CC BY
35
Орипнальна стаття = Original article = Оригинальная статья
DOI: https://doi.org/10.25305/unj.112102
Виживання трансплантованих мезенхiмальних стовбурових клiтин вартонових дра^в пуповини людини в центральнiй нервовiй системi щурiв при експериментальному алерпчному енцефаломieлiтi niсля Ух субокципiтального введення
П/чкур Л.Д. 1, Ковальчук М.В.23, Дерябiна О.Г.3, Вербовська С.А.1, Аюнола С.Т.1, Шувалова Н.С.3, Кордюм В.А.
2,3
1 Вщдш вщновлювалыноТ та функцюналыноТ нейрохiрургN, 1нститут нейрохiрургN iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
2 Вiддiл регуляторних механiзмiв клiтини, 1нститут молекулярноТ бюлогп i генетики НАН УкраТни, КиТв, УкраТна
3 Вщдш генних технологш, 1нститут генетичноТ та регенеративно!' медицини НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
Над1йшла до редакцИ 11.06.17. Прийнята до публ1кацп 01.08.17.
Адреса для листування:
П/чкур Леонд Дмитрович, Вддлення вдновлювально/ нейрох1рург1'1, 1нститут нейрох1рургп ¡м. акад. А.П. Ромоданова, вул. Платона Майбороди, 32, Ки/в, Укра/на, 04050, e-mail: L.Pichkur@neuro. kiev.ua
Мезентмалы-н стовбуровi ^тини (МСК) вартонових дра^в пуповини людини (ВДл) маюты значну перевагу порiвняно з кл^инами з шших джерел, осктыки Тх терапевтичний потенщал при захворюваннях централыноТ нервовоТ системи (ЦНС) вищий за такий МСК, отриманих з шших джерел. У зв'язку з цим, Тх застосування може бути альтернативою при лкуванш демieлiнiзуючого ураження ЦНС, в тому чи^ розаяного склерозу (РС).
Мета. Проаналiзувати строки виживання МСК ВДл у рiзних вщдшах ЦНС щурiв при експериментальному алергiчному енцефаломieлiтi (ЕАЕ) тсля Тх субокципiталыного введення в л^ворш шляхи.
Матер1али i методи. Моделювання ЕАЕ. Видтення та кулытивування МСК ВДл in vitro. 1мунне фенотипування з використанням проточноТ цитометри. Субокципiталыне введення МСК у спинномозкову рщину (СМР) щурiв при ЕАЕ. Виживання трансплантованих МСК ВДл у ЦНС щурiв дослщжували за даними ланцюговоТ реакцiТ з полiмеразою (ЛРП) в зразках тканин на 2, 3, 4-ту i 5-ту добу з використанням праймерiв, що амплiфiкуюты специфiчнi послiдовностi ДНК алыфа-сателiтноТ дтянки 17-Т хромосоми людини. Результати. За даними ЛРП алыфа-сател^ш послiдовностi ДНК людини виявили у зразках тканини ЦНС експерименталыних тварин до 5-Т доби тсля субокцитталыного введення МСК ВДл на тку захворювання. ДНК людини виявляли у СМР i рiзних сегментах спинного мозку. Висновки. Субокцитталыно введет МСК ВДл виживаюты i м^руюты по СМР з великоТ потиличноТ цистерни у рiзнi вiддiли ЦНС. МСК ВДл можна також розглядати як ^тини-вектори для доставки терапевтичних молекул при л^увант запалыних захворюваны ЦНС.
Ключовi слова: експериментальний алергчний енцефалом/ел/т; мезенх/мальн/ стовбуровi кл/тини пуповини людини; дем'/ел'ш'зуюче ураження; ланцюгова реакц/я з пол'меразою.
УкраУнський нейрохiрургiчний журнал. 2017;(3):30-5.
The survival of transplanted mesenchymal stem cells from humans Wharton's jelly of the umbilical cord in the central nervous system of rats with experimental allergic encephalomyelitis after their suboccipital injection
Leonid D. Pichkur1, Mariia V. Kovalchuk2'3, Olena G. Deriabina 3, Svitlana A. Verbovska 1, Samuel T. Akinola 1, Nadiia S. Shuvalova 3, Vitalii A. Kordium 2'3
1 Department of Regenerative and Functional Neurosurgery, Romodanov Neurosurgery Institute, Kyiv, Ukraine
2 Department of Regulatory Mechanisms of Cells, Institute of Molecular Biology and Genetics, Kyiv, Ukraine
3 Department of Gene Technology, Institute of Genetic and Regenerative Medicine, Kyiv, Ukraine
Received, June 11, 2017. Accepted, August 01, 2017.
Address for correspondence/
Leonid D. Pichkur, Restorative Neurosurgery Department, Romodanov Neurosurgery Institute, 32 Platona Maiborody St., Kyiv, Ukraine, 04050, e-mail/ L.Pichkur@ neuro.kiev.ua
Human Wharton's Jelly of mesenchymal stem cells (hWJ-MSCs) have a considerable advantage in comparison with the cells from other sources; their therapeutic potential in treating the central nervous system (CNS) diseases is higher than that of other MSCs. That's why hWJ-MSCs can be a new alternative treatment of CNS demyelinization damages including multiple sclerosis (MS).
Purpose. To study the persistence and distribution of hWJ-MSCs in different CNS segments following suboccipital transplantation into cerebrospinal fluid (CSF) of rats with experimental allergic encephalomyelitis (EAE). Methods. Isolation and cultivation of hWJ-MSCs in vitro. Immunological phenotyping by flow cytometry. EAE induction. Suboccipital injection of MSCs into EAE rats cerebrospinal fluid. Persistence of hWJ-MSCs in the CNS of EAE rats was assayed by PCR in tissue samples at days 2, 3, 4 and 5 using primers for amplifying nucleic alpha satellite sequences of human 17th chromosome.
Results. PCR-assays for alpha-satellite sequences revealed human DNA to be detected in the treated rats within 5 days after suboccipital injection at the peak of disease. The human DNA was traced in CSF and various segments of the spinal cord.
© ГНчкур Л.Д., Ковалычук М.В., Дерябша О.Г., Вербовсыка С.А., Аюнола С.Т., Шувалова Н.С., Кордюм В.А., 2017
Conclusions. The data obtained suggest that suboccipitally delivered hWJ-MSCs, survive and can migrate through the CSF from the injection site (cisterna magna) to various segments of CNS.
Keywords: experimental allergic encephalomyelitis, mesenchymal stem cells from humans Wharton's jelly of umbilical cord, demyelinization damages, PCR-analysis.
Ukrainian Neurosurgical Journal. 2017;(3):30-5.
Выживание трансплантированных мезенхимальных стволовых клеток вартонового студня пуповины человека в центральной нервной системе крыс при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите после их субокципитального введения
Пичкур Л.Д.1, Ковальчук М.В.2 3, Дерябiна Е.Г.3, Вербовская С.А.1, Акинола С.Т.1, Шувалова Н.С.3, Кордюм В.А.2 3
1 Отдел восстановительной и функциональной нейрохирургии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
2 Отдел регуляторных механизмов клетки, Институт молекулярной биологии и генетики, НАН Украины, Киев, Украина
3 Отдел генных технологий, Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины, Киев, Украина
Поступила в редакцию 11.06.17. Принята к публикации 01.08.17.
Адрес для переписки:
Пичкур Леонид Дмитриевич, Отделение восстановительной нейрохирургии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова, ул. Платона Майбороды, 32, Киев, Украина, 04050, e-mail: L.Pichkur@neuro. kiev.ua
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) вартонового студня пуповины человека (ВСч) имеют значительное преимущество по сравнению с клетками из других источников; их терапевтический потенциал при заболеваниях центральной нервной системы (ЦНС) выше такового МСК, полученных из других источников. В связи с этим, их применение может быть альтернативой при лечении демиелинизирующих заболеваний ЦНС, в том числе рассеянного склероза (РС).
Цель исследования. Проанализировать сроки выживания МСК ВСч в разных отделах ЦНС крыс при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите (ЭАЭ) после их субокципитального введения в ликворные пути.
Материалы и методы. Моделирование ЭАЭ. Выделение и культивирование МСК ВСч in vitro. Иммунное фенотипирование с применением проточной цитометрии. Субокципитальное введение МСК ВСч в спинномозговую жидкость (СМЖ) крыс при ЭАЭ. Выживание трансплантированных МСК ВСч в ЦНС крыс исследовали по данным цепной реакции с полимеразой (ЦРП) в образцах тканей на 2, 3, 4-е и 5-е сутки.
Результаты. По данным ЦРП альфа-сателлитные последовательности ДНК человека обнаруживали до 5-х суток после субокципитального введения на пике заболевания. ДНК человека выявляли в СМЖ и разных сегментах спинного мозга.
Выводы. Введенные субокципитально МСК ВСч выживают и мигрируют по СМЖ из большой затылочной цистерны в разные отделы ЦНС. МСК ВСч можно также рассматривать в качестве клеток-векторов для доставки терапевтических молекул при лечении воспалительных заболеваний ЦНС.
Ключевые слова: экспериментальный аллергический энцефаломиелит; мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека; демиелинизирующее поражение; цепная реакция с полимеразой.
Украинский нейрохирургический журнал. 2017;(3):30-5.
Вступ. Розаяний склероз (РС) - це складне хрошчне iмуно-опосередковане i нейродегенеративне захворювання, спричинене генетичною схильшстю та еколопчними факторами ризику [1, 2]. Вш характеризуемся шфтьтрашею iмунних кл^ин з кровi в ЦНС, пошкодженням мiелiну i аксошв. В останн роки розроб-леш методи лкування РС, спрямоваш на пригшчення iмунноí системи для контролю запальних процеав з метою припинення прогресування захворювання. Методи лкування, що застосовують у тепершнш час, ефективш лише частково [3-5]. Для посилення нейро-або мiелогенезу ушкоджених тканин ЦНС i вщновлення невролопчних функцш актуальним е пошук нових пiдходiв i методiв лкування. Одним з таких напрямюв може бути застосування ^тинно' терапи [3, 6].
За даними численних дослщжень, МСК рiзного походження здатш полтшувати переб^ алерпчного
енцефаломieлiту, що е експериментальною моделлю РС [5, 7-9]. На моделях невролопчних розладiв, у тому чи^ ЕАЕ, було доведено, що трансплантоваш МСК виявляють iмуномодулюючi, протизапальш, прорегенеративш, нейропротекторш та анпогенш властивост [7, 10, 11], сприяють пригшченню демiелiнiзацN, попереджають загибель нейрошв. ^м того, на моделi ЕАЕ у мишей при трансплантаци МСК (на раншх стадiях) вщзначений захист вщ прогресування ЕАЕ, що пов'язане з дозою трансплантованих ^тин, а на тку ЕАЕ - уповтьнення прогресування, зменшення тяжкосп захворювання [7].
МСК здатш м^рувати в зони ушкоджених дтянок ЦНС, де вони тдтримують локальний нейрогенез, мiелогенез завдяки нейротрофiчним ефектам, стимуляцп резидентних стовбурових кл^ин ЦНС, шдукци iмуномодуляцN in situ, або, ймовiрно, нав^ь
трансдиференщацп [5]. Трансплантоваш МСК можуть бути джерелом нейротрофiчних сполук, що поширюються через СМР до рiзних вiддiлiв спинного мозку [12]. Також встановлено, що трансплантоваш у головний мозок МСК людини динамiчно розподтяються i локалiзуються переважно у певних анатомiчних дтянках [13]. Очевидно, цей процес опосередкований молекулами адгези i пере-бувае пiд контролем рецепторiв, що експресуються трансплантованими МСК [14].
МСК з ВДл можуть бути ефективними в л^уван-ш захворювань ЦНС. 1муномодулюючий ефект МСК ВДл оцiнений in vitro i на моделях на тваринах [15]. Вважають, що ЦНС е забар'ерним iмуно-привiлейова-ним органом завдяки Tí структурним особливостям. Тим не менше, за результатами сучасних дослщжень, доведений контроль iмунноT системи над ЦНС через модифЬ коваш схеми iмунного нагляду, що потребуе перегляду та переосмислення концепцп iмунноT привiлейованостi ЦНС [16]. РС е прикладом такого iмунного «нагляду» за ЦНС. Можливост виживання й м^рацм МСК ВДл в зони ураження ЦНС при патолопчних станах недо-статньо дослiдженi, в той час, як ц чинники можуть справляти ютотний вплив на ефектившсть клiтинноT терапи. В цьому контексп ми дослiджували виживання МСК ВДл i Тх поширення по лкворних шляхах пiсля трансплантацiT на тку кл^чних симптомiв у тварин при ЕАЕ без вщповщно'Т iмуносупресiT.
Матерiали i методи. Лабораторн'1 тварини. Як експериментальних тварин використовували бтих нелшшних щурiв-самиць розведення вiварiю 1нституту нейрохiрургií', масою тiла 200—220 г. Тварин утримували в стандартних умовах з вшьним доступом до води та Txi. Всi процедури проведенi з дотриманням вимог Закону Украши №3447-IV «Про захист тварин вiд жорстокого поводження» вiд 21.20.2006 [17] та £вропейськоT конвенцiT про захист хребетних тварин, яких використовують для дослщницьких або iнших наукових цiлей вщ 18.03.86 [18].
Видлення i культивування кл'пин. МСК видЬ ленi з пуповини людини [19]. ^тини другого пасажу (що використовували для ш'екцп) вщкртляли вiд поверхнi культурального посуду i ресуспендували у фосфатно-буферному розчиш (ФБР) в концентраци 10х10б кл^ин в 1 см3. Зразок кл^ин для введення перевiряли на адекватшсть експресiT поверхневих маркерiв (CD73, CD90, CD105, CD34) [20] за допомо-гою FACS Aria cell sorter (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA) та аналiзували з використанням програмного забезпечення BD FACSDiva (v 6.1.2).
Моделювання ЕАЕ та введення МСК ВДл. Для моделювання ЕАЕ щурiв iмунiзували 0,4 мл суспензи, що мiстила гомогенат спинного мозку (ГСМ) щурiв в iзотонiчному розчинi натрiю хлориду, емульгований у стввщношенш 1:2, з повним ад'ювантом Фрейнда (Sigma-Aldrich). Iн'екцiю здiйснювали тдшюрно в подушечки заднiх лап [21]. Тяжюсть перебiгу EAE оцiнювали за бальною шкалою [22].
МСК ВДл вводили тваринам на тку захворювання, на 17-ту добу тсля моделювання ЕАЕ субокцитталь-но у велику потиличну цистерну в кшькост 1x106 в 100 мкл ФБР. Контрольною групою були тварини з модельованим ЕАЕ, яким МСК не вводили. Матерiал для дослщження (поперекове потовщення, стовбур
мозку в дтянц велико! потиличноТ цистерни, СМР, пiвкулi великого мозку) забирали на 2, 3, 4-ту i 5-ту добу тсля трансплантаци МСК.
Вид'менняДНК. Геномну ДНК екстрагували з клЬ тин СМР за методом висолювання [23], а також з тка-нини головного i спинного мозку[24]. ДНК, отриману з тканин щура контрольно! групи, використовували як негативний контроль, ДНК-МСК ВДл - як позитивний контроль. Концентращю ДНК i чистоту визначали за показником оптичноТ щтьност з використанням спектрофотометра Thermo Scientific NanoDrop 2000 UV Vis. (США).
Ланцюгова реакщя з пол'меразою. Для щен-тифкаци кл^ин людини використовували ЛРП з спе-цифiчними до альфа-сателiтних послiдовностей ДНК людини праймерами. Проводили стандартизовану ЛРП [25]. Вс aнaлiзи виконанi у двох повторах. В кожнш реaкцiТ використовували однакову кшьюсть геномноТ ДНК-мaтрицi. Продукти реакци вiзуaлiзувaли шляхом електрофорезу в 1,2% агарозному гелк Використaнi ЛРП-праймери з послщовшстю в aльфa-сaтелiтнiй дтянц 17-Т хромосоми людини:
5_-TGCGCGTGAAGGTTTGCCAGTGT- 3 i
5_-GCCCCCAGTCGTTCAGGTAATCATAGTCC-3 [25].
Чутливiсть ЛРП становила приблизно 1 ^тина людини на 105 клiтин щура, що встановлене в ЛРП з використанням матриць, отриманих з логaрифмiчних розведень МСК людини в спленоцитах щурiв.
Результати та Тх обговорення. Вщповщно до FACS aнaлiзу (Fluorescence-activated cell sorting), понад 90% МСК ВДл другого пасажу, тдготовлених для трансплантаци, були позитивними за CD73, CD90 i CD105 маркерам i негативними за CD 34 (менше 2%). Життездатшсть кл^ин, визначена шляхом забарвлення трипановим сишм, перевищувала 95%.
Анaлiз альфа-сател^них послiдовностей ДНК людини свiдчив, що ДНК людини виявляли протягом 5 дiб тсля ш'екцп без вщповщноТ iмуносупресiТ у тканинах експериментальних щурiв при ЕАЕ (див. таблицю).
Вщповщно до aнaтомiчноТ локaлiзaцiТ, трансплантоваш МСК ВДл можуть мiгрувaти через СМР. Типовi приклади молекулярноТ детекци МСК ВДл у рiзних сегментах спинного мозку, СМР i головному
Виявлення трансплантованих МСК людини шляхом аналiзу альфа-сателтих послiдовностей методом ЛРП
Дослщжуваний матерiал Кшьмсть тварин з позитивними результатами у строки спостереження, AÍ6
2 (n=3) 3 (n = 2) 4 (n=2) 5 (n=2)
Пiвкулi великого мозку 1 0 0 0
Стовбур мозку в дiлянцi ш'екцп 3 2 2 2
СМР 3 2 1 1
Спинний мозок грудного вщдту 3 2 2 2
Спинний мозок поперекового потовщення 1 0 0 0
мозку представлен на рис. 1-6. Ва зразки тканини стовбуру мозку в дшянц великоТ потиличноТ цистер-ни (м^це введення клiтин) були позитивними щодо ДНК людини. Iмовiрно, бiлышiсты МСК ВДл спочатку локалiзувалисы в цыому репош, Тх виявляли там про-тягом 5 дiб (рис.1).
ДНК людини виявлена також у бшышост зразюв СМР з великоТ потиличноТ цистерни (рис.2).
Кл^ини, введенi у СМР при невролопчних де-мieлiнiзуючих захворюваннях, мiгруюты по ЦНС, в
тому чи^ до зон ураження. МСК ВДл м^рують, про-никають i зберiгаються у грудному вщдЫ спинного мозку (рис. 3).
Проте, альфа-сател^ш послiдовностi не виявленi у твкулях великого мозку та поперековому потовщенш спинного мозку, за винятком окремих спостережень (рис. 4-6). Можливо, бшьшмсть ксеногенних ^тин загинули внаслщок гiпоксiT або мiгрували в зони бтьш вираженого ураження ЦНС. Можливо, ктьюсть клiтин недостатня для позитивного сигналу в ЛРП.
Рис.1. Резулытати ЛРП зразюв алыфа-сател^них послiдовностей ДНК людини у стовбурi головного мозку щурiв в дiлянцi великоТ потиличноТ цистерни (мюце введення МСК ВДл) в рiзнi строки спостереження. 1, 2 - 2 доби; 3, 4 - 3 доби; 5 - маркер молекулярноТ маси 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 6, 7 - 4 доби; 8, 9 - 5 дiб; 10 - ДНК МСК людини (позитивний контролы).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Рис. 2. Резулытати ЛРП зразюв алыфа-сателтих послщовностей ДНК людини у СМР щурiв тсля трансплантацп МСК ВДл в рiзнi строки спостереження. 1 - 2 доби; 2, 3 - 3 доби; 4, 5 - 4 доби; 6 - маркер молекулярноТ маси, 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 7,8 - 5 дiб; 9 - ДНК МСК людини (позитивний контролы).
1 2 3 4 5 67 8 9 10
Рис. 3. Резулытати ЛРП зразюв алыфа-сател^них послщовностей ДНК людини у грудному вщдЫ спинного мозку щурiв тсля трансплантацп МСК ВДл в рiзнi строки спостереження. 1, 2 - 2 доби; 3, 4 - 3 доби; 5 - маркер молекулярноТ маси, 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 6, 7 - 4 доби; 8, 9 - 5 дiб; 10 - ДНК МСК людини.
Рис. 4. Результати ЛРП зразюв альфа-сател^них послщовностей ДНК людини у твкулях великого мозку щурiв тсля трансплантаци МСК ВДл в pi3Hi строки спостереження. 1 - ДНК лейкоци^в щурiв (негативний контроль); 2, 3 - 2 доби; 3, 4, 5 - 3 доби; 6 - маркер молекулярноТ маси, 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 7, 8 - 4 доби; 9 - ДНК МСК людини (позитивний контроль); 10, 11 - 5 дiб.
Рис. 5. Результати ЛРП зразюв альфа-сател^них послщовностей ДНК людини у поперековому потовщенш спинного мозку щурiв тсля трансплантаци МСК ВДл в рiзнi строки спостереження. 1 - ДНК лейкоци^в щурiв (негативний контроль); 2, 3 - 2 доби; 4, 5 - 3 доби; 6 - маркер молекулярноТ маси, 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 7, 8 - 4 доби; 9 - ДНК МСК людини (позитивний контроль); 10, 11 - 5 дiб.
Рис. 6. Резулытати ЛРП зразюв алыфа-сател^них послщовностей ДНК людини у рiзних зразках тканин нервовоТ системи та СМР у щура на 2-гу добу тсля трансплантаци МСК. 1 - поперековий вщдш; 2 - стовбур головного мозку; 3 - ДНК МСК людини (позитивний контролы); 4 - СМР; 5 - пiвкулi великого мозку; 6 - маркер молекулярноТ маси, 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
Отже, МСК ВДл, введет щурам при ЕАЕ на тку захворювання, локалiзувались в специфiчних репо-нах ЦНС тварин. Протягом 5 дiб кл^ини м^рували по СМР, переважно в грудний вщдт спинного мозку.
На вщмшу вщ отриманих нами результа^в, на мо-делi експериментального остеоартриту тсля ш'екци МСК ВДл в колшний суглоб щурiв кл^ини виживали протягом 1 доби [26].
Оскшьки при РС вщбуваеться часткова спонтанна i непередбачувана ремieлiнiзацiя, строки введення МСК дуже важлив^ проте, Тх важко визначити. У клЫчнш практик кл^инну тератю застосовують, як правило, ттьки за наявносп гострих проявiв РС. У зв'язку з цим, незважаючи на те, що в моделях на
тваринах доведена ефектившсть профтактичного лiкування ЕАЕ з використанням МСК, важливо вво-дити МСК до або тд час тку захворювання, що попе-реджуе прогресування симптомiв i сприяе процесам ремieлiнiзацiï. Тому ми вивчали виживання i розподт субокципiтально введених МСК ВДл у щурiв при ЕАЕ за вщстроченого введення клiтин на тку клЫчних проявiв захворювання.
Цей розподт кл^ин по ЦНС i 'х виживання свщ-чать, що МСК ВДл мають суттевий терапевтичний потеншал при запальних нейродегенеративних за-хворюваннях, коли 'х використовують для внесення терапевтичних аген^в (факторiв росту, цитоюшв тощо) в ЦНС. МСК ВДл слщ розглядати i як кл^ини-
вектори для доставки терапевтичних молекул при лкуванш запальних захворювань ЦНС.
Висновки. Отримаш даш свщчать, що субокци-ттально введенi МСК ВДл можуть м^рувати через СМР з мiсця ш'екци в рiзнi вiддiли ЦНС i виживати в них принаймнi протягом 5 дiб пiсля трансплантацп, здшсненоТ на пiку EAE (в ксеногенному варiантi без iмуносупресiï).
References
1. Darlington PJ, Boivin MN, Bar-Or A. Harnessing the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in multiple sclerosis. Expert Rev Neurother. 2011 Sep;11(9):1295-303. doi: 10.1586/ern.11.113. PubMed PMID: 21864075; PubMed Central PMCID: PMC3234364.
2. H0glund RA, Maghazachi AA. Multiple sclerosis and the role of immune cells. World J Exp Med. 2014 Aug 20;4(3):27-37. doi: 10.5493/wjem.v4.i3.27. PubMed PMID: 25254187; PubMed Central PMCID: PMC4172701.
3. Mastorodemos V, Ioannou M, Verginis P. Cell-based modulation of autoimmune responses in multiple sclerosis and experimental autoimmmune encephalomyelitis: therapeutic implications. Neuroimmunomodulation. 2015;22(3):181-95. doi: 10.1159/000362370. PubMed PMID: 24852748.
4. Goldenberg MM. Multiple sclerosis review. P T. 2012 Mar;37(3):175-84. PubMed PMID: 22605909; PubMed Central PMCID: PMC3351877.
5. Karussis D, Karageorgiou C, Vaknin-Dembinsky A, Gowda-Kurkalli B, Gomori JM, Kassis I, Bulte JW, Petrou P, Ben-Hur T, Abramsky O, Slavin S. Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Arch Neurol. 2010 0ct;67(10):1187-94. doi: 10.1001/ archneurol.2010.248. PubMed PMID: 20937945; PubMed Central PMCID: PMC3036569.
6. Cohen JA. Mesenchymal stem cell transplantation in multiple sclerosis. J Neurol Sci. 2013 Oct 15;333(1-2):43-9. doi: 10.1016/j.jns.2012.12.009. PubMed PMID: 23294498; PubMed Central PMCID: PMC3624046.
7. Constantin G, Marconi S, Rossi B, Angiari S, Calderan L, Anghileri E, Gini B, Bach SD, Martinello M, Bifari F, Galiè M, Turano E, Budui S, Sbarbati A, Krampera M, Bonetti B. Adipose-derived mesenchymal stem cells ameliorate chronic experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells. 2009 0ct;27(10):2624-35. doi: 10.1002/stem.194. PubMed PMID: 19676124.
8. Axelsson M, Malmeström C, Gunnarsson M, Zetterberg H, Sundström P, Lycke J, Svenningsson A. Immunosuppressive therapy reduces axonal damage in progressive multiple sclerosis. Mult Scler. 2014 Jan;20(1):43-50. doi: 10.1177/13 52458513490544. PubMed PMID: 23702432.
9. Lublin FD, Bowen JD, Huddlestone J, Kremenchutzky M, Carpenter A, Corboy JR, Freedman MS, Krupp L, Paulo C, Hariri RJ, Fischkoff SA. Human placenta-derived cells (PDA-001) for the treatment of adults with multiple sclerosis: a randomized, placebo-controlled, multiple-dose study. Mult Scler Relat Disord. 2014 Nov;3(6):696-704. doi: 10.1016/ j.msard.2014.08.002. PubMed PMID: 25891548.
10. Uccelli A, Laroni A, Freedman MS. Mesenchymal stem cells for the treatment of multiple sclerosis and other neurological diseases. Lancet Neurol. 2011 Jul;10(7):649-56. doi: 10.1016/ S1474-4422(11)70121-1. PubMed PMID: 21683930.
11. Keating A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 2012 Jun 14;10(6):709-16. doi: 10.1016/ j.stem.2012.05.015. PubMed PMID: 22704511.
12. Nakano N, Nakai Y, Seo TB, Homma T, Yamada Y, Ohta M, Suzuki Y, Nakatani T, Fukushima M, Hayashibe M, Ide C. Effects of bone marrow stromal cell transplantation through CSF on the subacute and chronic spinal cord injury in rats. PLoS One. 2013 Sep 11;8(9):e73494. doi: 10.1371/journal. pone.0073494. PubMed PMID: 24039961; PubMed Central PMCID: PMC3770680.
13. Isakova IA, Baker K, DuTreil M, Dufour J, Gaupp D, Phinney DG. Age- and dose-related effects on MSC engraftment levels and anatomical distribution in the central nervous
systems of nonhuman primates: identification of novel MSC subpopulations that respond to guidance cues in brain. Stem Cells. 2007 Dec;25(12):3261-70. doi: 10.1634/stemcells.2007-0543. PubMed PMID: 17932418.
14. Phinney DG, Baddoo M, Dutreil M, Gaupp D, Lai WT, Isakova IA. Murine mesenchymal stem cells transplanted to the central nervous system of neonatal versus adult mice exhibit distinct engraftment kinetics and express receptors that guide neuronal cell migration. Stem Cells Dev. 2006 Jun;15(3):437-47. doi: 10.1089/scd.2006.15.437. PubMed PMID: 16846379.
15. Zhao G, Liu F, Lan S, Li P, Wang L, Kou J, Qi X, Fan R, Hao D, Wu C, Bai T, Li Y, Liu JY. Large-scale expansion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells on gelatin microbeads, with retention of self-renewal and multipotency characteristics and the capacity for enhancing skin wound healing. Stem Cell Res Ther. 2015 Mar 19;6:38. doi: 10.1186/ s13287-015-0031-3. PubMed PMID: 25889402; PubMed Central PMCID: PMC4413550.
16. Romo-González T, Chavarría A, Pérez-H J. Central nervous system: a modified immune surveillance circuit? Brain Behav Immun. 2012 Aug;26(6):823-9. doi: 10.1016/ j.bbi.2012.01.016. PubMed PMID: 22310920.
17. [Law of Ukraine No 3447-IV On the Protection of Animals from Cruelty] [Internet]. Verkhovna Rada of Ukraine. 2017 [cited 24 May 2017]. Ukrainian. Available from: http://zakon2. rada.gov.ua/laws/show/3447-15.
18. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes [Internet]. Council of Europe. 2017 [cited 24 May 2017]. Available from: https://rm.coe.int/168007a67b.
19. Maslova OO, Shuvalova NS, Sukhorada OM, Zhukova SM, Deryabina OG, Makarenko MV, et al. Heterogeneity of Umbilical Cords as a Source for Mesenchymal Stem Cells. Dataset Papers in Biology. Hindawi Limited; 2013;2013:1-4. doi: 10.7167/2013/370103.
20. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-7. doi: 10.1080/14653240600855905. PubMed PMID: 16923606.
21. Feurer C, Prentice DE, Cammisuli S. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis in the Lewis rat. J Neuroimmunol. 1985 Dec;10(2):159-66. doi: 10.1016/0165-5728(85)90006-2. PubMed PMID: 3877741.
22. Miller SD, Karpus WJ, Davidson TS. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Curr Protoc Immunol. 2010 Feb;Chapter 15:Unit 15.1. doi: 10.1002/0471142735. im1501s88. PubMed PMID: 20143314.
23. Grimberg J, Nawoschik S, Belluscio L, McKee R, Turck A, Eisenberg A. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 1989 Oct 25;17(20):8390. doi: 10.1093/ nar/17.20.8390. PubMed PMID: 2813076; PubMed Central PMCID: PMC334995.
24. Biase FH, Franco MM, Goulart LR, Antunes RC. Protocol for extraction of genomic DNA from swine solid tissues. Genet Mol Biol. 2002;25(3):313-315. doi: 10.1590/S1415-47572002000300011.
25. Becker M, Nitsche A, Neumann C, Aumann J, Junghahn I, Fichtner I. Sensitive PCR method for the detection and realtime quantification of human cells in xenotransplantation systems. Br J Cancer. 2002 Nov 18;87(11):1328-35. doi: 10.1038/sj.bjc.6600573. PubMed PMID: 12439725; PubMed Central PMCID: PMC2408903.
26. Kovalchuk MV, Shuvalova NS, Pokholenko IO, Draguljan MV, Gulko TP, Deryabina OG, Kordium VA. Monitoring of transplanted human mesenchymal stem cells from Wharton's jelly in xenogeneic systems in vivo. Biopolymers and Cells. 2015;31(3):193-199. doi: 10.7124/bc.0008E0.
