CC BY
48
Оглядова стаття = Review article = Обзорная статья
УДК 612.014:542.46 «312»
Сучасн шдходи до крюконсервування кл^ин мезенхiмального походження
Маслова О.О.1, Дерябiна О.Г.1, П'чкур Л.Д.2, Вербовська С.А.2, Аюнола С.Т.2
1 Вщдш генних технологш, 1нститут генетично''' та регенеративно!' медицини НАМН УкраТ'ни, КиТ'в, Укра'на
2 Вiддiлення вщновлювально''' нейрохiрурп'', 1нститут нейрохiрурп'' iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра'ни, Ки'в, Укра'на
Над1йшла до редакцИ 12.12.16. Прийнята до публ/кацИ 27.12.16.
Адреса для листування:
П/чкур Леонд Дмитрович, Вщд/лення вдновлювальноi нейрох/рургИ, 1нститут нейрох/рургИ ¡м. акад. А.П. Ромоданова, вул. Платона Майбороди, 32, Ки/в, Украна, 04050, e-mail: wurra@yandex.ru
Проблема лкування запально-дегенеративних захворювань центрально! нервовоТ системи (ЦНС) людини актуальна. Прогрес в лкуванш цих захворювань пов'язують з розвитком кл^инних технологш. Одними з найперспектившших для використання в клЫчнш практик е клiтини вартонових драглiв пуповини (пупкового канатика), при отриманш яких не виникае морально-етичний конфлкт, процедура Тх видiлення досить проста. Зважаючи на перспективи клiнiчного застосування мезенхiмальних стовбурових клiтин (МСК) пуповини людини, постае питання вибору оптимального методу Тх тривалого збер^ання (крюконсервування), зокрема, режиму заморожування, виду крюпротектора, тривалост збер^ання. Проаналiзованi огляди лiтератури останшх рокiв про способи крiоконсервування МСК, зокрема, отриманих з тканини пуповини людини.
Ключовi слова: мезенх/мальн/ стовбуровi кл'иини; мультипотентнI клтини; кр 'юзбереження; кропротектори; диметилсульфоксид.
Украшський нейрохiрургiчний журнал. — 2017. — №1. — С.5-10.
Modern approaches to cryopreservation of mesenchymal stem cells
Olga O. Maslova1, Olena G. Deriabina1, Leonid D. Pichkur2, Svetlana A. Verbovska2, Samuel T. Akinola2
'Department of Gene Technology, Institute of Genetic and Regenerative Medicine of NAMS of Ukraine, Kiev, Ukraine
2Restorative Neurosurgery Department, Romodanov Neurosurgery Institute, NAMS of Ukraine, Kiev, Ukraine
Received, December 12, 2016. Accepted, December 27, 2016.
Address for correspondence/
Leonid Pichkur, Restorative Neurosurgery Department, Romodanov Neurosurgery Institute, 32 Platona Maiborody st., Kiev, Ukraine, 04050, e-mail/ wurra@yandex.ru
The problem of treating inflammatory and degenerative lesions of the central nervous system remains relevant. In recent years, advances in the treatment of diseases are associated with the development of cellular technology. The umbilical cord stem cells exhibit the most promise for use in clinical practice. Its recovery does not raise any moral and ethical conflicts, and the culturing process is quite simple. The prospect of clinical application of human umbilical cord mesenchymal stem cells raises a question of choosing the optimal method for long-term storage (cryopreservation) considering freezing mode, type of cryoprotectants and storage time. This review focuses on the analysis of recent papers about cryopreservation of mesenchymal stem cells, including umbilical cord stem cells.
Keywords: mesenchymal stem cells; multipotent cells; cryopreservation; cryoprotectants; dimethyl sulfoxide.
Ukrainian Neurosurgical Journal. 2017;(1):5-10.
Современные подходы к криоконсервированию клеток мезенхимального происхождения
Маслова О.А1, Дерябина Е.Г1, Пичкур Л.Д.2, Вербовская С.А.2, Акинола С.Т.
1 Отдел генных технологий, Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины, Киев, Украина
2 Отделение восстановительной нейрохирургии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
Поступила в редакцию 12.12.16. Принята к публикации 27.12.16.
Адрес для переписки:
Пичкур Леонид Дмитриевич, Отделение восстановительной нейрохирургии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова, ул. Платона Майбороды, 32, Киев, Украина, 04050, e-mail: wurra@yandex.ru
Проблема лечения воспалительно-дегенеративных заболеваний ЦНС человека актуальна. Прогресс в лечении таких заболеваний связывают с развитием клеточных технологий. Одними из наиболее перспективных для использования в клинической практике являются клетки вартонового геля пуповины человека, при получении которых не возникает морально-этический конфликт, процедура их выделения достаточно проста. Исходя из перспектив клинического применения МСК пуповины человека, следует рассматривать вопросы выбора оптимального метода длительного хранения (криоконсервирования) МСК с учетом режима замораживания, вида криопротектора, продолжительности хранения. Проанализированы данные литературы последних лет о способах криоконсервирования МСК, в том числе полученных из ткани пуповины человека. Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки; мультипотентные клетки; криоконсервирование; криопротекторы; диметилсульфоксид.
Украинский нейрохирургический журнал. — 2017. — №1. — С.5-10.
© Маслова О.О., Дерябша О.Г., ni4Kyp Л.Д., Вербовська С.А., Акшола С.Т., 2017
2
Вступ. Проблема л^ування запально-дегене-ративних захворювань ЦНС людини актуальна i потребуе подальших новаторських рiшень. Прогрес у лкуванш цих захворювань пов'язують з розвитком ^тинних технологiй. У теперiшнiй час досягнув певнi успiхи у вивченш можливостi впливу за допомогою клiтин-прогенiторiв рiзного походження (нейрогеннi стовбуровi кл^ини фетального мозку, гемопоетичнi стовбуровi ^тини) на деструктивний аутоiмунiтет, нейротрофiчнi процеси. Проте, застосування цих клЬ тин мае деяк обмеження, в тому чи^ бiоетичнi [1].
Регенеративна медицина з кожним роком потребуе все бшьшоТ гарантп безпечностi та ефектив-ностi клiтинноТ терапiТ, тому обрання оптимальних джерел кл^ин е одним з ТТ ключових етатв. Сьогоднi в клiтиннiй терапiТ використовують рiзноманiтнi клЬ тини (як дорослого оргашзму, так i ембрiональнi), особливе мюце серед яких посiдають мезенхiмальнi стовбуровi (мультипотентнi стромальнi) клiтини (МСК). Це зумовлене, насамперед, Тх iмунокоригу-вальними властивостями, здатнiстю диферен^юва-тись в декшька типiв клiтин, можливютю отримання великоТ кiлькостi клiтин за короткий час, вщносною простотою культивування. Опублковаш данi про ви-явлення та устшне видiлення МСК практично з уах тканин органiзму, проте, основну увагу придтяють таким джерелам кл^ин, як кiстковий мозок, жирова тканина, провiзорнi ембрiональнi тканини (плацента, пуповина тощо). Одними з найперспектившших для використання в клiнiчнiй практик е клiтини варто-нових дра^в пуповини (пупкового канатика), якi, на вщмшу вiд кiсткового мозку та жировоТ тканини, мiстять клiтини, що збереглися з раннiх етапiв ем-брiогенезу [2].
При отриманнi кл^ин з пуповини не виникае морально-етичний конфлкт, процедура iзолювання МСК з пупкового канатика досить проста. В дослщах на тваринах тсля iмуносупресiТ доведено, що внут-рiшньовенне або тдшюрне введення таких клiтин не спричиняе Тх вщторгнення або критичного негативного впливу. На звичайних тваринах без iмуносупресiТ показано, що принаймш одноразова транспланташя ксеногенних кл^ин вартонових драглiв пуповини можлива без Тх негайного вщторгнення. Данi л^е-ратури свiдчать про бiльш виражеш iмуносупресивнi властивостi МСК пуповини у порiвняннi з аналопч-ними ^тинами з iнших джерел, що, поряд з шшими перевагами, обгрунтовуе перспектившсть Тх використання в регенеративнш медицинi [3].
Зважаючи на перспективи ключного застосування МСК пуповини людини, постае питання щодо вибору оптимального методу тривалого збер^ання (крюконсервування) МСК, режиму заморожування, виду крюпротектора, тривалостi зберiгання.
В останнi роки вщзначають активний розвиток технологiй збереження кл^ин i тканин. Найчастiше для Тх збереження застосовують метод крюконсервування. Значний досвщ накопичений у приватних та публiчних крiобанках, де збер^ають кiстковий мозок, пуповинну кров, пуповину, жирову тканину, пульпу молочних зубiв та шшн тканини, з яких можна отримати кл^ини, а також безпосередньо кл^инний матерiал: гемопоетичш стовбуровi клiтини (ГСК), МСК, ендотелiальнi клiтини, гамети тощо [2, 4].
1снують кiлька пiдходiв до крюзбереження. Процес заморожування можна роздiлити за швидюстю на стрiмке та повтьне (у тому числi програмоване). Агентом, що забезпечуе низьку температуру може бути як рщкий азот, так i його газова фаза.
Окремо слщ видтити пiдходи до пщбору крюпро-тектора — речовини, що забезпечуе збереження властивостей ^тини у незмшеному виглядi протя-гом перюду крiоконсервацiТ. У цьому питаннi единоТ думки немае. Так, вже протягом тривалого часу для крюконсервування ^тин застосовують диметилсуль-фоксид (ДМСО), мехашзми дiе якого добре вивченi. Цей крюконсервант е стандартним i для комерцшного збереження клiтин, i для наукових дослщжень. Проте, при застосуванш ДМСО як крiопротектора, навiть в м^мальних дозах, можливе виникнення небажаних реакцш, тому препарат не сертифкований для застосування в лкуванш пацiентiв. Це спонукало до пошуку альтернативних речовин, здатних захищати кл^ину вiд пошкодження, зумовленого наднизькою температурою, та бути безпечними для подальших машпуляцш з ^тинами, у тому чи^ для введення в оргашзм пацiента [5].
Також важливим елементом крюпротекторно-го розчину е джерело факторiв росту або бiлкiв — сироватка, збагачена тромбоцитами плазма або альбумш. Рiзноманiття розчинiв зумовлене великою кшьюстю можливих поеднань концентрацiТ зазначе-них компонен^в.
Проаналiзованi данi лiтератури останшх рокiв щодо способiв крiоконсервування МСК, в тому чи^ отриманих з тканин пуповини людини, адже, саме це джерело МСК сьогодш визнане оптимальним.
Крюпротектори. За принципами дм розрiзняють крiопротектори, що проникають крiзь мембрану у клiтину, та таю, що створюють певш умови навколо ^тини. До першоТ групи належать глщерил, про-пiлен глiколь, етилен гл^оль, формамiд, метанол, бутандiол, ДМСО [6-8]. Вс цi речовини у рiзнi часи випробовували як крюпротектори для збереження оргашв, тканин i клiтин. Проте, застосування кожного з проникних крiопротекторiв зумовлюе рiзнi типи пошкодження клiтин, що виникають в основному внаслщок руйнування мембрани ^тин, пiдвищення рiвня окисного стресу або через осмотичний шок. £ вщомосп про зменшення iндивiдуальноТ токсичносп кожного крiопротектора за Тх комбшованого застосування. Механiзми такоТ взаемоди недостатньо вивченi [8, 9]. Наявшсть деяких недолiкiв i при застосуванш ДМСО спонукае до пошуку альтернатив. ДМСО нале-жить до групи проникних речовин,тому забезпечуе максимальне тдтримання властивостей кл^ини, за його високоТ концентраци виникають побiчнi реакци при подальшому застосуваннi розмороженого клЬ тинного матерiалу у клiнiцi [6-9]. Проблемою також е залежшсть токсичноТ дiТ ДМСО вiд температури. Так, за юмнатноТ температури ДМСО у концентраци, що застосовують тд час крюконсервування, досить швидко проявляе цитотоксичну д^, саме тому у бть-шост протоколiв крiоконсервування для клЫчного застосування рекомендують додавати крiопротектор не рашше нiж за 5-10 хв до заморожування [6-10]. До речовин, що вважають безпечшшими замшниками ДМСО, належать дисахариди (у тому чи^ трегалоза
та iH.). Проте, вони належать до непроникних крюпро-TeKTopiB i, без y4acTi проникного агенту, не забез-печують повний захист вiд утворення кристалиюв льоду [6, 7]. Тому бтьшнсть дослiдникiв схиляються до думки, що концентрашя ДМСО у крюпротекторному розчинi мае бути знижена, i до складу такого розчи-ну слщ додавати дисахариди [6-10]. Вiдрiзняються спiввiдношення крiопротектора та джерела факторiв росту при збереженнi вже видтених iз матерiалу клiтин (МСК, ГСК) та само!' тканини — джерела для подальшого отримання первинно! культури.
Показаний вплив ДМСО як на характеристики кл^ин тсля розмороження, так i на стан патента, якому введено дозу таких ^тин. Важливим аспектом ефективносп МСК е здатшсть до iмуномодуляцiï. У цiлому здатшсть пригшчувати або активувати iмунну вщповщь пiсля розмороження зберiгаеться, проте, виявлеш i деякi змiни, пов'язанi з активашею бiлкiв теплового шоку. Важливою е i здатнiсть до шдукова-ного диференцiювання. Цей параметр не змшюеться, хоча е данi про зниження здатност до адипо- та ос-теогенезу МСК, отриманих з стромально-васкулярно! фракцiï жирово! тканини тсля розмороження. Також вщзначають пiдвищення схильност МСК до дифе-ренцiювання у напрямку кардюмюци^в та нейронiв, хоча цей феномен можна застосовувати i з користю. Життездатшсть клiтин максимальна саме при застосуванш ДМСО у порiвняннi з шшими крюпротекторами: ДМСО — понад 80%, глщерилу — 70-80%, трегалози — 30-40%, цукрози — 20-30%. Здатшсть до експреси поверхневих маркерiв та морфолопчш особливост МСК пiсля розмороження змшюються, проте, iснуе загроза нестабiльностi хромосом тсля застосування ДМСО [6-13]. Функцюнально яскравим показником ефективносп МСК слщ вважати здатшсть до хоумш-гу. Дослщжень з вивчення цього аспекту небагато, проте, в деяких з них стверджуеться про зменшення здатносл до хоумiнгу внаслщок змiн взаемодiï з де-якими елементами позакл^инного матриксу. З побiч-них реакцiй, частота яких становить близько 50% у тварин та людини тсля введення крюзбережених з використанням ДМСО МСК, найбтьш части нудота, блювання, дiарея, бiль у живот^ головний бiль, зниження та тдвищення артерiального тиску. Значно рщше, проте, задокументованi й бшьш серйознi стани, спричиненi порушеннями серцево-судинно! та дихаль-но! систем: аритмiя, пригнiчення дихання, фатальне порушення ритму серця, обернена лейкоенцефа-лопатiя та нав^ь iнсульт. Описана смерть патента пiсля введення друго! дози крюконсервованих з ДМСО МСК, введених у строки до 24 год тсля першо! шфузм [6-8]. В лiтературi е повiдомлення i про спричинене ДМСО вившьнення гiстамiну, активацiю каспаз пщ час розмороження клiтин [6-8].
З альтернативних речовин, що застосовують для того, щоб повнiстю позбутися ДМСО або хоча б значно зменшити його концентра^ю у середовищi для крiозбереження, описують поеднане використання непроникних крiопротекторiв, найчастiше — сахарiв, зокрема, гiдроксиетилкрохмалю з сорбiтолом та декстраном. Цкаво, що поодинцi ц компоненти не проявляли достатнього захисного впливу на кл^и-ни, також не впливали на ефект при застосуванш у поеднанш кожно! речовини з ДМСО [14].
За даними досл^жень, багатокомпонентш крiопротектори бiльш безпечш [6, 14-18].
Привертають увагу i методи, що поеднують застосування хiмiчного крiопротектора — трегалози та фiзичного впливу — електропораци, що надае мож-ливiсть трегалозi потрапити у кл^ину. Саме такий тдхщ забезпечуе найбiльш ефективне тривале крюз-берiгання клiтин тканини пуповини людини [15, 16].
^м безпосередньо крюпротектора, середовище для крiозбереження клiтин мютить й iншi складовi. Важливим компонентом середовища для крюзбере-ження е джерело бткового компоненту (факторiв росту). Найчастше застосовують фетальну бичачу сироватку (ФБС), яку використовують для культиву-вання МСК. Проте, загальна тенденшя до уникнення застосування ксеногенних елемен^в шд час тдготов-ки ^тин до введення пацiентам привела до пошуку альтернатив ФБС. Серед них найчаспше застосовують аутолопчну та алогенну сироватку, збагачену тромбоцитами плазму, альбумш, комерцшш "xeno-free" розробки, призначеш спецiально для роботи у gmp-умовах [3-8, 18].
Стандартним для лабораторних машпуляцш з кл^инами е стввщношення компонентiв крюзахис-ного розчину: 10% ДМСО та 90% ФБС. £ протоколи з бтьшою або меншою концентрашею ДМСО, а також з замшою вiдповiдноï частини ФБС на поживне середовище. За тако! ситуаци отримують рiзнi варiанти сумiшей, зокрема, 5% ДМСО поеднують з 75% ФБС та 20% середовища ДМЕМ, або 25% ДМСО додають до 75% ФБС тощо [3, 4, 12].
Останшм часом вивчають i бтьш «екзотичш» компоненти середовища для крюзбереження — бт-ки гемолiмфи шовкопряда, що поеднують замщення функцш ФБС та можливосп для значного зменшення концентрацiï ДМСО [19].
Практично вс автори,якi дослщжують вплив крiопротекторiв на стан ^тин та реакцiï органiзму пiсля введення розмороженого матерiалу, наголошу-ють на необхщност вiдмивання крiопротектора перед введенням ^тин. У цьому планi робота з МСК дещо проспша, шж з ГСК, адже, iснуе можливють перед введенням клiтин в оргашзм провести, як мЫмум, 1 пасаж культивування, протягом якого ^тини при-крiплюються до поверхнi культурального посуду та поступово позбуваються крюпротектора, що виво-диться з кожною змшою середовища.
Описан i спецiальнi системи для вщмивання клiтин вiд крюпротектора, якщо немае можливосп або часу для культивування. Щоправда, такi системи недосконал^ процедура вiдмивання, як правило, супроводжуеться втратою частини життездатних кл^ин [20].
Вимоги до рщкого азоту та крюемностей.
У теперiшнiй час для крiозбереження бiоматерiалiв застосовують два тдходи: вмiщення крiоемностей з кл^инами у «дзеркало» рiдкого азоту (-196°С) та у газову фазу рщкого азоту (близько -150°С/-160°С) [3-8]. В обох цих варiантiв е переваги та недолги. Так, збереження у рщкш фазi дозволяе зменшити шюдливий вплив наднизько! температури на ^тину. У той же час, рщка фаза азоту бiльш агресивна до матерiалiв, тому слiд дуже ретельно тдбирати крюем-ностi. Додаткову небезпеку становить забруднення
рщкого азоту вiрусами, мкрооргашзмами та грибами, а також перехресне забруднення ^тинним матерiа-лом, що витiкае крiзь м^рошпаринки недостатньо герметичних крiоемностей в азот i може потрапити в шший зразок [21]. Тому для збер^ання матерiалiв у «дзеркал^> рiдкого азоту часто застосовують до-датковi методи захисту — вмщують крiопробiрки чи крюпакети у подвiйнi зовнiшнi пакети, як розташову-ють у металевих касетах. Формат таких емностей та способи розташування зразюв рiзняться залежно вщ будови судини Дюара. Крюзбер^ання у парах рiдкого азоту забезпечуе тдтримання дещо вищоТ темпера-тури та характеризуеться ТТ бiльшою лабшьшстю, що може спричинити додаткове пошкодження клiтинного матерiалу. Проте, така форма крюзбер^ання бiльш безпечна з точки зору поширення iнфекцiй та перех-ресного забруднення, оскiльки хоча шфекцмш агенти i можуть зберiгатись у газовш фазi, для такоТ форми рщкого азоту е бiльше надшних крiоемностей, що значно знижуе ризик забруднення [9, 11, 21]. Немае визначеноТ позици щодо вибору мiж крiопробiрками та крiопакетами для збереження саме МСК.
Швидюсть замороження. 1снують два стра-тегiчнi пiдходи до крiозамороження клiтин: швидке (вiтрифiкацiя) та повшьне.
Вiтрифiкацiя — процес швидкого вмiщення клiтин у «дзеркало» рщкого азоту без перехiдних етапiв. Для ефективност методу клiтини мають безпосе-редньо контактувати з рiдким азотом. Цей тдхщ мае двi варiацiТ: така, що потребуе мультимолярноТ концентраци крiопротектора (додають поетапно) та така, що вщбуваеться за дещо меншоТ концентрацiТ крiопротектора, проте, потребуе надшвидкого зни-ження температури. Для рiзкого зниження темпера-тури застосовують спешальш носiТ з скла, кварцу або пластика, що забезпечують максимальну швидюсть охолодження [6, 8]. Основними недол^ами в^рифка-ц1Т е необхiднiсть волод^и специфiчними навичками виконання процесу. Таю склады методичш пiдходи виправдовують себе, коли потрiбно заморозити не-велику кшьюсть клiтин (метод найкраще адаптова-ний для крiоконсервування гамет), проте, вони не е адекватними для збереження значного об'ему ^тин, у тому чи^ МСК. Також вщзначають збшьшення потенцiйноТ шкоди вiд застосування високоТ концен-трацiТ крiопротекторiв та вiрогiднiсть виникнення осмотичного шоку [6-8]. Не виршене також питання забруднення, адже саме при в^риф^ацп кл^ини безпосередньо контактують з рiдким азотом.
Повшьне заморожування — процес поетапного зниження температури зразка, часто з застосуванням спешального обладнання. Стандартним для збереження ГСК та МСК вважають режим зниження температури на 1°С за 1 хв. ТакоТ швидкост досягають, застосовуючи програмш заморожувач^ проте, школи наближаються до неТ за поетапного зниження температури у ручному режиму витримуючи зразки спочат-ку при +4°С, а по^м при -80°С [3, 7, 9, 11, 21].
Одним з основних завдань, ^м пошуку оптимального крюпротектора, е розробка закритоТ сис-теми, що дозволить збер^ати клiтини з мiнiмальним впливом людини та уникненням контакту з азотом. Деяк комерцшш розробки доступнi вже сьогодш, проте, Тх масове застосування недоцшьне (у зв'язку з
високими витратами на закутвлю та обслуговування таких систем) [20].
Що стосуеться розморожування ^тин, при за-стосуванш апаратiв для програмного заморожування в них е системи i для автоматичного повшьного розморожування ^тин. За вiдсутностi таких систем застосовують водяш банi при температурi близько 37°С [7, 9].
Пiдходи до оцшки ефективностi процесу крiозбереження. Основним показником ефектив-ностi крiозбереження вважають життездатшсть клiтин пiсля розмороження. Цей показник визначають як методом забарвлення трипановим сишм, так i проточно!' цитофлуориметри (забарвлення 7-AAD). Деяк автори довели кiлькiсть життездатних ^тин пiсля розмороження до 90% i бiльше [22-30].
Також звертають увагу на вщповщшсть морфологи кл^ин у культурi характеристикам МСК.
В уах дослiдженнях придiляють увагу оцшц iмунофенотипу МСК до i тсля розмороження методом проточно' цитофлуориметрiT. Iснуючi методи крюзбе-реження клiтин дозволяють зберегти високий рiвень експресiT позитивних поверхневих маркерiв МСК (стандартних CD73, CD90, CD105 та деяких шших, вибiр яких рiзний у рiзних роботах) та низький рiвень експреси (або TT вiдсутнiсть) негативних поверхневих мар^в МСК (CD34, CD45) [7, 23, 24].
Типовим для перевiрки властивостей МСК е оцшка здатност до трилiнiйного диференцiювання: у хон-дрогенному, остеогенному та адипогенному напрям-ках. Як правило, таке шдуковане диференцiювання е успiшним як до, так i пiсля розмороження кл^ин. Оцiнюють ефективнiсть диференцiювання стандарт-ними методами: iмуноцитохiмiчним та гiстохiмiчним за-барвленням, визначають маркери певного напрямку. Додатково оцшюють здатнiсть до диференшювання МСК в iнших напрямках [17, 22-30].
Деяк дослiдники аналiзують карютип, щоб оцЬ нити ризик виникнення аномалш хромосом пiд час замороження-розмороження [22-30].
Дослщжено експресiю певних генiв до i пiсля розмороження МСК, а також системного введення в оргашзм дослщних тварин. При цьому порiвнювали незаморожеш клiтини, клiтини пiсля розморожування та ^тини, знайденi у легенях мишей, яким Тх вводили. Дослщжували експресiю методом РНК-секвенування. Суттевi вiдмiнностi експресiT основних маркерiв не знайдеш [23, 24].
1нформативним показником е вимiрювання миттевоT, опосередкованоT кров'ю запальноT реакцп, що оцiнюють за вмютом цитокiнiв та хемокiнiв у тканиш, в яку вводили ^тини. Встановлений деякий вплив на цей показник процесу замороження-розмороження [22-30].
Також проводили дослщження з визначення ризи-ку утворення пухлин in vivo — вводили МСК тдшюрно та системно у хвостову вену nude мишам. Через 6 мю спостереження тварин виводили з експерименту та оцшювали стан оргашв. Ще одним параметром, за яким часто оцшюють яюсть процесу крюзбережен-ня, е здатшсть МСК до iмуномодуляцiT. Так, ^тини перевiряють у взаемодiT з м^оген-активованими мо-нонуклеарами периферiйноT кровi [22-30].
У теперiшнiй час найбшьш поширенi методи крюз-береження МСК, основан на застосуваннi ДМСО як
крюпротектора та нексеногенного джерела i^iaKTopiB росту (сироватка, збагачена тромбоцитами плазма). Хоча ДМСО мае недолги та побiчнi ефекти, його основною перевагою е можливють найдовшого вив-чення i застосування та розумшня механiзмiв дм як на клiтинному, так i органному рiвнi. Проте, пошук бшьш безпечного крюпротектора, що забезпечить захист кл^иш на тому самому рiвнi, що й ДМСО, та буде поз-бавлений його недолшв, тривае, адже, сьогодш не iснуе крюформули, що доведено гарантувала б повно-цiнне збереження усiх функцiй кл^ини та безпеку пiд час застосування. Чим ретельшше вивчають ефекти комбшованих крiопротекторiв, тим бiльша вiрогiднiсть отримати максимально оптимiзоване спiввiдношення речовин, ефекти яких будуть детально описан як на рiвнi культури клiтин, так i на рiвнi реакцiй оргашзму реципiента клiтинного матерiалу. Найбiльш доцшьним методом пiдготовки до крiозберiгання МСК вважають поступове зниження температури, переважно у про-грамному заморожувачi.
Список л^ератури
1. Цымбалюк В.И. Нейротрансплантация как модель медицины будущего: морально-этические проблемы / В.И. Цымбалюк // Мистецтво лкування. — 2004. — №1.
— С.6-11.
2. Fagioli Fr. Mesenchymal stem cell manufacturing for clinical use / Fr. Fagioli, Iv. Ferrero. Progress in Stem Cell Transplantation, Chapter 7; ed. Taner Demirer. — 2015. http://doi:10.5772/61370
3. Vangsness C.T. Umbilical cord tissue offers the greatest number of harvestable mesenchymal stem cells for research and clinical application: а literature review of different harvest sites / C.T. Vangsness, H. Sternberg, L. Harris // Arthroscopy. J. Arthroscop. Relat. Surg. — 2015. — V.31, N9. — P.1836-1843.
4. Maslova O. Umbilical cord tissue-derived cells as therapeutic agents / O. Maslova, M. Novak, P. Kruzliak // Stem Cells Internat. — 2015. — V.2015. — P.1-10.
5. Balci D. The assessment of cryopreservation conditions for human umbilical cord stroma-derived mesenchymal stem cells towards a potential use for stem cell banking / D. Balci, A. Can // Curr. Stem Cell Res. Ther. — 2013. — V.8, N1. — P.60-72.
6. Preserving human cells for regenerative, reproductive, and transfusion medicine / W. Asghar, R. El. Assal, H. Shafiee, R.M. Anchan, U. Demirci // Biotechnol. J. — 2014. — V.9, N7.
— P.895-903.
7. Mantri S. Cryoprotective effect of disaccharides on cord blood
stem cells with minimal use of DMSO / S. Mantri, S. Kanungo, P.C. Mohapatra // Ind. J. Hematol. Blood Transfus. — 2014.
— V.31, N2. — P.206-212.
8. Best B.P. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions / B.P. Best // Rejuvenat. Res. — 2015. — V.18, N5. — P.422-436.
9. Cryopreservation of human mesenchymal stem cells for clinical applications: current methods and challenges / K.W. Yong, W.K. van Safwani, F. Xu, W.A. WanAbas, J.R. Choi, B. Pingguan-Murphy // Biopreservation and biobanking. — 2015.
— V.13, N4. — P.231-239.
10. Cryoprotective agent toxicity interactions in human articular chondrocytes / K.A. Almansoori, V. Prasad, J.F. Forbes, G.K. Law, L.E. McGann, J.A. Elliott, N.M. Jomha // Cryobiology.
— 2012. — V.64, N3. — P.185-191.
11. Bioprocessing of human mesenchymal stem/stromal cells for therapeutic use: current technologies and challenges / A.C. Schnitzler, A. Verma, D.E. Kehoe, D. Jing, J.R. Murrell, K.A. Der, M. Aysola, P.J. Rapiejko, S. Punreddy, M.S. Rook // Biochem. Engin. J. — 2016. — V.108. — P.3-13.
12. Optimizing isolation culture and freezing methods to preserve Wharton's jelly's mesenchymal stem cell (MSC) properties: an MSC banking protocol validation for the Hellenic Cord Blood Bank / T.K. Chatzistamatiou, A.C. Papassavas, E. Michalopoulos, C. Gamaloutsos, P. Mallis, I. Gontika, E.
Panagouli, S.L. Koussoulakos, C. Stavropoulos-Giokas // Transfusion. — 2014. — V.54, N12. — P.3108-3120.
13. The effects of cryopreservation on cells isolated from adipose, bone marrow and dental pulp tissues / O.G. Davies,
A.J. Smith, P.R. Cooper, R.M. Shelton, B.A. Scheven // Cryobiology. — 2014. — V.69, N2. — P.342-347.
14. Naaldijk Y. Cryopreservation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in complex sugar based cryoprotective solutions / Y. Naaldijk, V. Fedorova, A. Stolzing // J. Biotechnol. Letters. — 2013. — V.4, N.2. — P.95-99.
15. Cryopreservation of stem cells using trehalose: evaluation of the method using a human hematopoietic cell line / S.S. Buchanan, S.A. Gross, J.P. Acker, M. Toner, J.F. Carpenter,
D.W. Pyatt // Stem Cells Development. — 2004. — V.13, N3.
— P.295-305.
16. Cryopreservation of human umbilical stem cells in combination with trehalose and reversible electroporation /
B. Dovgan, J. Dermol, A. Barlic, M. Knezevic, D. Miklavcic // 1st World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental Technologies (Portoroz, Slovenia, 06/09/2015). — Singapore: Springer, 2016. — P.307-310.
17. Safe and effective cryopreservation methods for long-term storage of human-amniotic-fluid-derived stem cells / A. Hennes, L. Gucciardo, S. Zia, F. Lesage, N. Lefevre, L. Lewi, A. Vorsselmans, T. Cos, R. Lories, J. Deprest, J. Toelen // Prenat. Diagn. — 2015. — V.35, N5. — P.456-462.
18. Defined serum- and xeno-free cryopreservation of mesenchymal stem cells / S.H. Al-Saqi, M. Saliem, H.C. Quezada, A. Ekblad, A.F. Jonasson, O. Hovatta, C. Götherström // Cell Tissue Banking. — 2015. — V.16, N2.
— P.181-193.
19. Efficient cryopreservation of human mesenchymal stem cells using silkworm hemolymph-derived proteins [Електронний ресурс] / S-M. Kim, C-K. Yun, J-H. Park, J.W. Hwang, Z-H. Kim, Y-S. Choi // J. Tissue Engin. Regener. Med. — 2016.
20. A cryopreservation system for direct clinical use of MSC / S. Thirumala, E. Fearnot, W.S. Goebel, E.J. Woods // Cytotherapy. — 2013. — V.15, N4. — P.46-47.
21. Thirumala S. Manufacturing and banking of mesenchymal stem cells. / S. Thirumala, W.S. Goebel, E.J. Woods // Expert Opin. Biol. Ther. — 2013. — V.13, N5. — P.673-691.
22. A new standardized clinical-grade protocol for banking human umbilical cord tissue cells / R. Fazzina, A. Mariotti, A. Procoli, D. Fioravanti, P. Iudicone, G. Scambia, L. Pierelli, G. Bonanno // Transfusion. — 2015. — V.55, N12.
— P.2864-2873.
23. Cryopreservation effects on Wharton's jelly stem cells proteome / F. di Giuseppe, L. Pierdomenico, E. Eleuterio, M. Sulpizio, P. Lanuti, A. Riviello, G. Bologna, M. Gesi, C. Di Ilio, S. Miscia, M. Marchisio, S. Angelucci / Stem Cell Rev.
— 2014. — V.10, N3. — P.429-446.
24. Post-cryopreservation viability of mesenchymal stem cells / A. van Campenhout, L. Swinnen, J. Klykens, T. Devos, G. Verhoef // Cytotherapy. — 2014. — V.16, N4. — P.83.
25. Effects of freeze-thawing and intravenous infusion on mesenchymal stromal cell gene expression / M.J. Hoogduijn, S.F. de Witte, F. Luk, M.C. vanden Hout-van Vroonhoven, L. Ignatowicz, R. Catar, T. Strini, S.S. Korevaar, W.F. van IJcken, M.G. Betjes, M. Franquesa // Stem Cells Dev. — 2016. — V.25, N8. — P.586-597.
26. Clinical mesenchymal stromal cell products undergo functional changes in response to freezing / K. Pollock, D. Sumstad, D. Kadidlo, D.H. McKenna, A. Hubel // Cytotherapy.
— 2015. — V.17, N1. — P.38-45.
27. Isolation of multipotent mesenchymal stroma cells from cryopreserved human umbilical cord tissue / Y.A. Romanov,
E.E. Balashova, N.E. Volgina, N.V. Kabaeva, T.N. Dugina, G.T. Sukhikh // Bull Experim. Biol. Med. — 2016. — V.160, N4. — P.530-534.
28. Serum- and xeno-free cryopreservation of human umbilical cord tissue as mesenchymal stromal cell source / T. Shimazu, Y. Mori, A. Takahashi, H. Tsunoda, A. Tojo, T. Nagamura-Inoue // Cytotherapy. — 2015. — V.17, N5. — P.593-600.
29. Effects of cryoprotectants on freezing, culture behaviour of buffalo umbilical cord matrix cells / P. Singh, M.K. Rose, P.S. Yadav, R. Sharma, J. Singh // J. Cell Tissue Res. — 2013.
— V.13, N2. — P.3625-3630.
30. Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord and adipose tissue retain their properties after 24 months of cryopreservation / C.Y. Wong, G.C. Ooi, W.P. Vivian Kong, M.F. Chai, K. Thiagarajah, K.Y. Then, S. Cheong // Cytotherapy. - 2015. - V.17, N6. - P.37-38.
References
1. Tsymbaluk VI. [Neurotransplantation as a model for the future of medicine: ethical issues]. Mystetstvo likuvannya. 2004;(1):6-11. Ukrainian.
2. Fagioli F, Ferrero I. Mesenchymal stem cell manufacturing for clinical use. In: Taner Demirer, ed. Progress in Stem Cell Transplantation. 2015. doi:10.5772/61370.
3. Vangsness CT, Sternberg H, Harris L. Umbilical cord tissue offers the greatest number of harvestable mesenchymal stem cells for research and clinical application: а literature review of different harvest sites. Arthroscopy: J Arthroscop Relat Surg. 2015;31(9):1836-43. doi:10.1016/j.arthro.2015.03.014. PMID:26354202.
4. Maslova O, Novak M, Kruzliak P. Umbilical cord tissue-derived cells as therapeutic agents. Stem Cells International. 2015;2015:1-10. doi:10.1155/2015/150609. PMID:26246808.
5. Balci D, Can A. The assessment of cryopreservation conditions for human umbilical cord stroma-derived mesenchymal stem cells towards a potential use for stem cell banking. Curr Stem Cell Res Ther. 2013;8(1):60-72. doi:10.2174/ 1574888x11308010008. PMID:23270628.
6. Asghar W, ElAssal R, Shafiee H, Anchan RM, Demirci U. Preserving human cells for regenerative, reproductive, and transfusion medicine. Biotechnol J. 2014;9(7):895-903. doi:10.1002/biot.201300074. PMID:24995723.
7. Mantri S, Kanungo S, Mohapatra PC. Cryoprotective effect of disaccharides on cord blood stem cells with minimal use of DMSO. Indian J Hematol Blood Transfus. 2015;31(2):206-12. doi:10.1007/s12288-014-0352-x. PMID:25825559.
8. Best BP. Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions. Rejuvenation Res. 2015;18(5):422-36. doi:10.1089/ rej.2014.1656. PMID:25826677.
9. Yong KW, WanSafwani WK, Xu F, WanAbas WA, Choi JR,
Pingguan-Murphy B. Cryopreservation of human mesenchymal stem cells for clinical applications: current methods and challenges. Biopreservation and biobanking. 2015;13(4):231-9. doi:10.1089/bio.2014.0104. PMID:26280501.
10. Almansoori KA, Prasad V, Forbes JF, Law GK, McGann LE, Elliott JA, Jomha NM. Cryoprotective agent toxicity interactions in human articular chondrocytes. Cryobiology. 2012;64(3):185-91. doi:10.1016/j.cryobiol.2012.01.006. PMID:22274740.
11. Schnitzler AC, Verma A, Kehoe DE, Jing D, Murrell JR, Der KA, Aysola M, Rapiejko PJ, Punreddy S, Rook MS. Bioprocessing of human mesenchymal stem/stromal cells for therapeutic use: current technologies and challenges. Biochemical Engineering Journal. 2016;108:3-13. doi:10.1016/j.bej.2015.08.014.
12. Chatzistamatiou TK, Papassavas AC, Michalopoulos E, Gamaloutsos C, Mallis P, Gontika I, Panagouli E, Koussoulakos SL, Stavropoulos-Giokas C. Optimizing isolation culture and freezing methods to preserve Wharton's jelly's mesenchymal stem cell (MSC) properties: an MSC banking protocol validation for the Hellenic Cord Blood Bank. Transfusion. 2014;54(12):3108-20. doi:10.1111/trf.12743. PMID:24894363.
13. Davies OG, Smith AJ, Cooper PR, Shelton RM, Scheven BA. The effects of cryopreservation on cells isolated from adipose, bone marrow and dental pulp tissues. Cryobiology. 2014;69(2):342-7. doi:10.1016/j.cryobiol.2014.08.003. PMID:25127874.
14. Naaldijk Y, Fedorova V, Stolzing A. Cryopreservation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in complex sugar based cryoprotective solutions. Journal of Biotechnology Letters. 2013;4(2):95-9.
15. Buchanan SS, Gross SA, Acker JP, Toner M, Carpenter JF, Pyatt DW. Cryopreservation of stem cells using trehalose: evaluation of the method using a human hematopoietic cell
line. Stem cells and development. 2004;13(3):295-305. doi:10.1089/154732804323099226. PMID:15186725.
16. Dovgan B, Dermol J, Barlic A, Knezevic M, Miklavcic D. Cryopreservation of Human Umbilical Stem Cells in Combination with Trehalose and Reversible Electroporation. 1st World Congress on Electroporation and Pulsed Electric Fields in Biology, Medicine and Food & Environmental Technologies 2016 (pp.307-310). Singapore: Springer. doi:10.1007/978-981-287-817-5_68.
17. Hennes A, Gucciardo L, Zia S, Lesage F, Lefèvre N, Lewi L, Vorsselmans A, Cos T, Lories R, Deprest J, Toelen J. Safe and effective cryopreservation methods for long-term storage of human-amniotic-fluid-derived stem cells. Prenatal diagnosis. 2015;35(5):456-62. doi:10.1002/pd.4556. PMID:25641322.
18. Al-Saqi SH, Saliem M, Quezada HC, Ekblad A, Jonasson AF, Hovatta O, Götherström C. Defined serum- and xeno-free cryopreservation of mesenchymal stem cells. Cell and tissue banking. 2015;16(2):181-93. doi:10.1007/s10561-014-9463-8. PMID:25117730.
19. Kim S-M, Yun C-K, Park J-H, Hwang JW, Kim Z-H, Choi YS. Efficient cryopreservation of human mesenchymal stem cells using silkworm hemolymph-derived proteins. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2016. doi:10.1002/term.2116.
20. Thirumala S, Fearnot E, Goebel WS, Woods EJ. A cryopreservation system for direct clinical use of MSC. Cytotherapy. 2013;15(4):46-7. doi:10.1016/ j.jcyt.2013.01.177.
21. Thirumala S, Goebel WS, Woods EJ. Manufacturing and banking of mesenchymal stem cells. Expert opinion on biological therapy. 2013;13(5):673-91. doi:10.1517/147125 98.2013.763925.
22. Fazzina R, Mariotti A, Procoli A, Fioravanti D, Iudicone P, Scambia G, Pierelli L, Bonanno G. A new standardized clinical grade protocol for banking human umbilical cord tissue cells. Transfusion. 2015;55(12):2864-73. doi:10.1111/trf.13277. PMID:26354088.
23. Di Giuseppe F1, Pierdomenico L, Eleuterio E, Sulpizio M, Lanuti P, Riviello A, Bologna G, Gesi M, Di Ilio C, Miscia S, Marchisio M, Angelucci S. Cryopreservation effects on Wharton's jelly stem cells proteome. Stem Cell Rev. 2014;10(3):429-46. doi:10.1007/s12015-014-9501-8. PMID:24619862.
24. Van Campenhout A, Swinnen L, Klykens J, Devos T, Verhoef G. Post-cryopreservation viability of mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 2014;16(4):S83. doi:10.1016/ j.jcyt.2014.01.301.
25. Hoogduijn MJ, deWitte SF, Luk F, vanden Hout-van Vroonhoven MC, Ignatowicz L, Catar R, Strini T, Korevaar SS, van IJcken WF, Betjes MG, Franquesa M. Effects of freeze-thawing and intravenous infusion on mesenchymal stromal cell gene expression. Stem Cells Dev. 2016;25(8):586-97. doi:10.1089/scd.2015.0329. PMID:26914168.
26. Pollock K, Sumstad D, Kadidlo D, McKenna DH, Hubel A. Clinical mesenchymal stromal cell products undergo functional changes in response to freezing. Cytotherapy. 2015;17(1):38-45. doi:10.1016/j.jcyt.2014.06.008. PMID:25457275.
27. Romanov YA, Balashova EE, Volgina NE, Kabaeva NV, Dugina TN, Sukhikh GT. Isolation of multipotent mesenchymal stroma cells from cryopreserved human umbilical cord tissue. Bull Exp Biol Med. 2016;160(4):530-4. doi:10.1007/s10517-016-3213-9. PMID:26902359.
28. Shimazu T, Mori Y, Takahashi A, Tsunoda H, Tojo A, Nagamura-Inoue T. Serum-and xeno-free cryopreservation of human umbilical cord tissue as mesenchymal stromal cell source. Cytotherapy. 2015;17(5):593-600. doi:10.1016/ j.jcyt.2015.03.604. PMID:25881518.
29. Singh P, Rose MK, Yadav PS, Sharma R, Singh J. Effects of cryoprotectants on freezing, culture behaviour of buffalo umbilical cord matrix cells. Journal of Cell and Tissue Research. 2013;13(2):3625-30.
30. Wong CY, Ooi GC, Vivian Kong WP, Chai MF, Thiagarajah K, Then KY, Cheong S. Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord and adipose tissue retain their properties after 24 months of cryopreservation. Cytotherapy. 2015;17(6):37-8. doi:10.1016/j.jcyt.2015.03.430.
Науковий редактор: M.I. ЛНсяний, д.мед.н., проф.
