CC BY
20
Орипнальна стаття = Original article = Оригинальная статья
УДК 616.832-002-056.3:616.9-092-089.843:591.81
Особливосп nepe6iry експериментального алерпчного енцефаломieлiтy niсля трансплантацм стовбурових клiтин
Пчкур Л.Д.1, Семенова В.М.2, Вербовська С.А.1, Олексенко Н.П.3, Ак/нола С.Т.1
Мета. Вивчити nepe6ir експериментального алерпчного енцефаломieлiту (ЕАЕ) тсля внутрiшньовенного введення гемопоетичних стовбурових кл^ин (ГСК) та субокципiтальноï нейротрансплантацiï фетальних нейро^тин (ФН), ïx вплив на штенсившсть процесiв вiдновлення нервовоï тканини у щурiв при ЕАЕ.
Матер1али i методи. Дослiдження проведене на 40 щурах, маса тiла 200 г. ЕАЕ моделювали з використанням повного ад'юванта Фрейнда. В основнш групi 32 щурам внутрiшньовенно вводили ГСК (10 млн. чи 20 млн. ^тин) та субокциттально ФН (2 млн.). Кл^чний перебiг ЕАЕ оцшювали в перiод до 110 дiб. Тварин виводили з експерименту через 23, 35 дiб та 2 мю пiсля моделювання ЕАЕ. Препарати забарвлювали за Нiсслем, гематоксилшом та еозином, гематоксилiном та ткрофуксином, проводили морфометрiю. Результати. У грут №1 (без введення ГСК та ФН) одужання тварин не спостер^али, з 26-ï доби вiдзначений хрошчний перебiг ЕАЕ. Тваринам групи №2 вводили ГСК у дозi 10 млн. ^тин, пiк клiнiчниx проявiв ЕАЕ спостерiгали на 20-ту добу з поступовим одужанням тварин. У щурiв групи №3 введення ГСК у дозi 20 млн. ^тин статистично значуще сприяло швидшому регресу кл^чних проявiв у порiвняннi з таким в грут №2. Одужання тварин, яким водили ГСК i ФН, вщбувалося статистично значуще швидше шж тварин, у яких застосовували лише ГСК. У щурiв групи №5 (ГСК у дозi 20 млн. ^тин з подальшим штратекальним введенням ФН) спостерiгали тимчасове статистично значуще попршення стану пiсля введення ГСК та швидке покращення стану тсля введення ФН — на 29-ту добу. В уах тварин спостерiгали тенденцiю до зменшення кiлькостi патологiчно змiнениx нейроцитiв та кшькосл глiоцитiв. Висновки. Найбiльш виражений позитивний вплив на переб^ захворювання, швидкiсть вiдновлення клiнiчного стану тварин i збереження нейрошв вiдзначали при внутршньовенному введеннi 20 млн. ГСК з подальшим субокциттальним введенням ФН, особливо на 63-тю добу спостереження.
Ключовi слова; експериментальний алерпчний енцефалом/ел/т; нейротрансплантац/я; гемопоетичнi стовбуров1 клтини; фетальнi нейрокл/тини.
Украшський нейрохiрyргiчний журнал. 2017;(2):27-33.
The features of experimental allergic encephalomyelitis after stem cells transplantation
Leonid D. Pichkur1, Vira M. Semenova 2, Svitlana A. Verbovska 1, Natalia P. Oleksenko 3, Samuel T. Akinola 1
1 Вщдтення вщновлювальноТ нейрох1рурги, 1нститут нейрох1рурги iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
2 Лабораторiя культивування тканин, 1нститут нейрохiрургiï iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
3 Вщдт нейробiохiмiï, 1нститут нейрохiрургiï iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН УкраТни, КиТв, УкраТна
Над1йшла до редакцп 02.02.17. Прийнята до публ1кацП 30.03.17.
Адреса для листування:
П'/чкур Леонд Дмитрович, Вддлення вщновлювально/ нейрох1рургП, 1нститут нейрох1рург1У ¡м. акад. А.П. Ромоданова, вул. Платона Майбороди, 32, Ки'1в, УкраУна, 04050, e-mail: wurra@yandex.ru
1 Restorative Neurosurgery Department, Romodanov Neurosurgery Institute, Kyiv, Ukraine
2 Tissue Cultivating Laboratory, Romodanov Neurosurgery Institute, Kyiv, Ukraine
3 Neurobiochemistry Department, Romodanov Neurosurgery Institute, Kyiv, Ukraine
Received, February 02, 2017. Accepted, March 30, 2017.
Address for correspondence/
Leonid Pichkur, Restorative Neurosurgery Department, Romodanov Neurosurgery Institute, 32 Platona Maiborody St, Kyiv, Ukraine, 04050, e-mail/ wurra@ yandex.ru
The objective. To study the course of experimental allergic encephalomyelitis (EAE) after intravenous administration of hematopoietic stem cells (HSC) and suboccipital transplantation of fetal neurocells (FNC), and treatment impact on intensity of neural tissue renewing in rats with EAE. Materials and methods. The experiment included 40 rats, average weight 200 g. EAE was induced using complete Freund's adjuvant. In 32 rats with EAE we used intravenous HSK (10 million cells or 20 million cells) and suboccipital transplantation of FNC (0.1 ml). The EAE clinical course was estimated up to 110 days. The rats were taken from the experiment on 23rd, 25th days and in 2 months after EAE induction. The preparations were stained by Nisse, with hematoxylin, eosin and picro-fuchsin. Morphological and morphometric studies were performed.
Results. Complete recovery was not observed, and on the 26th day of the experiment EAE was regarded as a chronic process. After allogeneic HSC administration (in dose 10 million cells) peak of clinical manifestations was observed on the 20th day of the experiment with animals' gradual complete recovery. Administration of allogeneic HSC in a dose of 20 million cells leads to significantly more rapid regression of clinical signs compared to the treatment with allogeneic HSC in a dose of 10 million cells. Animals' recovery after intravenous introduction of HSC and suboccipital transplantation of FNC was significantly more rapid than after treatment just with HSC. The treatment
© ^чкур Л.Д., Семенова В.М., Вербовська С.А., Олексенко Н.П., Аюнола С.Т., 2017
with intravenous introduction of HSC (20 million cells) and suboccipital transplantation of FNC was associated with temporary significant deterioration after HSC administration and rapid recovery after FNC application (on the 29th day). In all treatment options we revealed the tendency to reduction of pathologically changed neurocyts and gliocyts number. Conclusion. Suboccipital administration of allogeneic FNC improves the clinical condition of rats with EAE. The best results of experimental EAE treatment were observed at intravenous administration of HSC (20 million cells) followed by FNC neurotransplantation, particularly on the 63rd day.
Keywords: experimental allergic encephalomyelitis; neurotransplantation; hematopoietic stem cells; fetal neurocells.
Ukrainian Neurosurgical Journal. 2017;(2):27-33.
Особенности течения экспериментального аллергического энцефаломиелита после трансплантации стволовых клеток
Пичкур Л.Д.1, Семёнова В.М.2, Вербовская С.А.1, Олексенко Н.П.3, Акинола С.Т.1
1 Отделение восстановительной нейрохирургии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
2 Лаборатория культивирования тканей, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
3 Отдел нейробиохимии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
Поступила в редакцию 02.02.17. Принята к публикации 30.03.17.
Адрес для переписки:
Пичкур Леонид Дмитриевич, Отделение восстановительной нейрохирургии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова, ул. Платона Майбороды, 32, Киев, Украина, 04050, e-mail: wurra@yandex.ru
Цель. Изучить течение экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) после внутривенного введения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и субокципитальной нейротрансплантации фетальных нейроклеток (ФН), их влияние на интенсивность процессов восстановления нервной ткани крыс при ЭАЭ.
Материалы и методы. Исследование проведено на 40 крысах, масса тела 200 г. ЭАЭ моделировали с использованием полного адъюванта Фрейнда. В основной группе 32 крысам внутривенно вводили ГСК (10 млн. или 20 млн. клеток) и субокципитально 2 млн. ФН. Клиническое течение ЭАЭ оценивали в сроки до 110 сут. Животных выводили из эксперимента на 23-и, 35-е сутки и через 2 мес после моделирования ЭАЭ. Препараты окрашивали по Нисслю, гематоксилином и эозином, гематоксилином и пикрофуксином, проводили морфометрию.
Результаты. В группе №1 (без введения ГСК и ФН) полное выздоровление животных не наблюдали, с 26-х суток течение ЭАЭ было хроническим. В группе №2 вводили ГСК в дозе 10 млн. клеток, пик клинических проявлений наблюдали на 20-е сутки с постепенным выздоровлением животных. В группе №3 введение 20 млн. ГСК статистически значимо способствовало более быстрому регрессу клинических проявлений по сравнению с такими в группе №2. Выздоровление животных, которым вводили ГСК и ФН, происходило статистически значимо быстрее, чем у животных, которым вводили только ГСК. В группе №5 (ГСК в дозе 20 млн. клеток с последующим интратекальным введением ФН) наблюдали временное статистически значимое ухудшение состояния животных после введения ГСК и быстрое улучшение состояния после введения ФН — на 29-е сутки. У всех крыс наблюдали тенденцию к уменьшению количества патологически измененных нейроцитов и уменьшение количества глиоцитов. Выводы. Наиболее выраженное позитивное влияние на течение заболевания, скорость восстановления клинического состояния животных и сохранность нейронов отмечены при внутривенном введении 20 млн. ГСК с последующим субокципитальным введением ФН, особенно на 63-и сутки наблюдения.
Ключевые слова; экспериментальный аллергический энцефаломиелит; нейротрансплантация; гемопоэтические стволовые клетки; фетальные нейроклетки.
Украинский нейрохирургический журнал. 2017;(2):27-33.
Вступ. Демieлiнiзацiя е патофнзюлопчним про-явом рiзних захворювань, як подшяють на хвороби з наявним генетично детермшованим дефектом проце-су закладання та формування мiелiну (дисмiелiновi) та хвороби з руйнуванням нормально синтезованого мiелiну ^елшокластичш). Саме до мiелiнокластич-них захворювань належать розаяний склероз (РС), поствакцинальний та експериментальний енцефа-ломiелiт, зокрема, ЕАЕ [1, 2].
На переб^ ЕАЕ впливають багато чинниюв, зокрема, продукти ембрюфетоплацентарного комплексу
[1], алогенна нервова тканина [3], компоненти ембрю-нально''' нервово''' тканини (ЕНТ) [4], стовбуровi ^тини юсткового мозку [5], лiпопротеïновi комплекси [6] тощо. Бшьшмсть дослщниюв вивчають вплив на ЕАЕ будь-яких чинниюв на висот кл^чних проявiв захво-рювання [1, 3—5, 7, 8], вплив нейрогенних стовбурових кл^ин на процеси де- i ремieлiнiзацiï при ЕАЕ [3].
Переб^ ЕАЕ супроводжуеться порушенням гене-тично' недоторканост iмунноï системи, що за деяких ситуацш зумовлюе аутоiмуннi реакци, за шших — то-лерантнють [9].
Стаття м'1стить рисунки, як! вдображаються в друкован'1Й версИу в'дт'/нках срого, в електронн'1Й — у кольор'1.
При енцефаломiелiтi надзвичайно важливу роль в^грають аутоiмуннi реакцп, яю, в тому чи^ за типом мiмiкрiï, беруть участь у руйнуванш структур нервово' системи.
Для усунення аутоiмунiтету i попередження вщ-торгнення нейрогенних клiтин ми використали споаб моделювання толерантностi до аутоантигешв шляхом внутрiшньовенного введення ГСК, здатних шдукува-ти таку толерантшсть. Здатнiсть стовбурових клiтин виживати i збер^ати властивостi протягом тривалого часу тсля ксеногенноï трансплантацiï встановлена нами рашше [10]. Таким чином, виникае стан мкро-химеризму. Гiпотетично мкрохимерш клiтини мають бути недиференцiйованими, оскшьки здатнi цирку-лювати в органiзмi та заселяти рiзнi органи, експре-сувати антигени, характернi для вщповщних тканин, внаслiдок чого ïх вважають стовбуровими клiтинами [11]. Мiкрохимернi ГСК здатш диференцiюватися у трофобласти, В- i Т^мфоцити, моноцити, природнi кшери (NK-клiтини) у кровi реципiента. Фетальш ме-зенхiмальнi стовбуровi клiтини можуть диференцю ватися в остеогенному, хондрогенному, бюгенному, адипогенному та нейрогенному напрямках. Фетальш химерш клiтини експресують маркери ендотелiально-го диференцiювання VEGFR2+, CD31+, можуть брати активну участь у репараци пошкоджених тканин рiз-них оргашв, зокрема, центральноï нервовоï системи (ЦНС), в якш при деяких захворюваннях виявляють демiелiнiзацiю [12].
Таким чином, з нашоï точки зору, ГСК можуть сприяти формуванню толерантност i створювати спри-ятливi умови для виживання трансплантованих нейрогенних стовбурових ^тин [13]. Це сприятиме про-дукци трофiчних факторiв та штеграци ФН у тканину ЦНС рецитента, замiсному ефекту. Нейрогеннi ^тини здатнi поповнювати склад клiтин-попередниць, забез-печуючи умови для ремiелiнiзацiï аксошв, вiдновлення нервовоï тканини, зменшення моторного дефщиту при запально-дегенеративному ураженнi ЦНС.
Мета роботи: вивчити вплив ГСК i нейрогенних стовбурових ^тин на переб^ ЕАЕ та штенсившсть процеав вiдновлення нервовоï тканини в експеримент на щурах.
Матерiали i методи дослiдження. Дослщження проведене на 40 бiлих нелiнiйних щурах розводки вiварiю 1нституту нейрохiрургiï, масою тiла 200—220 г. Вс процедури з дослiдними тваринами виконували вщповщно до мiжнародних правил i норм European Communities Council Directives (1986, 86/609/EEC) та принцитв £вропейськоï Конвенцiï про захист хребет-них тварин, яких використовують для експерименталь-них та наукових цiлей [14], Закону Украши "Про захист тварин вщ жорстокого поводження" [15].
ЕАЕ моделювали шляхом пiдшкiрноï iн'екцiï го-могенату спинного мозку щурiв з повним ад'ювантом Фрейнда, що мютив 3 мг/мл Mycobacterium tuberculosis з розрахунку 50 мг енцефалiтогенноï сумш на 100 г маси тта тварини [16—18]. Енцефалiтогенну сумiш вводили у подушечки юншвок фiксованих тварин.
Кл^чний перебiг ЕАЕ оцiнювали за такими озна-ками: тонус м^в кiнцiвок, тонус хвоста, стан сфшк-терiв, наявнiсть парезу та паралiчу, артриту, трофiчних змiн на юншвках. Ступiнь тяжкостi оцiнювали в балах (табл. 1). КлЫчш спостереження за тваринами проводили щодня протягом 1 мю, у кожноï тварини виз-начали ступiнь тяжкостi з огляду на зовшшш ознаки та кл^чний стан. У подальшому тварин обстежували двiчi на тиждень до 40-ï доби. Пiсля зникнення клЫч-них проявiв захворювання спостереження проводили 1 раз на тиждень до 63-ï доби. Тварин виводили з ек-
сперименту на 23-тю, 35-ту добу та через 2 Mic пiсля моделювання ЕАЕ.
У 32 lyypiB з ЕАЕ для аналiзу залежноcтi клiнiчного перебiгу захворювання вщ кiлькоcтi введених клiтин внутрiшньовенно вводили 0,25 мл суспензи (10 млн. кл^ин) i 0,5 мл суспензи (20 млн. кл^ин) алогенних ГСК з подальшим cубокципiтальним введенням ФН (2 млн. ^тин в об'eмi 0,1 мл) (табл. 2).
^тини вводили внутрiшньовенно на 7-му добу тсля шдукцп ЕАЕ у хвостову вену фiкcованих тварин. Субокципiтальне введення здшснювали на 21-шу добу тсля шдукцп ЕАЕ, тд загальним знеболенням шляхом введення сумш розчинiв ксилазину (Sedazin, Biowet, Польща, в дозi 15 мг/кг) i кетамiну (Calypsol, Гедеон Рiхтер А.О., Угорщина, в дозi 10 мг/кг) внутршньооче-ревинно. Шерсть на шиТ вистригали ножицями, здмсню-вали пункцiю великоТ потиличноТ цистерни, у лiкворнi простори вводили суспензи нейрогенних клiтин.
Пiдготовку та вивчення кл^инного складу суспензи ГСК та нейрогенних клiтин проводили у вщдЫ молекулярноТ бiохiмiТ.
Суспензи ГСК отримували з фетальноТ печшки щура (строки геcтацiТ 12—13 дiб) за методом N. Shiojiri, M. Nitou [19]. Вмicт живих ^тин в cуcпензiТ визначали з застосуванням в^ального барвника трипанового синього шляхом тдрахунку в камерi Горяева [20, 21]. Для подальших доcлiджень використовували лише зразки з вмютом живих ^тин не менше 80%. Загальна концентрашя клiтин в отриманiй суспензи становила 40 млн. в 1 мл. Аналiз ^тинного складу отриманоТ cуcпензiТ проводили на препаратах, забарвлених за Романовським—Пмза [22, 23].
Суспензт ФН щурiв отримували за методом C.N. Svedensen [20]. Вмicт живих ^тин в суспензи визначали за допомогою вiтального барвника. Для подальших дослщжень використовували лише зразки з вмютом живих клiтин не менше 70%. Загальна концентрашя ^тин в отриманiй суспензи становила 20 млн. в 1 мл.
Для встановлення кшькосп стовбурових нейрогенних ^тин за допомогою iмуногicтохiмiчного методу ви-являли неcтин-позитивнi (Nest+) та ß-тубулш-позитивш клiтини [20, 21]. Використовували первинш антитiла до нестину (Dako, Данiя). Вiзуалiзацiю зв'язування здiйcнювали за допомогою системи Multivision Polymer Detection (Dako, Дашя).
Для морфологiчноТ оцшки клiтинного складу ciроТ речовини спинного мозку тварин, у яких моделювали
Таблиця 1. Шкала тяжкост ЕАЕ.
Кiлькiсть балiв Прояви
0 Вщсутнкть клЫчних проявт
1 Зниження тонусу хвоста
2 Слабкть або легкий паралiч задшх кiнцiвок
3 Тяжкий паралiч заднiх або вах кiнцiвок
4 Термiнальний стан
5 Смерть
Таблиця 2. Розподш тварин по групах.
Група Лшування
1 Контрольна, ЕАЕ без лкування
2 ГСК (0,25 мл суспензи, 10 млн. кл^ин)
3 ГСК (0,5 мл суспензи, 20 млн. кл^ин)
4 ГСК (0,25 мл суспензи, 10 млн. кл^ин) та нейротрансплантащя (2 млн. кл^ин в об'емi 0,1 мл)
5 ГСК (0,5 мл суспензи, 20 млн. кл^ин) та нейротрансплантащя (2 млн. кл^ин в об'емi 0,1 мл)
2
1,75 X 1,S
I 1-25 3 1
Ш 0,7S 0.5 0,25 0
_____________JC_____________________
—* R3 = о,огаэ
у ------^кг-------------
..................... ..... _ _ IJV-____
---------------------------— -т-,-,-,-т-,-^-й-.
2 4 6 S 10 12 11 IS IS 25 2 24 26 К 30 32 34 Строки спостереження, д1б
-А -Групэ Внупрадньовенне Евецення 10 илнапогенниг ГСК о групэ Ш. eû£ без riifysawHs
Я - Е :ро _ен:сть по л iHOnianb HOi ЗпрО к Симацл л hi тренду групи N? 2
Рис. 1. Динамiка клiнiчного стану щурiв, яким внутрiшньовенно вводили 10 млн. алогенних ГСК.
Рис. 2. Динамка ключного стану щурiв, яким вводили 20 млн. алогенних ГСК.
2
1,75 m 1,5 I 1.25
S 1
ш
С, 75 0,5 0,25
0
Rr - 0^751
лг тз -------------о_________
Л—(Г и X \ 6
-erV ,—.—.-
2 4 Ё 4 1С 12 1« 16 20 22 24 26 28 30 12 34 Строки спостереження, д1б
А Групд №4. Кнут и шнаЭЕенне 10 нлн ГСК те субокц и п ггальне ФН о Група N91, ЕАЕбеэ лкування -к ^¡рогйнкть полпчо н1йль но'г апроксгмаци'Л1ш тренду груги 1Ч?4
Рис. 3. Динамка клЫчного стану щурiв групи №4, яким внутршньовенно введено 10 млн. алогенних ГСК та субокциттально 2 млн. ФН.
ЕАЕ, у рiзних серiях дослiдiв вiдiбранi найбтьш якiснi гiстологiчнi препарати з приблизно однаковою товщиною зрiзiв, якi забарвлювали тiонiном за Нiсслем, гематоксилiном та еозином, гематоксилЬ ном та ткрофуксином. Клiтинами (ней-роцити, глiоцити) зi змiненою цитологieю вважали клiтини з деформованим ядром, вакуолiзацieю, гiперхроматозом або хроматолiзом, зменшеним об'емом ядра, деформашею цитоплазми та тигролiзом — ознаками, характерними для iшемiчних змiн. ^тини рахували у свiтлооптичному мiкроскопi (цитоаналiзатор зображення „IBAS-2000", Нiмеччина) пiсля виведен-ня зображення на телемонiтор. Загалом обраховаш 180 полiв зору, майже 8 тис. ^тин.
Статистична обробка отриманих да-них проведена за критерiем Вткоксона-Манна-Уïтнi для малих сукупностей [24] та критерiем Ст'юдента. Використовували програму Microsoft Excel. Вивчали вiрогiд-ностi полiномiальноï апроксимацiï за три-валого спостереження за тваринами ^ра полiному — 2). Апроксимашя — наближе-ний опис кореляцшно!' залежностi змiнних вiдповiдним рiвнянням функцюнально''' залежностi, що передае основну тенден-цiю залежностi або ïï «тренд» [24].
Результати та ïx обговорення. Динамiка клiнiчного стану щурiв, яким вводили алогенш ГСК у дозi 10 млн. клiтин, та щурiв групи спостереження наведена на рис. 1. Через 12 дiб тсля лiкування спостерiгали статистично значуще прискорення вщновлення тонусу м'язiв юншвок в експериментальних тварин у бтьш раннi строки та бiльш динамiчне, нiж у щурiв контрольноï групи. Слщ звернути увагу, що у пером днi пiсля трансплантацм алогенних ГСК стан щурiв попршувався, проте, статистично незначуще. В подальшому спостерiгали формування ЕАЕ з тком клiнiчних проявiв на 20-ту добу з поступовим одужанням тварин. У грут №1 одужання тварин не спостер^али, з 26-ï доби переб^ ЕАЕ був хронiчним.
Отже, введення щурам алогенних ГСК у дозi 10 млн. ^тин супроводжува-лося поступовим полтшенням стану та прискоренням одужання, з тимчасовим статистично незначущим погiршенням стану пiсля застосування ^тин.
У зв'язку з цим, а також для вив-чення залежност клiнiчного ефекту вiд кшькосп введених ГСК, вивчений вплив на переб^ ЕАЕ внутршньовен-ного введення ГСК у бшьшш дозi — 20 млн. кл^ин (рис. 2). Через 10 дiб пiсля л^ування спостерiгали статистично значуще прискорення вщновлення тонусу м'язiв кiнцiвок в експериментальних тварин. Також у першм дш пiсля транс-плантацiï алогенних ГСК стан тварин статистично значуще попршувався. У подальшому спостер^али формування ЕАЕ з тком кл^чних проявiв на 19-ту добу з поступовим одужанням тварин.
^м того, вщзначений статистично зна-чущий регрес проявiв ЕАЕ та одужання тварин групи №3, швидший за такий в грут №2.
Таким чином, у щурiв групи №3 пiсля введення 20 млн. алогенних ГСК кл^ч-ний стан тимчасово статистично значуще попршувався з подальшим одужанням на 32-гу добу експерименту. Клiнiчний пере-бiг захворювання у щурiв, яким вводили алогенш ГСК у дозi 20 млн. клiтин (група №3), статистично значуще не вiдрiзняеть-ся вщ такого в групi тварин №2.
Результати впливу алогенних ФН (в 0,1 мл суспензи 2 млн. нейрогенних клЬ тин вводили субокциттально) на 21-шу добу спостереження тсля попереднього внутрiшньовенного введення 10 млн. ГСК (група №4) i 20 млн. ГСК (група №5) представлен на рис. 3 i 4. У тварин групи №4 у пером дш пiсля введення алогенних ГСК клЫчний стан статистично незначуще погiршувався, у подальшому спостерiгали (також, статистично незначуще) попршення стану пiсля введення ФН. Проте, одужання тварин вщбувалося статистично значуще швидше, нiж щурiв у групах №2 i №3.
У грут №5 у першм дш пiсля введення алогенних ГСК стан щурiв статистично значуще погiршувався, проте, у подальшому, тсля нейротрансплантацп, попршення стану щурiв статистично значуще не вщбувалося. Одужання тварин, яким вводили ГСК у бшьшш дозi та ФН, вiдбувалося швидше — на 29-ту добу, а лЫя тренду мала бiльш експансивний напрямок.
Таким чином, стан щурiв, яким вводили ГСК у дозi 10 млн. ^тин з подальшим штратекальним введенням ФН, характери-зувався тимчасовим статистично незначу-щим попршенням пiсля кожного лiкування. Проте, слщ мати на увазi, що тварин перед субокциттальним введенням ФН нарко-тизували, що, на тлi клЫчних проявiв ЕАЕ, також зумовлювало попршення Тх клiнiчного стану. У цшому, регрес проявiв ЕАЕ при застосуванн алогенних ГСК у дозi 10 млн. ^тин з подальшим введенням ФН статистично значуще швидший, жж у тварин груп №2 i №3.
Пщ час морфометричного обробляння результа^в гiстологiчного дослiдження тканини спинного мозку у кожному полi зору рахували загальну кшьюсть ней-рожв, нейронiв зi змiненою i нормальною цитолопею, а також кiлькiсть глюци^в. Кiлькiсть патологiчно змiнених нейронiв пом^но зменшувалася у дослiдних групах тварин порiвняно з такою в грут №1, особливо на 35-ту добу дослщження, з поступовим збiльшенням Тх кшькост в групах №2 i №4 на 63-тю добу. Так, у грут №1 вона становила 7,7±1,1, в групi №5 — 3,7±0,5. При введеннi тваринам ттьки ГСК або ГСК в дозi 10 млн. клЬ тин з ФН кшьюсть патологiчно змiнених нейроци^в наближалась до такоТ в грут №1 (рис. 5, 6). На 63-тю добу кшьюсть
2,25 2
1,75 а 1,5
I i« i 1
0,5
0,25
...............
V—______________
/¿
--------р------ ^.......... А V- -о
/ / о \\
------------ .....vaky
____-Ztt_____ __________\„\_____
—.—г- а \ г-I-1-1-.-A-,
2 4 Й É 10 12 14 1& 13 20 22 24 26 24 » 32 14 Строки спостережешя, д/S
4 Група №5. Внутрнин ьп венне еваденн» 20 млн ГСК та cyfia кцнпгггл ьке ФН О Група НИ. ЕАЕ 6&Э Л1кування — R - вдо гifluicib пол но кйлы-Ю1 агсро ксимаци лпчи трещу групи NY5
Рис. 4. Динамка ключного стану щурiв групи №5, яким вводили 20 млн. алогенних ГСК та субокциттально 2 млн. ФН.
Рис. 5. Морфолопчна оцшка кл^инного складу спинного мозку у щурiв з ЕАЕ на 35-ту добу.
Рис. 6. Морфолопчна оцшка ^тинного складу спинного мозку у щурiв з ЕАЕ на 63-тю добу.
незмшених нейрошв суттево не вiдрiзнялася в уах групах, крiм групи №2.
Динамка кшькосп глiальних клiтин свщчила, що у тварин групи №1 на 20% збшьшувалася кiлькiсть глюци^в, що свiдчило про активацiю 1х пролiферацiï. Спостерiгали зменшення кiлькостi глюци^в в усiх експериментальних тварин, особливо в грут №5.
У цтому, результати морфометричних дослiджень свщчили про ефективнiсть застосування в гострому перiодi експериментального запально-дегенеративно-го ураження ЦНС хiрургiчного методу, що передбачав субокциттальне введення у лiкворнi простори алогенних ФН, особливо за попереднього застосування ГСК в кшькост 20 млн. Вщзначено меншу ефектившсть лише внутршньовенного введення ГСК. Так, загальна структура спинного мозку тсля введення мало: дози ГСК суттево не вiдрiзнялася вщ такоï у тварин конт-рольноï групи.
В трансплантологи важливим чинником устшносп приживлення ^тин е досягнення iмунноï толеран-тностi. Тривала толерантнiсть без фармаколоично! супресiï може iснувати, наприклад, при трансплантацм ГСК. Деяк дослiдники вважають змiну iмунноï вiдповiдi у рецитен^в при мiкрохимеризмi, спричиненому до-норськими ГСК, як шдукщю взаемноï iмунологiчноï нереактивностi [25, 26].
Отриманi нами результати вивчення впливу клЬ тинноï терапiï на перебiг ЕАЕ свщчать про можливiсть виникнення такоï нереактивност^ оскiльки кращi результати досягнутi у тварин, яким внутршньовенно вводили 20 млн. ГСК i в подальшому субокциттально ФН.
Висновки. 1. Кл^чний переб^ захворювання у тварин контрольноï групи, змши морфометричних показникiв спинного мозку свщчили про вiдповiднiсть моделi ЕАЕ хрошчному процесу ремiтуючого перебiгу розаяного склерозу.
2. В усiх експериментальних тварин виявлена позитивна динамка ключного стану i переб^у захворювання, без переходу процесу в хрошчний. Деяке попршення стану тварин в групах №3 i №5 тсля введення ^тин можна пояснити впливом наркозу або великое кшькосп ГСК.
3. Найбтьш виражений позитивний вплив на пе-реб^ захворювання, швидюсть вiдновлення клiнiчного стану тварин i збереження нейрошв вщзначали при внутршньовенному введеннi 20 млн. ГСК з подальшим субокципiтальним введенням ФН, особливо на 63-тю добу спостереження.
Список л^ератури
1. Гусев Е.И. Рассеянный склероз / Е.И. Гусев, Т.Л. Демина, А.Н. Бойко. — М.: Нефть-газ, 1997. — 464 с.
2. Гусев Е.И. Неврология и нейрохирургия: учебник: в 2 т. / Е.И. Гусев, А.Н. Коновалов, В.И. Скворцова. — 2-е изд., испр. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. — Т.2. — 420 с.
3. Грищенко В.И. Роль криобиологии в создании биотехнологий клеточной и тканевой трансплантации / В.И. Грищенко // Пробл. криобиологии. — 2001. — №3. — С.7-8.
4. Супрессия экспериментального аллергического энцефаломиелита субокципитальным введением трофина - экстракта эмбриональной нервной ткани / В.И. Цымбалюк, Н.И. Лисяный, О.В. Маркова, Л.Д. Пичкур, Т.И. Осипенко // Аллергология и иммунология. — 2001. — Т.2, №2. — С.135.
5. Изучение иммуномодулирующих свойств адгезивных клеток костного мозга / Н.И. Лисяный, Е.В. Задорожная, И.А. Гнедкова, Л.Н. Бельская, Д.Н. Станецкая, А.И. Ключникова // 1мунолопя та алерголопя: наука i практика. — 2013. — №3. — С.4-8.
6. Кононенко В.В. Герпесвiруси вщ синдрому хрошчноТ втоми до оргашчних уражень центральное нервовоТ системи / В.В.
Кононенко, Ю.А. Борштейн, Т.В. Сольська // 1мунолопя та алерголопя. — 2001. — №4. — С.36.
7. Вплив нейрогенних кл^ин на процеси де- та ремieлiнiзацм
в експеримент / В.1. Цимбалюк, Л.Д. Шчкур, В.М. Семенова, В.В. Васлович, Ю.А. Касяненко, О.В. Маркова, С.А. Вербовська, О.Л. Шчкур // Матерiали конф. нейрохiрургiв Украши «Досягнення нейрохiрурпT останнього десятирiччя» в рамках мiжнар. мед. форуму «1нновацп в медицин — здоров'я нацм» (Китв, 26-27 верес. 2012 р.). — К., 2012. — С.113.
8. Брондз Б.Д. Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом распознавании / Б.Д. Брондз. — М.: Наука, 1987. — 471 с.
9. Starzl T.E. Chimerism and tolerance in transplantation / T.E. Starzl // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2004. — V.101, suppl.2.
— P.14607-14614.
10. Distribution of transplanted human mesenchymal stem cells from Wharton's Jelly in the central nervous systems of the EAE rats / M.V. Kovalchuk, O.G. Deryabina, L.D. Pichkur, S.A. Verbovskaya, N.S. Shuvalova, O.L. Pichkur, V.A. Kordium // Biopolymers and Cell. — 2015. — V.31, N5. — P.371-378.
11. Гринь В.К. Микрохимеризм. I. Возможные источники и роль при аутоиммунных заболеваниях / В.К. Гринь, А.М. Гнилорыбов, Е.С. Иващенко, Н.Н. Трубникова, В.А. Мелёхина, О.Е. Полулях, В.В. Риджок // Укр. ревматолог. журн. — 2011. — №1(43). — С.43-51.
12. Muja N. Neural precursors exhibit distinctly different patterns of cell migration upon transplantation during either the acute or chronic phase of EAE: a serial MR imaging study / N. Muja, M.E. Cohen, J. Zhang, H. Kim, A.A. Gilad, P. Walczak, T. Ben-Hur, J.W. Bulte // Magn. Reson. Med. — 2011. — V.65, N6. — P.1738-1749.
13. Цымбалюк В.И. Нейрогенные стволовые клетки: монография / В.И. Цымбалюк, В.В. Медведев. — К.: Коваль, 2005. — 596 с.
14. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes // Council of European. — Strasbourg, 1986. — N123. — 51 p.
15. Закон Укратни «Про захист тварин вщ жорстокого поводження» вщ 21.02.06 №3447-IV // Вщомост Верховнот Ради Укратни. — 2006. — №27. — С.990.
16. Лкяний М.1. Моделювання експериментального алерпчного енцефаломieлiту у щурiв i його корекщя кл^инами алогенного головного мозку / М.1. Лкяний, О.В. Маркова, Л.М. Бельська // Фiзiол. журн. — 2001. — Т.47, №5. — С.37-41.
17. Нефьодов О.О. Моделювання та оцшка перебку експериментального алерпчного енцефаломieлiту / О.О. Нефьодов, В.Й. Мамчур, Ю.В. Харченко // Вкн. пробл. бюлогм i медицини. — 2014. — вип.4, Т.2(114), вип.4.
— С.205-208.
18. Давыдова Г.С. Вопросы направленного моделирования аллергического энцефаломиелита / Г.С. Давыдова // Демиелинизирующие заболевания нервной системы в эксперименте и клинике. — Минск: Наука и техника, 1975. — C.24-33.
19. Shiojiri N. Purification and culture of fetal mouse hepatoblasts that are precursors of mature hepatocytes and biliary epithelial cells / N. Shiojiri, M. Nitou // Methods Mol. Biol. — 2012. — V.826. — P.3-10.
20. A new method for the rapid and long-term growth of human neural precursor cells / C.N. Svendsen, M.G. ter Borg, R.J. Armstrong, A.E. Rosser, S. Chandran, T. Ostenfeld, M.A. Caldwell // J. Neurosci. Method. — 1998. — V.85, N2.
— P.141-152.
21. In vitro expansion of a multipotent population of human neural precursor cells / M.K. Carpenter, X. Cui, Z.Y. Hu, J. Jackson, S. Sherman, A. Seiger, L.U. Wahlberg // Exp. Neurol.
— 1999. — V.158, N2. — P.265-278.
22. Лили Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / Р. Лили. — М.: Наука, 1969. — 540 c.
23. Гривцова Л.Ю. Субпопуляция трансплантируемых стволовых клеток // Л.Ю. Гривцова, Н.Н. Тупицын / Онкогематология. — 2006. — Т.8, №1. — С.65—71.
24. Лапач С.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Exсel / С.Н. Лапач, А.В. Чубенко, Н.Н. Бабич. — К.: Морион, 2001. — 320 с.
25. Соколова Л.И. Показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных рассеянным склерозом с герпесвирусной персистенцией / Л.И. Соколова, А.А. Кругляк // 1мунолопя та алерголопя. — 2003. — №4.
- С.84-85.
26. Lassmann H. Multiple sclerosis: experimental models and reality. / H. Lassmann, M. Bradl // Acta Neuropathol. — 2017.
- V.133, N2. — P.223-244.
References
1. Gusev EI, Demina TL, Boyko AN. Rasseyannyy skleroz. [Multiple Sclerosis]. Moscow: iNeft'-gaz;1997. Russian.
2. Gusev EI, Konovalov AN, Skvortsova VI. Nevrologiya i neyrokhirurgiya: uchebnik. [Neurology and Neurosurgery: A textbook]. Moscow: GEOTAR-Media; 2009. 2nd ed. Vol.2. Russian.
3. Grishchenko VI. Rol' kriobiologii v sozdanii biotekhnologiy kletochnoy i tkanevoy transplantatsii. [Cryobiology role in the creation of biotechnology cell and tissue transplantation]. Problemy Cryobiologii. 2001;3:7-8. Russian.
4. Tsymbaliuk VI, Lisianyi NI., Markova OV, Pichkur LD, Osipenko TI. Supressiya eksperimental'nogo allergicheskogo entsefalomiyelita suboktsipital'nym vvedeniyem trofina
- ekstrakta embrional'noy nervnoy tkani. [Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by intrathecal injection of trofin - extract embryonic neural tissue]. Allergology and Immunology. 2001;2(2):135. Russian.
5. Lisianyi NI, Zadorozhnaya EN, Gnedkova IA, Bel'ska LN, Klyuchnikova AI. Izucheniye immunomoduliruyushchikh svoystv adgezivnykh kletok kostnogo mozga. [Study of the immunomodulatory properties of adhesive cells of bone marrow] Immunology and Allergology: Science and Practice. 2013;3:4-8. Russian. http://nbuv.gov.ua/UJRN/ Ita_2013_3_3
6. Kononenko VV, Borshteyn YA, Solska TV. Herpesvirusy vid syndromu khronichnoyi vtomy do orhanichnykh urazhen' tsentral'noyi nervovoyi systemy. [Herpesvirus from chronic fatigue syndrome to organic lesions of the central nervous system]. Immunology and Allergology. 2001;4:36. Ukrainian.
7. Tsymbalyuk VI, Pichkur LD, Semenova VM, Vaslovych VV,
Kasyanenko YA, Markova OV, Verbovska SA, Pichkur Ol. Vplyv neyrohennykh klityn na protsesy de- ta remiyelinizatsiyi v eksperymenti. [Impact of neurogenic cells on the processes of de- and remyelination in experiment]. In: Abstracts Book of the Conf. of Neurosurgeons of Ukraine "Dosyahnennya neyrokhirurhiyi ostann'oho desyatyrichchya» v ramkakh mizhnar. med. forumu «Innovatsiyi v medytsyni — zdorov'ya natsi "; 2012 September 26-27; Kyiv, Ukraine. Kyiv, 2012. P.113. Ukrainian.
8. Brondz BD. T-limfotsity iikh retseptory vimmunologicheskom raspoznavanii. [T-lymphocytes and their receptors in immunological recognition]. Moscow: Science; 1987. Russian.
9. Starzl TE. Chimerism and tolerance in transplantation. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101 Suppl. 2:14607-14. DOI:10.1073/ pnas.0404829101. PMID:15319473.
10. Kovalchuk MV, Deryabina O.G., Pichkur LD, Verbovskaya SA, Shuvalova NS, Pichkur OL, Kordium VA Distribution of transplanted human mesenchymal stem cells from Wharton's Jelly in the central nervous systems of the EAE rats. Biopolymers and Cell. 2015;31(5):371-8.
11. Grin VK, Gnylorybov AM, Ivaschenko YS, Trubnikova NN, Melokhina VA, Polulyakh OY, Ridzhok VV. Mikrokhimerizm. I. Vozmozhnyye istochniki i rol' pri autoimmunnykh zabolevaniyakh. [Microcyimerism. I. Possible sources and role in autoimmune diseases]. Ukrainian Journal of Rheumatology. 2011;1(43):43-51. Russian.
12. Muja N, Cohen ME, Zhang J, Kim H, Gilad AA, Walczak P, Ben-Hur T, Bulte JW. Neural precursors exhibit distinctly different patterns of cell migration upon transplantation during either the acute or chronic phase of EAE: a serial MR imaging study. Magn Reson Med. 2011;65(6):1738-49. D01:10.1002/mrm.22757. PMID:21305597.
13. Tsymbaluk VI, Medvedev VV. Neyrogennyye stvolovyye kletki: monografiya. [Neurogenic stem cells: Monograph]. Kiev: Koval'; 2005. Russian.
14. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. Council of European. Strasbourg; 1986. 51 p.
15. Zakon Ukrainy «Pro zahyst tvaryn vid zhorstokogo povodzhennja» vid 21.02.2006 №3447-IV [Law of Ukraine «On the Protection of Cruelty to Animals» from 21.02.2006 №3447-IV]. Vidomosti Verhovnoi' Rady Ukrai'ny, 2006;27:990. Ukrainian.
16. Lisianyi MI, Markova OV, Bel'ska LN. Modelyuvannya eksperymental'noho alerhichnoho entsefalomiyelitu u shchuriv i yoho korektsiya klitynamy alohennoho holovnoho mozku. [Modelling of experimental allergic encephalomyelitis for rats and his correction by the cells of allogenic cerebrum]. Fiziol Zhurn. 2001;47(5):37-41. Ukrainian.
17. Nefedov AA, Mamchur VI, Kharchenko YV. Modelyuvannya ta otsinka perebihu eksperymental'noho alerhichnoho entsefalomiyelitu. [Modelling and evaluation of experimental allergic encephalomyelitis]. Visnyk problem biolohiyi i medytsyny. 2014;2(4):205-8. Ukrainian. http://nbuv.gov. ua/UJRN/Vpbm_2014_4%282%29__46
18. Davydova GS. Voprosy napravlennogo modelirovaniya allergicheskogo entsefalomiyelita. [Questions of directed simulation of allergic encephalomyelitis]. In: Demiyeliniziruyushchiye zabolevaniya nervnoy sistemy v eksperimente I klinike. [Demyelinating diseases of the nervous system in the experimental and clinic]. Minsk: Nauka
i tehnika; 1975. p.24-33. Russian.
19. Shiojiri N, Nitou M. Purification and culture of fetal mouse hepatoblasts that are precursors of mature hepatocytes and biliary epithelial cells. Methods Mol Biol. 2012;826:3-10. DOI: 10.1007/978-1-61779-468-1_1. PMID:22167635.
20. Svendsen CN, Borg MG, Armstrong RE, Rosser AE, Chandran S, Ostenfeld T, Caldwell MA. A new method for the rapid and long-term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Method. 1998;85(2): 141-52. PMID:9874150.
21. Carpenter MK, Cui X, Hu ZY, Jackson J, Sherman S, Seiger A, Wahlberg LU. In vitro expansion of a multipotent population of human neural precursor cells. Exp Neurol. 1999;158(2):265-78. D0I:10.1006/exnr.1999.7098. PMID:10415135.
22. Lilly R. Patogistologicheskaya tekhnika i prakticheskaya gistokhimiya. [Histopathological techniques and practical histochemistry]. Moscow: Nauka; 1969. Russian.
23. Grivtsova LY, Tupitsyn NN. S u b p o p u lya t s iya transplantiruyemykh stvolovykh kletok. [Subpopulation of transplanted stem cells]. Oncohematologiya. 2006;8(1):65-71. Russian.
24. Lapach SN, Chubenko AV, Babich NN. Statisticheskiye metody v mediko-biologicheskikh issledovaniyakh s ispol'zovaniyem Excel. [Statistical methods in biomedical research using Exsel]. Kiev: Morion; 2001. Russian.
25. Sokolova LI, Kruglyak AA. Pokazateli kletochnogo i gumoral'nogo immuniteta u bol'nykh rasseyannym sklerozom s gerpesvirusnoy persistentsiyey. [Indexes of cellular and humoral immunity in multiple sclerosis patients with herpesvirus persistence. Imunolohiya ta alerholohiya. 2003(4):84-5. Russian.
26. Lassmann H, Bradl M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 2017;133(2):223-44. DOI: 10.1007/s00401-016-1631-4. PMID:27766432.
Науковий редактор: M.I. ЛНсяний, д.мед.н., проф.
