплив. На звичайних тваринах без iмуносупресiТ показано, що принаймш одноразова трансплантацiя ксеногенних кл^ин вартонових драглiв пуповини можлива без Тх негайного вщторгнення. Даш л^е-ратури свiдчать про бшьш вираженi iмуносупресивнi властивостi МСК пуповини у порiвняннi з такими аналопчних клiтин з iнших джерел, що, поряд з шшими перевагами, свщчить про перспективнiсть використання Тх в регенеративнш медицинi.
Сьогоднi актуальними напрямками дослщжень бiологiТ МСК з вартонових дратв пуповини е розроб-ка й вдосконалення оптимальних методiв видтення, iдентифiкацiТ та отримання достатньоТ для ключного застосування кiлькостi клiтин з збереженням Тх на-тивних характеристик. Не вивчеш питання якiсного складу i змiни фенотипових характеристик ^тин в умовах культивування.
Мета дослщження: розробити протокол отримання МСК з вартонових дратв пуповини людини, дослщити Тх фенотиповi змiни i пролiферативний потенцiал в умовах культивування.
Матерiали i методи дослiдження. Видлення МСК. Пуповини, отримаш вiд здорових породть пiд час фiзiологiчних полопв, наданi мунiципальним пологовим будинком №5 м. Киева. Жшки пiдписали шформацшний лист про згоду надати матерiал для наукових дослiджень. В робот використанi 30 пуповин. Матерiал обробляли не пiзнiше нiж через 5 год тсля полопв. В лаборатор^ пуповини доставляли в поживному середовищi ДМЕМ з 10-кратною концент-рашею антибiотикiв. Пупковий канатик максимально вщмивали вiд кровi, на 20-30 хв вмщували в нове поживне середовище 1гла або ДМЕМ з антибютиками — пенiцилiн i стрептомщин вiдповiдно по 1000 од/мл та 1000 мкг/мл, антимкотичним засобом (амфотерщин Б, 50 од/мл). Всi мантуляци проводили у стерильних умовах. Перед початком оброблення пупкового канатика вилучали судини — одну вену i двi артери та вщокремлювали вартоновi драглi, якi подрiбнювали ножицями до найменш можливого розмiру 0,1-0,5 см i вмiщували в культуральний флакон об'емом 25 або 75 см3 з теплим (температура 37°С) ростовим пожив-ним середовищем альфа-МЕМ (BioWest, Iспанiя), 10% фетальноТ сироватки ВРХ (HyClone, США), 2 ммоль L-глутамшу (Sigma, США) та 10 нмоль FGF («1нтер-фармБютек», УкраТна). Культивування здшс-нювали у СО2-iнкубаторi (37°С, 5% СО2). Через 7-14
дiб з експлантiв отримували клiтини та пером клони, якi вирощували до досягнення 70% моношару куль-турального флакона. Поживне середовище змшю-вали через кожш 3 доби. Щоденно спостерiгали за станом клiтин в швертованому свiтловому мiкроскопi LEICA DMIL при збiльшеннi х80. Bei морфометричш аналiзи проводили за допомогою програми Image J.
^тини в клонах — це матерiал нульового пасажу поза оргашзмом. Для пасування ^тин за стандартною методикою використовували розчини 0,02% версену та 0,25% трипсину у стввщношенш 1:1. ^тини виавали з розрахунку 104 ^тин на 1 см2, доводячи ^тини до 2-го пасажу в культур^ пiсля чого Тх характеризували за морфолопею, поверхневими маркерами та використовували для подальшого вве-дення дослiдним тваринам (дослщжували вплив МСК на експериментальних моделях; результати будуть представлен в подальших публiкацiях).
Методи морфологчнихдослджень. Для вивчення морфологи кл^ини в культурi забарвлювали гематок-силiном та еозином, за методикою, адаптованою для використання у культурах ^тин. Кл^ини у чашках Петрi забарвлювали при юмнатнш температурi (22°С). Перед забарвленням з чашок видаляли культуральне середовище, ^тини фiксували у 4% розчин формалЬ ну протягом 10 хв, об'емом 2 мл формалшу на чашку. Для вщмивання вiд фксатора використовували забу-ферений iзотонiчний розчин натр^ хлориду (по 4 мл на чашку). Для забарвлення використовували водний розчин гематоксилшу Бьомера та водний розчин еози-ну. Гематоксилш об'емом 2 мл додавали у чашку та витримували 10 хв. Вщмивання проводили проточною водопровщною водою, додаючи 4 мл води на чашку, повторювали 4 рази. Додавали у кожну чашку по 1,5 мл еозину. Витримували 3 хв та одноразово вщмивали водою, додаючи по 2 мл у чашку. Важливою умовою вдалоТ вiзуалiзацiТ е постшне тдтримання вологосп у чашках, адже кл^ини, що пересихають, дефор-муються й набувають нетипових ознак. Цитоплазма ^тин забарвлена у рожево-бузковий колiр, ядро — у синьо-фюлетовий.
МСК забарвлювали також з використанням деяких класичних барвниюв, що застосовують у гiстохiмiч-нш практицi та шд час доeлiдження клiтин кров^ за Романовським-Гiмзе [12]; ядерним барвником то-луТдиновим синiм (водний розчин 1:1000), який, ^м того, дозволяе виявляти метахромазю забарвлюючи основну речовину хряща; основним барвником аль-шановим синiм, що при рН вщ 3 до 5 забарвлював не тшьки нуклеТновi кислоти, а й ки^ мукополюахари-ди [13]. Тонку будову к^тин оцiнювали з використанням флуоресцентно!' та конфокальноТ мкроскопп'.
Якiснiсть забарвлення перевiряли пiд швертова-ним свiтловим мiкроскопом LEICA DMIL при збтьшенш х100. ФотографiТ отримували за допомогою апарата Canon Power Shot А640.
Ядерн'1 барвники. Для забарвлення ядерноТ ДНК використовували реагенти-штеркалятори: Hoechst 33342, DAPI та Ethidium bromid. Hoechst 33342 та його аналоги найбшьш поширенi у сучасних цитолопчних дослiдженнях для вiзуалiзацiТ ДНК ядер у рiзних об'ектiв [14, 15]. Специфiчнiсть взаемодiТ Ноеchst 33342 з ДНК пояснюеться його розташуванням у малш борозш ДНК [16], що зумовлюе появу блакитноТ
люмшесценци в ядрах. Для забарвлення препара^в Hoechst 33342 використовували в концентраци 5 мкг/мл, шкубували протягом 3-5 хв при температурi 37°С. На конфокальному м^роскот максимум збуд-ження свiтiння Hoechst 33342 вщзначений при 405 нм, максимум емiсií — при 420-480 нм. Таку саму ви-соку специфiчнiсть щодо забарвлення ДНК проявляв шшший флуорохром — DAPI — дiамiдiнофенолiдол [17]. Забарвлення проводили протягом 3-5 хв при температурi 37°С. Максимум збудження DAPI вiдповiдав 350 нм, максимум емiсií — 470 нм. Етидiум бромiд (Ethidium bromid) — зручний в роботi флуорохром, який використовували в концентраци 2 мкг/мл при забарвленш протягом 2-5 хв. Збудження флуоресценци етидiумбромiду при 488 нм, випромшювання — при 560 нм.
Визначення експресП поверхневих маркер/в. FACS-аналiз експреси маркерiв МСК (CD105, CD90, CD73 , CD34- "BD", США) як м^мальних критерив для визначення МСК за рекоменда^ями Мiжнародного товариства клiтинноí терапií [18], здшснювали на сортерi "BD FACSAria" з застосуванням програмного забезпечення "BD FACSDiva" у вiддiлi клiтинних та тканинних технологш 1нституту генетичноí та регенеративно!' медицини НАМН Украши. Аналiз проводили за стандартними протоколами. Кл^ини вмiщували в епендорф у виглядi суспензií (1-5х10б кл в 1 мл) у крижаному PBS з додаванням 1% натр^ азиду. Додавали 0,1-10 мкг/мл первинних мiчених антитт, розчинених у 3% BSA/PBS та шкубували протягом 30 хв при юмнатнш температурк По^м кл^ини тричi вiдмивали, центрифугували при 400 g протягом 5 хв та ресуспендували у 500 мкл крижаного PBS. Матерiал аналiзували у проточному цитометрк Як мiтку вико-
ристовували FITC. Проведенi стандартнi контрольнi вимiрювання.
Статистична обробка результатiв проведена у "MSExcel" та програмi для статистичноТ обробки "х7 2009".
Результати та |'х обговорення. Морфологчна характеристика культур МСК з пуповини людини. От-римаш культури МСК цiлком вщповщали типовим для цього виду кл^ин морфологiчним характеристикам. Оскiльки вартоновi драт пуповини людини мiстять не ттьки МСК, а й мiофiбробласти, фiбробласти, макрофаги та iншi резиденты ^тини, пiд час отримання матерiалу нульового пасажу виявляли рiзнi за морфо-логieю клiтини — вщ округлих до фiбробластоподiб-них. Нами визначеш: субпопуляцiя маленьких клiтин ^аметром 10-15 мкм) з гомогенною цитоплазмою, низьким (приблизно 0,25)ядерно-цитоплазматичним стввщношенням (ЯЦС), невеликим, розташованим у центрi ядром з 4-8 ядерцями, ^тини без вiдросткiв та субпопуляцiя бтьш великих фiбробластоподiб-них клiтин ^аметром 40-70 мкм) з гетерогенною цитоплазмою, ще бiльш низьким ЯЦС, центрально розташованим ядром з 2-4 ядерцями. Ц кл^ини мали невелику кшьюсть довгих вiдросткiв. Виявляли i ^тини з одним тонким вiдростком та ексцентрично розташованим ядром. ^м того, спостер^али клiтини бiльш округлоТ форми ^аметром 15-30 мкм) з змще-ним ядром з 2-5 ядерцями та щтьною гранулярнiстю у навколоядернш дiлянцi, а також великою кшьюстю коротеньких вiдросткiв, що здатнi формувати щтьний моношар (рис. 1). Морфолопчш характеристики цих клiтин вiдповiдають даним л^ератури i е класичними для МСК людини. Яюсть культури ^тин визначаеться кiлькiстю наявних у нш веретеноподiбних клiтин.
Рис. 1. М^рофото. Популяцií МСК з вартонових дратв пуповини людини при 0 пасажi в культурк Забарвлення гематоксилiном та еозином. Зб.х100.
И i
f» \
W\ 4
С ' ,
Рис. 2. Мкрофото. Культура МСК. 2 пасаж. А — жива незабарвлена культура, зб.х100; Б — конфокальна м^роскотя, забарвлення етидiум бромiд + FITC, зб.х400.
За подальшого пасажування МСК в культурi спостерiгали переважання веретеноподiбних ^тин, культура ставала однорiдною, на рiвнi 2-го пасажу практично всi клтини в культурi мали характерну веретеноподiбну форму (рис. 2). Розмiр ^тин збть-шувався, ïx довжина становила 80-150 мкм.
Таким чином, пщ час пасажування вщбувався про-цес переходу вщ гетерогенноï культури 0 пасажу до найбтьш гомогенноï культури 2-го пасажу. Починаючи з 3-го пасажу, морфолопя клiтин була бтьш рiзно-манiтною: з'являлися клiтини атипово!' форми, старiючi клiтини, хоча цей процес бтьш виражений тсля 5-6 пасажiв. У бiльш пiзнix пасажах виявляли спонтанне адипогенне та хондрогенне диференшювання у мо-ношарi (рис. 3, 4). Це явище в лiтературi описують рiдко, проте, шд час роботи з великою вибiркою культур ми його спостерiгали. Його вважають ознакою деградацiï культури i втрати ^тинами ме-зенxiмального мультипотентного фенотипу. ^м того, поява включень жиру може бути зумовлена жировою дистрофieю, що виникае в шзж строки культивування, хоча 3-й пасаж не можна вважити «тзшм». Проте, за будь-яких умов, таю ^тини не можна використову-вати у подальших клiнiчниx дослiдженняx.
Спонтанне формування адипоци^в i появу лтщ-них крапель в цитоплазмi МСК у деяких спостережен-нях вiдзначали вже на 3-му пасажк Дрiбнi лтщовм^ш вакуолi розташованi по всiй цитоплазмi клiтини, бiльш щiльно — у перинуклеарнш зонi. На 4-5-му пасажi кiлькiсть адипогенних клiтин значно збтьшувалася. Збiльшувалися вакуолi та гранули лт^в, навколо ядер МСК формувалися щтьш скупчення лiпiдiв, що виявляли при забарвленш нiльським червоним. При цьому МСК були вщ великих округлих або трикутних клiтин до дуже видовжених, неправильноï форми, з кшькома витягнутими тяжами цитоплазми, або типо-вих веретеноподiбниx.
За змiнами морфологи культур шд час пасажування виявляли кардинальш фенотиповi змiни клiтин у куль-турi, що унеможливлювало 1х подальше використання у клiнiчнiй практик. Оптимальними для трансплантацiï е ^тини з 1-го та 2-го пасажу, проте, кшьюсть клiтин на 1-му пасажi недостатня для застосування у вели-коï групи тварин або тд час клiнiчного застосування у людини. В той же час, культивування МСК до 2-го пасажу дае можлив^ть отримати достатню кшьюсть кл^ин, якi зберiгають морфологiчнi характеристики, притаманш МСК, i е досить однорщш.
Рис. 3. Мкрофото. Накопичення лiпiдiв у МСК. 5-й пасаж. Забарвлення ядер — DAPI, лт^в — нiльським червоним. Зб.х400.
Рис. 4. Мiкрофото. Спонтанний хондрогенез на 4-му пасажк Забарвлення альшановим синiм. Зб.х100.
Характеристика особливостей пролiферацil МСК в культурк За даними л^ератури, з 1 см пупо-вини можна отримати вщ 103 до 105 клiтин. У наших спостереженнях доведено, що цей показник вар^е залежно вiд конкретного зразка. Сумарна кшьюсть клiтин, яку можна отримати з певного зразка пупо-вини довжиною 15-25 см за тривалого пасажування протягом 2 пасажiв становить 1010.
Пiд час процедури отримання ^тин з зразка пу-повини довжиною до 15 см (найбтьш частий варiант) виявляли до 10б округлих клiтин, що мiстять ядро. Проте, кшьюсть власне МСК можна оцшити лише пiсля першого переаву культури.
Час подвоення популяцií (ЧПП) рiзнився на етапах пасажування, проте, встановлеш деякi вiдмiнностi i в межах одного пасажу культур ^тин, отриманих з рiзних зразкiв пуповини. ЧПП також залежав вщ стадп росту культури: у log- чи lag-фазк Вважають, що за постшного пересiвання культури у log-фазi популяшя подвоюеться швидше. Найбiльше часу для подвоення потрiбно у перiод тсля видiлення клiтин з пуповини
— на 0 пасаж^ у середньому (82,86±4,78) год. Важ-ливим моментом на цьому етат е обрання часу першого переаву. Потрiбно накопичити певну кiлькiсть клiтин (понад 105), проте, не пропустити log-фази та не перетримати клiтини до lag-фази, коли ЧПП не буде зменшуватись, i клiтини старiшатимуть та гину-тимуть. На 1-2-му пасажах ЧПП становить (53,28±8,9) та (45,57±4,04) год. Найменшим е ЧПП на 3-му пасажi
— (28,43±5,44) год. Пюля 3-го пасажу ЧПП збшьшуеть-ся i становить у середньому (35,14±3,44) год — на 4-му пасажi та (34±7) год — на 5-му пасажi (рис. 5). Таким чином, МСК на рiвнi 5-го пасажу отримували приблизно через 1 мю культивування.
За даними лтератури, ЧПП ^тин матриксу пуповини вар^е вiд 11 до 87 год. Це протирiччя може бути пов'язане з гетерогеннютю пуповини як джерела мезен-хiмальних ^тин. Пiд час дослiдження великое' кшькосп зразкiв найбiльш яскраво проявляються вщмшносп росту культур клiтин, отриманих вщ рiзних донорiв.
Характеристика МСК за поверхневими маркерами. За рекомендашями Мiжнародного товариства з клiтинноí терапп [18], клiтини можуть бути вщнесеш до МСК, якщо вони експресують принаймнi 3 поверхневих маркери — CD73, CD90, CD105 та негативш за CD34 i CD45. Нами показано, що як свiжо видтений клi-тинний матерiал, так i матерiал 1-го та 2-го пасажiв в культурi вiдповiдае цим критерiям (рис. 6).
Рис. 5. Змши ЧПП тд час пасажування (МСК вщ 0 до 5-го пасажу).
у*тг нйс-сма
нос-сом
■дддтг-еот
■. irmu-^r гон
и* li' Ц W W V U
090 'НА TJWPttCP'Cyb-^b
А
Tube. СМ9
P»UllL«n %1с/Щ
■ Bftftl и.зг? w 1000
|н» IC.i+l 01 9 01 0
■ iff to J?2 35 It
1016) Hi »0
■ cost (.»> 11 i tor
№
z, • £
«г:
О :
V)
"а:
"Ч, 1 ■""■■ « та РЁ-А
Б
Tube: СОП
POOH Vital
■ All Bfenis 53.931 100 0
□ tills i.MI 6) Ы
gPE s.sse 01 i ее
□ COT J J.SS7 MS
VartonMSC-CDl05
7-AAD PerCP-CyS-5-A
vjraaHSC-CDIOS
Ш. - - -.^v
'ji * ■
vMrh:
■ пЯш£
■ iras -
Vartona]SC-CDI05
V&non blSC'CQIUS
Т. АЛО PeiCP.CiSM
и*
CDtQSFiTC'A
В
Tutlt CO} OS
РориЦИЮП #E*en1s %Pflrenr »Total
Пл. Events • 35« 100 0
■ e 1; ь 10,000 Tit r;a
■ dean 1.0 71 107 78
95; es 9
■ CD ism Sit SSI
Рис. 6. Експресiя позитивних CD90 (А), CD73 (Б), CD105 (В) маркерiв клiтинами з свiжо отриманого матерiалу вартонових дратв пуповини людини за даними FACS-аналiзу.
В подальшому тд час пасажування експреая поверхневих мaркерiв мезенxiмальними кл^инами вартонових дрaглiв пуповини мае тенденшю змiнювaтись, на 6-му пaсaжi вона була найменшою з середшх значень (рис. 7). Разом з тим, найбтьш високою експреаею позитивних мaркерiв характери-зувалися клiтини 2-го пасажу, що тдтверджувало ïx максимальну гомогеншсть, виявлену за морфолоп-ею. Спостер^али тенденцiю до зменшення штенсивносп експресiï мaркерiв CD105 та CD90 вщ 1-го до 6-го пасажу, проте, ц змiни недостовiрнi (р>0,05) через знaчнi вiдмiнностi eKcnpeciï в межах
Рис.
МСК
7. Експреая позитивних поверхневих мaркерiв у пасажах (показано середш значення).
Рис. 8. Низький рiвень експреси негативного маркера CD34 ^тинами з свiжо отриманого мaтерiaлу вартонових дра^в пуповини людини за даними FACS-aнaлiзу.
одного пасажу. Популяцiя к^тин 0 пасажу нaйбiльш гетерогенна за ступенем екс-пресiï CD90 (min 8%, max 97,8%), 3-го пасажу — за ступенем експреси CD105 (min 5,5%, max 75%). Це може свщчити про шдивщуальш вщмшносп зразюв пуповини. Найбтьш сгабтьною е експреая маркеру CD73 (min 70,1% — на 6-му пасаж^ max — 99,3% — на 1-му пасаж^, вона найменше змшюеться тд час па-сажування, а в межах одного пасажу розкид значень найменший. Культури, що характеризувались бтьшою гомогеннiстю та вираженою фiброблaстоподiбною формою клiтин, мали й вищу експресiю позитивних поверхневих мaркерiв.
Основним негативним маркером МСК вважають CD34 (позитивний маркер гемопоетичних стовбурових ^тин). За результатами наших дослщжень, вмiст CD34+ клiтин в уах пасажах наближений до 0 (рис. 8). Лише на 0 пaсaжi спостер^али до 0,6% позитивних за цим маркером ^тин, що може бути пов'язане з наявшстю невеликоï кiлькостi гемопоетичних клЬ тин у матрикс пуповини людини. Проте, ц клiтини погано адгезувалися до пластика i при пасажуванш елiмiнувaлися.
Таким чином, створений протокол видтення й культивування до 2-го пасажу в культурi МСК вартонових дра^в пуповини людини, що забезпечуе отримання знaчноï кiлькостi характерних кл^ин, придатних для подальшого використання у тварин, та в перспектив^ i в кл^чнш прaктицi. Цей протокол мае переваги у порiвняннi з такими, що ^нували, оскiльки, по-перше, охоплюе вс етапи процесiнгу одержання мaтерiaлу з пуповини; по-друге, обГрун-товуе можливiсть подальшого використання ^тин не бiльше 2-го пасажу в культур^ по-трете, адаптований до отримання необxiдноï кiлькостi клiтин (40 млн.) в обмежеш (1 мiс) строки.
Висновки. 1. Створений протокол отримання МСК з вартонових дратв пуповини людини з дослщ-женням ïx фенотипових та пролiферaтивниx власти-востей в умовах культивування.
2. В динам^ культивування МСК, отриманих з вартонових дра^в пуповини людини, вщзначено тен-деншю до зменшення iнтенсивностi експресiï мaркерiв СD105 та CD90, хоча ц змiни недостовiрнi. Нaйбiльш стaбiльною е експреая маркера СD73.
3. Властивост МСК (типова морфологiя, експресiя поверхневих мaркерiв) зберiгaються протягом 2 паса-жiв культивування. В бiльш шзж строки з'являються ознаки дегрaдaцiï культури та втрати кл^инами ме-зенxiмaльного мультипотентного фенотипу, виникае спонтанне адипогенне та хондрогенне диференцю вання у моношарк
4. Протягом культивування до 2-го пасажу можна отримати бтя 40х106 клiтин з дтянки пуповини довжиною 15 см. З л^увальною метою необxiдно використовувати МСК пуповини людини не вище 2-го пасажу в культурк
Список л^ератури
1. Augello A. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niche / A. Augello, T.B. Kurth, C. De Bari // Eur. Cell Mater. - 2010. - V.20.
- P.121-133.
2. Bieback K. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy / K.Bieback, I.Brinkmann // World J. Stem Cells. - 2010. - V.2, N4. - P.81-92.
3. Targeting miRNAs involved in cancer stem cell and EMT regulation: An emerging concept in overcoming drug resistance / Z. Wang, Y. Li, A. Ahmad, A. Azmi, D. Kong, S. Banerjee, F. Sarkar // Drug Resistance Updates. - 2010.
- V.13, N4-5. - P.109-118.
4. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease / J-P. Thiery, H. Acloque, R.Y..J. Huang, M.A. Nieto // Cell. - 2009. - V.139, N5. - P.871-890.
5. Пролиферативный и дифференцировочный потенциал мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани в условиях культивирования / В.М.С еменова, Н.И. Лися-ный, Л.П. Стайно, Л.Н. Бельськая, Д.М. Егорова // Укр. нейрохiрург. журн. - 2014. - №3. - С.24-29.
6. Kalluri J. EMT: When epithelial cells decide to become mesenchymal-like cells / J. Kalluri // J. Clin. Invest. - 2009.
- V.119, N6. - P.1417-1419.
7. Selezneva T. Gistologiya: polnyi kurs za tri dnya / T. Selezneva, A. Mishyn, V. Barsukow. - M.: Eksmo, 2007. - 354 p.
8. Kalluri R. Fibroblasts in cancer / R. Kalluri, M. Zeisberg // Nat. Rev. Cancer. - 2006. - V.6, N5. - P.392-401.
9. Multipotent menstrual blood stromal stem cells: isolation, characterization, and differentiation / A. Patel, E. Park, M. Kuzman, F. Benetti, F. Silva, J. Alickson // Cell Transplant.
- 2008. - V.17, N3. - P.303-311.
10. Huang G.T.-J. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role
in regenerative medicine / G.T.-J. Huang, S. Gronthos, S. Shi // J.D.R. - 2009. - V.88, N9. - P.792-806.
11. Taghizadeh R.R. Wharton's jelly stem cells: future clinical applications / R.R. Taghizadeh, K.J. Cetrulo, C.L. Cetrulo // Placenta. - 2011. - V.32, suppl.4. - P.311-315.
12. Changes in morphofunctional characteristics of umbilical cord matrix mesenchimal cell during passaging / O.O. Maslova, N.S. Shuvalova, O.M. Sukhorada, O.G. Deryabina, M.V. Makarenko // Probl. Cryobiol. - 2012. - V.22, N2.
- P.153-156.
13. Козловская Л.В. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования / Л.В. Козловская, А.Ю. Николаев. - М.: Медицина, 1984. - 288 с.
14. In vitro differentiation potential of mesenchymal stem cells / J.M. Gimble, F. Guilak, M.E. Nuttall, S. Sathishkumar // Transfus. Med. Hemother. - 2008. - V.35. - P.228-238.
15. Jennings B.R. Interaction of chromosomal stains with DNA / B.R. Jennings, P.J. Ridler // Biophys. Struct. Mech. - 1983.
- V.10. - P.71-79.
16. DNA minor grove binders as potential antitumor and antimicrobial agents / P.G. Baralddi, A. Bovero, F. Fruttarolo, D. Preti, M.A. Tbrizi, M.G. Pavani, R. Romagnoli // Med. Res. Rev. - 2004. - V.24. - P.475-528.
17. Gray J.W. Techniques in cell cycle analysis / J.W. Gray., Z. Darzynkiewicz. - N.J.: Humana Press, Clifton, 1986.
- 407 p.
18. Kubista M. Characterization of interaction between DNA and 4', 6-Dimidino-2-phenylindole by optical spectroscopy / M. Kubista, B. Akerman, B. Norden // Biochemistry. - 1987.
- V.26. - P.4545-4553.
19. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal "stem" cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not / S. Wexler, C. Donaldson, P. Denning-Kendall, C. Rice, B. Bradley, J. Hows // Br. J. Haematol. - 2003. - V.121, N2. - P.368-374.
Цымбалюк В.И.1, Дерябина Е.Г.2, Шувалова Н.С.2, Маслова О.А.2, Похоленко Я.А.3, Топорова Е.К.3, Шпилевая С.П.3, Кирик В.М.4, Пичкур Л.Д.1, Касьяненко Ю.А.1, Пичкур А.Л.1, Кордюм В.А.3
1 Отделение восстановительной нейрохирургии, Институт нейрохирургии им.акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
2 Отдел генных технологий, Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины, Киев, Украина
3 Отдел регуляторных механизмов клетки, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, Украина
4 Лаборатория клеточных и тканевых культур отдела клеточных и тканевых технологий, Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины, Киев, Украина
Фенотипические изменения и пролиферативный потенциал мезенхимальных стволових клеток из вартонова студня пуповины человека в условиях культивирования
Аннотация
Цель. Разработать протокол получения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из вартонова студня пуповины человека, исследовать их фенотипические изменения и пролиферативный потенциал в условиях культивирования.
Материалы и методы. МСК пуповины человека культивировали на протяжении 6 пассажей. Для исследования морфологических характеристик клеток в культуре использовали методики окраски гематоксилином и эозином, адаптированные для использования в культурах клеток, по Романовскому-Гимзе, толуидиновым синим. Для окраски ядерной ДНК использовали реагенты-интеркаляторы: Hoechst 33342, DAPI и Ethidiumbromid. Експрессию поверхностных маркеров МСК (CD105, CD90, CD73, CD34) изучали с помощью FACS-анализа.
Результаты. В культуре МСК сохраняют свою морфологическую идентичность на протяжении 2 пассажей. В дальнейшем наблюдают тенденцию к уменьшению интенсивности экспрессии маркеров МСК, признаки деградации культуры, появление на поздних пассажах спонтанной адипогенной и хондрогенной дифференциации.
Выводы. При культивировании МСК пуповины человека на протяжении 2 пассажей сохраняют морфологические характеристики и пролиферативный потенциал, в последующем они утрачивают мезенхимальный мультипотентный фенотип.
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки; пуповина человека; культивирование; пролиферативный потенциал.
Укр. нейрохирург. журн. — 2015. — №2. — С.17-24.
Поступила в редакцию 07.12.14. Принята к публикации 20.04.15.
Адрес для переписки: Пичкур Александр Леонидович, Отделение восстановительной нейрохирургии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова, ул. Платона Майбороды, 32, Киев, Украина, 04050, e-mail: o.pichkur@gmail.com
Tsymbaliuk V.I.1, Deriabina E.G.2, Shuvalova N.S.2, Maslova O.O.2, Pokholenko Ya.O.3, Toporova O.K.3, Shpileva S.P.3, Kirik V.M.4, Pichkur L.D.1, Kasianenko Yu.A.1, Pichkur O.L.1, Kordium V.A.3
1 Restorative Neurosurgery Department, Institute of Neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov, NAMS of Ukraine, Kiev, Ukraine
2 Department of Gene Technology, Institute of Genetic and Regenerative Medicine, NAMS of Ukraine, Kiev, Ukraine
3 Department of Regulatory Mechanisms of Cells, Institute of Molecular Biology and Genetics, NAS of Ukraine, Kiev, Ukraine
4 Laboratory of Cell and Tissue Cultures of Cell and Tissue Technology Department, Institute of Genetic and Regenerative Medicine, NAMS of Ukraine, Kiev, Ukraine
Phenotypical changes and proliferative potential of mesenchymal stem cells from humans Wharton's jelly in the cultivation conditions
Abstract
Purpose. To develop a protocol for mesenchymal stem cells (MSCs) obtaining from wharton's jelly of human
umbilical cord, to study their phenotypic changes and proliferative potential in culture.
Materials and methods. MSCs from human umbilical cord were cultured for 6 passages. To study
morphological features of the cells in a culture we used adapted staining with eosin and gematoksilin,
Romanovsky-Giemsa, and toluidine blue. For nuclear DNA coloring we used intercalators: Hoechst 33342,
and DARI Ethidiumbromid. MSCs surface markers (CD105, CD90, CD73, CD34) expression was studied by
FACS-analysis.
Results. In the culture MSCs retain their morphological identity for 2 passages. Further a tendency to MSCs markers expression decreasing was observed, signs of culture degradation, spontaneous chondrogenic and adipogenic differentiation in late passages.
Conclusion. Cultured MSCs of human umbilical cord for 2 passages retain their morphological characteristics and proliferative potential, further they lose multipotent mesenchymal phenotype.
Key words: mesenchymal stem cells; human umbilical cord; cultivation; proliferative potential. Ukr Neurosurg J. 2015;2:17-24.
Received, December 07, 2014. Accepted, April 20, 2015.
Address for correspondence: Olexandr L. Pichkur, Restorative Neurosurgery Department, Institute of Neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov, 32 Platona Mayborody St, Kiev, Ukraine, 04050, e-mail: o.pichkur@gmail.com
