CC BY
55
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬШ СТАТТ1
УДК 615.361.018
ФЕНОТИПОВА ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРИ КЛ1ТИН, ОДЕРЖАНИХ 13 КР1ОКОНСЕРВОВАНО1 ТКАНИНИ ХОР1ОНА
В. А. Шаблш1 2 11нститут молекулярно1 бюлоги i генетики НАН Украши, Кшв
М. Д. Кучма2
В. М. Кирик3 2ТОВ «1нститут клгтинно1 терапи»,
Л. Л. Лукаш1
Г. С. Лобтцева2 3ДУ «1нститут генетично1 та регенеративно! медицини НАМН Украши»
E-mail: lukash@imbg.org.ua
Отримано 07.07.2011
У робота показано можлив1сть отримання культур клгтин з кр1оконсервовано1 тканини хор1она з використанням 1,5 М ДМСО. Уперше описано особливоси формування культури клгтин кр1оконсер-вовано! тканини хор1она людини та 111мунофенотип. Встановлено характер експресй маркера CD90 в культурах клггин, одержаних з кр1оконсервовано1 тканини хор1она. Зниження р1вня експресй маркер1в CD90 та CD105 спостер1гаеться одночасно з падшням прол1феративно1 активност1 та набут-тям клгтинами багатоядерность Показано присутшсть популяцп ендотел1альних прогенгторних клгтин у культур! клгтин хор1она людини на першому пасажь Виявлено експрес1ю цитокератину в популящях клгтин, одержаних з нативного та кр1оконсервованого хор1она.
Ключовi слова: хор1он, кр1оконсервування, культура кл1тин, мультипотентш мезенх1мальш стромальш клгтини.
Упродовж останнгх рокгв плацента е об'ектом гнтенсивного вивчення як цгнне дже-рело стовбурових клгтин. З хоргона та амнгона було видглено мультипотентш мезенхгмальнг стромальнг клгтини (ММСК), якг зараз широко використовують у регенеративнш медицина Плацентарний комплекс мгстить також низку гнших мультипотентних клгтин (гемо-поетичних прогенгторних, епгтелгальних мультипотентних тощо), якг вже широко ви-пробовують у доклгнгчних дослгдженнях. Плацента вгдповгдае однгй з основних вимог до джерела стовбурових клгтин, забезпечую-чи можливгсть отримання велико1 кглькостг клгтин без гнвазивних втручань [1].
Розроблення технологи кргоконсерву-вання тканини плаценти дасть змогу оцгни-ти джерело мультипотентних клгтин на присутшсть мгкробно1 та вгрусно1 контамшаци i планувати процес одержання клгтинного препарату вгдповгдно до потреби у його ви-користаннг. Запропонований пгдхгд дасть можливгсть значною мгрою знизити витра-ти, пов'язанг гз застосуванням мультипотентних клгтин у клшгчнш практицг.
Технологгя низькотемпературного крго-консервування е одним з основних методгв, якг уможливлюють стандартизацгю технологи отримання клгтинного продукту вгдпо-вгдно до стандартгв GMP, GLP та GTP.
У багатьох роботах було показано мож-ливгсть видглення ММСК з хоргона людини (плодгв першого триместру ваггтностг). Цг клгти-ни експресували маркери плюрипотентностг г мали здатнгсть пгдтримувати гемопоез in vitro [2,3].
Однак, попри швидкг темпи розвитку дослгджень у зазначеному науковому на-прямг, ще й досг не розроблено методологгю видглення ММСК з кргоконсервовано1 тканини плаценти, не описано 1хш молекуляр-но-бюлоггчш властивостг, зокрема здатнгсть до мультилшшного диференцгювання. Не викликае сумнгвгв той факт, що пошук оп-тимальних умов кргоконсервування тканини плаценти та подальше отримання певних пулгв стовбурових клгтин е вкрай актуаль-ним завданням як для наукових цглей, так г для практичного застосування.
Метою цге1 роботи було встановити та поргвняти морфологгчнг й гмунофенотиповг
характеристики кл^ин in vitro, вид^еш з нативного та крюконсервованого хорюна людини.
Матерiали i методи
Метод крЬоконсервування тканини хорЬона
Для проведення дослщжень тканину хорюна було взято з абортивного матерiалу людини 5-12 тижшв гестацп, отриманого в результата добров^ьного переривання ва-гiтностi, за iнформованоi згоди жшок. Досль дження було схвалено Координацшною радою з трансплантацii оргашв, тканин та клiтин МОЗ Украши. Жiнок було обстежено на наявнють вiрусних та гемiчних iнфекцiй (антитала проти Threponemapallidum, HCV, HIV 1/2, HbsAg).
Тканину хорюна масою 1-3 г промивали в чашках Петрi дiаметром 90 мм розчином Хенкса з додаванням 50 од/мл амфотерици-ну («Синтез»), 100 од/мл пенщилшу («Арте-рiум»), 50 мкг/мл стрептомщину («Арте-рiум»). Тканину переносили в пробiрки об'емом 50 мл, додавали 2-3 мл розчину Хенкса та подрiбнювали за допомогою но-жиць на фрагменти не б^ьше 3 мм. Фраг-ментовану тканину переносили в крюампу-ли i додавали крюпротектори до кiнцевоi концентрацii: 1,5 М пропандюл, 1,5 М ДМСО, 0,7 М ДМСО.
Процес охолодження починали з 20 °С зi швидкютю 1 °С/хв до температури криста-лоутоворення, яка коливалася залежно вщ концентрацii крiопротектора вiд -4 до -6 °С. На такш температурi зразки витримували протягом 10 хв i проводили iнiцiацiю крис-талоутворення. Пiсля замерзання крюкон-тейнери охолоджували зi швидкiстю 0,3 °С/хв до -35 °С, потiм з 5 °С/хв до -50 °С та з 10 °С/ хв до -140 °С. За температури -140 °С процес оходження в заморожувачi зупиняли й переносили матерiал у рiдкий азот (-196 °С) на довгострокове зберiгання.
ГЬстологЬчний метод дослЬдження тканини плаценти
Фрагменти нативно'1 та крюконсервова-но'1 тканини фшсували забуференим 10% -м розчином параформу i заливали в парафiн за стандартним протоколом. Приготовлен зрь зи фарбували гематоксилшом та еозином.
Отримання мезенхЬмальних клЬтин з тканин крЬоконсервованого хорЬона
Крюконсервовану тканину розморожу-вали на водянш банi при температурi
38-40 °С до появи рщко! фази з подальшим вiдтаванням за шмнатно! температури. Ви-мивання ДМСО з тканини проводили, повально додаючи розчин Хенкса (Sigma). До тканини додавали розчин нагр^их до 37 °С ензимiв: 0,6 од/мл диспази (Gibco), 0,1% ко-лагенази (Serva) у спiввiдношеннi 1:2. 1нку-бували 10-20 хв при температурi 37 °С. Для зниження активностi ензимiв додавали фе-тальну сироватку телят (ФСТ) (Sigma) до кшцево! концентрацп 10%. Отриману сус-пензт клiтин пiпетували декiлька разiв i ф^ьтрували ïï через фiльтр iз дiаметром пор 100 мкм. Одержаний ф^ьтрат центри-фугували 5 хв при 300 g. Супернатант вщби-рали, а осад клiтин ресуспендували в фосфат -но-сольовому розчинi Дюльбеко (Gibco) шмнатно! температури. Життeздатнiсть клiтин визначали методом фарбування 0,4% -м розчином трипанового синього (Sigma), як вщсоток живих кл^ин на 200 тдра-хованих клгтин. Кiлькiсть клггин у суспен-зiï пiдраховували в камерi Горяева. Клiтини висiвали в культуральш флакони для ад-гезивних клгтин in vitro з розрахунку 300-400 тис. клгтин на 1 см2. Середовище для культивування DMEM мютило 15% ФСТ (Gibco), 5 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамшу (Biomedicals), 50 мкг/мл стрептомiцину, 100 од/мл пенщилшу.
Культивування проводили при 37 °Св ат-мосферi з 5% СО2 зi змiною середовища кожнi 3-4 доби. Пересiв здшснювали з до -сягненням культурою 80-90% конфлюенсу у спiввiдношеннi 1:3. Для перейву викорис-товували 0,05%-й розчин трипсину з ЕДТА (Biochrom).
I муноцитохЬмЬчне дослЬдження
Для проведення iмуноцитохiмiчного аналiзу клiтини висiвали в 4-лунковi план-шети з площею лунки 1,9 cм2 (Nunclon™A Surface), фшсували 10% -м розчином забу-ференого параформу. Ендогенну перокси-дазну активнють iнгiбували 0,3%-м розчином Н2О2 протягом 5 хв. Перед внесенням антитал фiксованi препарати обробляли 0,1%-м розчином тритона X-100. Для де-текцп маркерних протеïнiв використовува-ли антитала панцитокератину (Dako, Данiя). Вiзуалiзацiю iмунних комплексiв проводили iз застосуванням Mouse/Rabbit Poly Vue HPR/DAB Detection System (DBS, США).
Протокова цитофлуорометрЬя
Кл^ини зшмали з культурального пластику 0,05% -м розчином трипсину з ЕДТА. До суспензп кл^ин додавали FBS (Gibco) до
БЮTЕХНOЛOПЯ, Т. б, №2, 2012
кшцево! концентрацп 10% та центрифугу-вали при 250 g протягом 10 хв. 1мунофеноти-пування суспензп клГтин проводили методом протоково! цитофлуорометрп з використан-ням моноклональних антитiл, кон'югова-них Гз флуорохромами (Becton Dickinson, США) в робочш концентрацп 0,5 мкг на 10б клГтин: anti-CD34 APC, anti-CD90 FITC, anti-CD45 APC-Cy7, anti-CD105 PerCP-Cy 5.5, anti-CD73 PE, anti-CD14 Pacific Blue. Фенотипування здшснювали на лазерному протоковому цитофлуориметрГ-сортерГ BD FACSAria (Becton Dickinson, США) з прог -рамним забезпеченням FACS Diva 6.1, аналГзуючи одночасно 2 параметри свГтло-розсГювання та б параметрГв флуоресценцп. Для налаштування компенсацп перекриття спектрГв емюп флуорохромГв тд час багато-параметричного аналГзу використовували контрольш зразки клГтин без внесення ан -титГл (unstained control), зразки з кожним з антитГл окремо (single stained control) та зразки з комбшащею кГлькох антитГл без одного з них (fluorescence minus one control).
Статистична обробка даних
РГвень експресп поверхневих маркерГв вимГрювали у вГдсотках та статистично об-раховували з використанням U-критерГю Mаyна-Уïтнi.
Результати та обговорення
Порiвняльний гiстологiчний аналiз структури тканини хоршна, кршконсер-вованоХ за рiзних умов
Истолопчний анатз структури тканини хорюна до крюконсервування проводили на 39 зразках, Гз яких для 9 зразкГв аналГзува-ли структуру тканини тсля крюконсерву-вання за рГзних умов. Для крюконсервування хорюна було використано 0,7 M, 1,5 M ДMCO та 1,5 M 1,2-пропандюл. На рис. 1 (А, Б) наведено структуру нативно! тканини хорюна.
У ворсинках хорюна фшсували еттелГа-льний шар клГтин трофобласта та стромаль-ну тканину, пронизану великою шлькютю кровоносних судин. Скупчення еритроблас-тГв на рГзних стадГях диференщювання було вГдзначено як у судинах, так i в стромГ ворсинок. У деяких зонах мав мюце контакт еритробластГв з цитотрофобластом.
Истолопчним аналГзом тканини хорю-на, крюконсервованого з 0,7 M ДMCO, показано присутшсть велико! кГлькостГ ушко-джених еритробластГв у судинах (рис. 1, В) та стромальнш тканиш хорюна (рис. 1, Г). Також спостерГгали поодинокГ зони лГзису
строми ворсинок (рис. 1, Д). Однак, за пов^ьного вщмивання крiопротектора в деяких ворсинках залишалися iнтактнi ерит-робласти, що свiдчить про руйнування цих кл^ин при розморожуваннi (рис. 1, Е).
Зб^ьшення концентрацii ДМСО до 1,5 М сприяе збереженню еритробластiв у ворсинках хорюна 5-9 тижшв гестацп та еритро-цитiв у зразках 10-12 тижшв гестацп (рис. 1, в). Аналiз тканини, яку крюконсер-вували з 1,5 М 1,2-пропандюлу, також показав збереження еритробластав та еритроци-тiв вщповщно до строку гестацii (рис. 1, Ж). Однак слщ наголосити, що гютолопчний аналiз зразкiв крiоконсервованого хорюна не дозволяе детектувати накопиченi в про-цесi заморожування мiкроушкодження, що унеможливлюе встановлення вщмшнос-тей в ефективност збереження структури тка ни ни за екс пе ри мен таль них умов з ви ко -ристанням 1.5 М ДМСО та 1.5 М 1,2-про-пандюлу.
Б
. * »
- . V
•• «h.* • Y • ^
\ Г./,. J • « 9 • • • - . J c'
A • g» J>
Рис. 1. Miкpoстpyктypa нaтивнoï (А, Б) i кpioкoнсepвoвaнoï з 0,7 M ДМСО (В, Г, Д, G) та з 1,5 M ДМСО (G) i PrOH (Ж) тканини хopioнa:
А, Б, В, Г, G, Ж — тканина хорюна плода 10-го тижня гестацп; Д,Е — тканина хорюна плода 12-го тижня гестацп.
СтрГлками позначено ядра ушкоджених еритробластГв. Забарвлення гематоксилш-еозином. x400
ВидЬлення клЬтин з тканин нативного та крЬоконсервованого хорЬона
Нами було пвдбрано опгимальш умови iзолювання клггин з тканини хорюна, заморожено'! тд захисгом 1,5 М ДМСО. У разi об-роблен ня тка ни ни ен зи ма ми от ри му ва ли суспензт клiгин, жиггeздагнiсгь яких пiд час фарбування грипановим сишм колива-лась у межах 42-90% (п=5).
Шсля висiву клiгин з нагивно' га крю -консервовано' плаценги на 5-ту й 9-10-гу доби кульгивування, вщповщно, виросгали клони клiгин, ям за своею морфологieю були схожi на колонii грофобласгних сговбу-рових клiгин [4, 5]. У процей подальшого кульгивування навколо клошв спосгерiгали мiграцiю i рiсг фiбробластоподiбних га епiгелiальних клiгин (рис. 2, А, В). У разi перейву кульгури клiгин клональний рiсг не вщбувався.
V '
V*
■ «К. ВШ
Рис. 2. Куль тури кл^ин, отриманi з нативно'1 (А, Б) та з кршконсервовано! (В, Г) тканини хоршна з 1,5 М ДМСО:
А — 5-га доба росгу; В — 9-га доба росгу; Б — 11-га доба росгу; Г — 14-га доба росгу. Сгр1лками позначено колони кл1гин хор1она. Св1глова м1кроскоп1я. х50
Угворення моношару клггин, огриманих з нагивно' гканини, досягалось у середньо-му на 6-гу добу, для кршконсервовано'! гканини — в середньому на 23-гю добу. Шд час подальшого кульгивування швидкюгь фор-мування конфлюенсу клiгинами, що огри-маш з нагивно' га крiоконсервованноi гканини хорюна, не вiдрiзнялася. Загримка росгу в первиннш кульгурi кл^ин з крю-консервовано' гканини хорюна, можливо, пов'язана з б^ьшою шлькюгю клiгин, що з часом вщкршлялися вiд пласгику, змен-шуючи шДльнюгь прикрiплених клiгин.
У кульгурi б^ьшюгь клiгин з нагивно' га крюконсервовано' гканини на перших па-
сажах були сильно розпласгаш, мал и чис-леннi виросги, гимчасом як iншi харакгери-зувалися вигягнугою верегеноподiбною формою (рис. 2, Б). У кл^инах спосгер^али наявнiсгь 1 ядра з 1-4 ядерцями.
На 5-8-му пасажах у культурi вщбувало-ся зниження пролiферативноi акгивносгi клiгин, збiльшення 'хшх розмiрiв, з'явля-лися багагоядернi кл^ини з великими вiдросгками (рис. 3).
Рис. 3. Культура кл^ин, отриманих iз крiоконсервованоi тканини хорiона з 1,5 М ДМСО, 5-й пасаж.
Свгглова мшроскошя. х 100
Iмунофенотиповий та ЬмуноцитохЬ-м1чний аналЬз клЬтин, видЬлених з натив-ноЧ та крЬоконсервованог тканини хорЬона
Шд час iмунофенотипування популяцп клггин, огриманих з нагивного хорюна, з викорисганням прогоково' цигофлуоромег-рп було виявлено високий рiвень експресп маркерiв CD90, CD73, CD105 га вiдсугнiсгь експресп CD45, СD34, CD14 (рис. 4).
Кульгура фiбробластоподiбних клiгин крiоконсервованого хорiона гакож мала iмуно-феногип CD90+CD73+CD105+CD45-CD34-CD14-(рис. 5).
У деяких клггинах, одержаних iз крю-консервованного хорiона, спосгерiгали дво-модальний розподьл клiгин за маркером CD90 (рис. 6).
Кульгури клiгин з двомодальним роз-подiлом клiгин за маркером CD90 зберiгали гакий харакгер експресп прогягом чогирьох пасажiв (рис. 8). Слщ вiдзначиги, що в куль-гур з двомодальним розпод^ом вiдбуваегься досговiрне зросгання популяцп клггин CD90-(рис. 7, 8) з 2-го по 4-й пасаж, хоча в деяких iз них спосгерпали сгаб^ьну експресiю цьо-го маркера на рiвнi 75%.
У деяких клггинних популяцiях з одно-модальним розпод^ом клiгин за маркером CD90 гакож вiдбуваегься зниження експресп цього маркера пiд час пасажування (рис. 7, 8).
3*:
о
МП1| гПТШр 10' 10д ш* СОЭО Р1ТС-А
Ч
| ||>м||||||—I I 111'1|||
111|'РЧ1|
ю* ю° ю" СЭ105 РегСР-Су5-5-А
„■рПНПрЯИ^^^^Н!^ Г I |/|щ| .........
0 102 10° 10* 10г СР34 АРС-А
Щ I I 1ММ1|—I I 1111и|—г 10' 103 10* 10® С045АРС-Су7-А
тгЧ™Ьтт(—г I пш|
10' 10° 10* 103 СР14 0АР1-А
Б
5 2"
О
< э-
О Э4«в
: '45+34-
СР45+34+
С045-34+
I I I I I I ||||||| I 1ПМЦ I ПИЩ I
304 0 ,0* 10*
С034 АРС-А
О,
о
С090+73+105+45-34-14-
I | | | ......... I пщц | нищ
■304
10 10 СЭ34 АРС-А
Ю
Рис. 4. Пстограми експресп поверхневих маркерiв у культурi клiтин, отриманiй з нативно'1 тканини хорiона (2-й пасаж):
А — рiвнi експреси CD90, CD73, CD105, CD34, CD45, CD14 (ирий контур — фоновий рiвень флуоресценцп); Б — двовимiрнi гiстограми популяцш клiтин з фенотипом CD90+CD73+CD105+CD34~CD45~CD14-
о < 2-
А
С045+34- :С045+34+
:.С045-34+
М ' 1
■304
С090+73+106+45-34-14-
10 10 СР34 АРС-А
Б
ТШ]—ГПТГЦ—ГТППЦ-
Ю3 10* 10* Сй34 АРС-А
Рис. 5. Гiстограми експресп поверхневих маркерiв у популяцiях клiтин, видшених iз тканини кршконсер-вованого хоршна: показано популяцп клiтин CD34-CD45- (а) та CD90+CD73+CD105+CD34"CD45"CD14- (Б)
Цей факт було описано також багатьма дослщниками [6-8], як1 вивчали культуру кл1тин ММСК, отриману з нативно! тканини плаценти людини.
Сл1д в1дзначити достов1рно меншу експрейю СБ90 в культур! кл1тин крюкон-сервованого хор1она з двомодальним роз-под1лом пор1вняно з кл1тинами, одержани-
ми з нативного хорюна на 2- та 4-му паса-жах. Под1бну в1дм1нн1сть спостер1гали 1 за пор1вняння з кл1тинами з одномодальним розпод1лом СБ90 (отриманими з крюкокон-сервовано! тканини) на 2-му пасаж1, хоча з пасажуванням ця р1зниця зникала внасль док зниження р1вня експресп кл1тинами цьо го мар ке ра (рис. 7).
Г
Б
У^иЦ 'I А'
В
рАшЛ
Е
СР105 РегСР-Су5-5-А
Ч I и|||||
05 РегСР-Су5-5-А
Рис. 6. Пстограми експреси поверхневих маркерiв СБ90, СБ73, СБ105 на клiтинах, отриманих з кршконсервовано! тканини хорiона, 2-й пасаж: експремя маркерiв СБ73 (Б) та СБ105 (В) за одномо-дального розподiлу популяцiй клiтин за маркером СБ90 (А); експремя маркерiв СБ73 (Д) та СБ105 (Е) за двомодального розподшу популяцiй клiтин за маркером СБ90 (Г).
Синiй колiр — уи клiтини; зелений колiр — популящя СD 90-; червоний — CD 90+; сiрий контур — фоно-вий рiвень флуоресценцп
Отже, можна стверджувати, що кл1тини з одномодальним розпод1лом за маркером СБ90, одержат з нативно! та крюконсерво-вано! тканини хор1она, не в1др1знялися за характером експреси цього поверхневого маркера на р1зних пасажах.
Частота отримання культур кл1тин з дво-модальним розпод1лом кл1тин за маркером СБ90 з крюконсервованно! тканини стано-вила 50% (п = 6). Однак вщсутшсть серед культур кл1тин нативно! тканини хор1она такого двомодального розпод1лу кл1тин за маркером СБ90, можливо, пов'язана з по-р1вняно невеликою к1льк1стю (п = 3) про-анал1зованих культур кл1тин. Таким чином, вплив крюконсервування тканини хор1она на особливост експреси СБ90 потребуе по-дальших досл1джень.
Зважаючи на дискретний характер роз-под1лу кл1тин за експрейею маркера СБ90 та зростання популяци СБ90- п1д час паса-жування культури кл1тин, можна припусти-ти наявн1сть р1зних попередник1в СБ90+ та СБ90- кл1тин.
Так, вщомо, що з пуповинно! кров1 було вид1лено клони ММСК, як1 в1др1знялися за морфолог1ею, 1мунофенотипом та здатшстю до диференц1ювання. Кл1тини, що мал и ве-ретенопод1бну морфолог1ю, були позитивни-ми за СБ24, СБ49, 8Н2, 8Н3, 8Н4 та СБ90, тод1 як кл1тини б1льш розпластан1 та округ-л1 в1др1знялися в1дсутн1стю маркера СБ90 [9]. Також потр1бно вщзначити присутн1сть
Рис. 7. Рiвень експреси маркера СБ90 в популяци клiтин хорiона:
1 — популяцiя клiтин нативного хорiона 2-го па-
сажу;
2 — популящя клггин крюконсервованого хорю-
на 2-го пасажу з одномодальним характером розподшу рiвня експреси;
3 — популящя клггин крюконсервованого хорю-
на 2-го пасажу з двомодальним характером розподiлу рiвня експреси;
4 — популяцiя кл^ин нативного хорiона 4-го па-
са жу;
5 — популящя кл^ин крiоконсервованого
хорюна 4-го пасажу з одномодальним характером розподшу рiвня експреси;
6 — популящя кл^ин крiоконсервованого
хорюна 4-го пасажу з двомодальним характером розподшу рiвня експреси при п =3, Р = 0,05
10* 10" 10' CD90 FITC-A
2-й пасаж
ю ю ю to CD90 FITC-A
3-й пасаж
mnq Г
10* ю' ю* ю5 CD90 FITC-A
4-й пасаж
ю'
CD90 FITC-A 2-й пасаж
ю" ю* CD90 FITC-A
3-й пасаж
ю ю CD90 FITC-A
4-й пасаж
Рис. 8. Псгограми експресй поверхневого маркера CD90 в популящях клггин, отриманих з кршконсервовано! тканини хоршна:
верхнш ряд — популящя з одномодальним розподГлом за CD90; нижнш ряд — популящя з двомодальним розподiлом; сiрий контур — фоновий piBeHb флюоресценцп
двох популяцш ф1бробласт1в, отриманих з легешв мишей; кл1тини CD90+ мали верете-нопод1бну форму, а CD90- — були плоск1 та округл1 [10]. У деяких роботах показано вщсутшсть маркера CD90 на ММСК, одержаних з амнютично! оболонки [11].
Зниження експресй CD90 в культурах мезенх1мальних кл1тин з амнюна та хорюна людини корелювало з1 зменшенням Гмуно-супресивно! дГ! на л1мфоцити периферично! кров1 за !х сшвкультивування [6]. Також було встановлено, що п1сля сепарування ММСК плаценти з експрейею маркера CD349 (ре -цептор Wnt-лiгандiв) спостер1галося пщви-щення рiвня CD90 [8].
У культурах клГтин нативно! та крюкон-сервовано! культури з одно- i двомодальним розподГлом за маркером CD90 вщсутня вiдмiннiсть в експресii поверхневих мар-керiв CD73 та CD105 на 4-му пасажi (рис. 9).
Зростання шлькоста клiтин з низьким рiвнем експресГ! маркерiв CD90 та CD105 iз пасажуванням культури спостерiгалось од-ночасно зi зниженням пролiферативноi активности збiльшенням розмiрiв, появою ба-гатоядерностi i кiлькостi виростiв клГтин.
1мунофенотипування популяцiй клiтин нативного та крюконсервованого хорiона на
1-му пасажi шляхом протоково! цитофлуо-рометрii показало присутшсть мшорно! по-пуляцii ендотелiальних прогенiторних клi-тин (рис. 10).
Iмуноцитохiмiчним аналiзом культур клГтин нами було виявлено експрейю цитоке-ратинiв (рис. 11). Слщ зазначити, що панци-токератинпозитивнi ММСК було отримано з пуповини [12], на вщмшу вщ ММСК пуповин-но! кровi [13], однак у деяких роботах описано присутшсть цитокератишв 8 та 18 у культурi адгезивних клiтин пуповинно! кровi, що по-ряд iз вiдсутнiстю CD50, CD62L, CD 106 дае пiдставу авторам вiдокремити !х вщ ММСК та вiднести до особливого типу [14].
У робота Koskull et al. (2005) було показано, що шд час культивування мезенхiмальнi клiтини фетального хорiона, шшри та легень експресують цитокератини 8, 18 та 19, на вщмшу вщ фiбробластiв шкiри дiтей та дорос-лих [15]. Поодинокi МСК шсткового мозку в культурi експресують цитокератини 18 та 19, ям утворюють промiжнi фiламенти [16].
Високий рiвень експресГ! цитокератинiв клiтинами, що були видГлеш з хорiона та зрГло! плаценти, можливо, свГдчить про особливГсть плацентарних стромальних клГтин у культурГ клГтин in vitro.
А
102,5 100,0
# 97,5 I 95,0
л 92,5 £
90,0 87,5 85,0
Б
I
1
2
3
100
а
К
1
2
3
Рис. 9. Рiвень експресп поверхневих мaркерiв у популящях клiтин хорiона: А — СБ73, Б — СБ105:
1 — популяцiя клiтин нативного хорюна 4-го пасажу; 2 — популящя клiтин крiоконсервованого хорiона 4-го пасажу з одномодальним характером розподглу рiвня експресп; 3 — популящя клггин крюконсерво-ваного хорiона 4-го пасажу з двомодальним характером розпод^у рiвня експресп (п = 3, Р = 0,05)
А
Б
CD90+CD73+CD105+CD45-CD34-CD14-67%
CD 90+CD73+CD45-CD34+ — 4.4%
В
Г
CD 90+CD73+CD105+CD45-CD34-CD14- 34%
CD 90+CD73+CD45-CD34+ — 7.7%
Рис. 10. Пстограми експресп поверхневих маркерiв СБ90, СБ73, СБ105, СБ34, СБ45, СБ14 у популящях клггин (1-й пасаж), отриманих з нативно'1 (А, Б) та крюконсервовано' (В, Г) тканин хорюна:
А, В — популящя кл^ин з фенотипом МСК;
Б, Г — популящя кл^ин з фенотипом ендотелiальних прогешторних клггин
Рис. 11. Клттини, отриманi з нативно'1 (А) та крюконсервовано'1 (Б) тканини хорiона (4-й пасаж):
iмуноцитохiмiчне забарвлення на панцитокера-тин.х400
Присутн1сть ф1бробластопод1бних кль тин з вищеописаним 1мунофенотипом у попу лящях кл1тин крюконсервованого хорюна вщповщае мультипотентним мезенх1маль-ним стромальним кл1тинам, оск1льки вм1ст кл1тин з експрес1ею СБ90+, СБ73+, СБ105+ перевищуе 95% [17].
Отже, нами було шд1брано умови крю-консервування тканини хорюна, видшення та культивування мезенх1мальних стромаль-них кл1тин хор1она (5-12 тижшв гестацп). Виявлено деяш ушкодження тканини хо-р1она за р1зних режим1в кр1оконсервування
i показано особливост росту клГтин крюконсервованого хорюна in vitro. У перше було описано iмунофенотип популяци клГтин строми крюконсервованого хорюна.
Таким чином, порiвняльний пстолопч-ний аналiз тканини хорюна до та тсля крю-консервування з крiопротекторами показав, що тд захистом 1,5 М розчину ДМСО i 1,5 М розчину 1,2-пропандюлу збериаються ерит-робласти (у тканиш 5-9 тижнiв гестаци) та еритроцити (у тканиш 10-12 тижшв гестаци) у судинах та стромальнш тканинi. Це може свщчити про 6Гльшу ефективнiсть зас-тосування цих крiопротекторiв у зазначених концентращях, на вГдмГну вГд застосування стандартного 0,7 М розчину ДМСО.
Крюконсервування тканини з викорис-танням 1,5 М ДМСО дае змогу отримати культуру клГтин, що за сво''м Гмунофеноти-пом вiдповiдае ММСК. Культури клГтин нативного та крГоконсервованого хорюна з одномодальним розподГлом за експресГею
Л1ТЕРАТУРА
1. Mihu C. M., Mihu D., Costin N., Ciuca D. R. et al. Isolation and characterization of stem cells from the placenta and the umbilical cord // Rom. J. Morphol. Embryol. — 2008. — V. 49, N 4. — P. 441-446.
2. Parolini O., Alviano F., Bagnara G. P. et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells // Stem Cells. — 2008. — V. 26. — P. 300-311.
3. Robin C., Bollerot K., Mendes S. et al. Human placenta is a potent hematopoietic niche containing hematopoietic stem and progenitor cells throughout development // Cell Stem Cell. — 2009. — V. 5. — P. 385-395.
4. Spitalieri P., Cortese G., Pietropolli A et al. Identification of Multipotent Cytotrophoblast Cells from Human First Trimester Chorionic Villi // Cloning and stem cells. — 2009. — V. 11, N 4. — P. 535 — 556.
5. Lee et al. Differentiation of human tro-phoblast stem cells in mammalian straitum // Pat. N 7, 892, 534B2. — 2011.
6. Campioni D., Rizzo R., Stignani M. et al. Decreased Positivity for CD90 on Human Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) Is Associated with a Loss of Immunosuppressive Activity by MSCs // Clin. Cyt. — 2009. — V. 76B. — P. 225-230.
7. Hiwase S. D., Dysona P. G., TO L. B., Lewis I. D. Cotransplantation of Placental Mesenchymal Stromal Cells Enhances Single and Double
CD90 не вщрГзняються. Встановлено досто-вГрну рГзницю в рГвн експреси маркера CD90 в популящях клГтин нативного та крГоконсервованого хорюна з двомодальним розподГлом CD90 на 2- та 4-му пасажах, шших основних поверхневих маркерГв ММСК на 2- та 4-му пасажах.
Також показано значно меншу шлькють CD90+-клiтин на 2-му пасажГ в популящях з двомодальним розподГлом порГвняно з по-пулящями, що мають одномодальний роз-подГл, хоча з пасажуванням цей ефект зни-кае внаслГдок зниження рГвня експреси клГтинами цього маркера в популящях клГтин з одномодальним розподГлом. Зниження рГвня експреси маркерГв CD90 та CD105 спостериаеться одночасно з падшням пролГферативно'' активностГ та набуттям клГтинами багатоядерность Виявлено експре-сГю цитокератину в популящях клГтин, одер-жаних з нативного та крГоконсервованого хорюна. Походження таких популяцш клГтин потребуе бГльш детальних дослщжень.
Cord Blood Engraftment in Nonobese Diabetic / Severe Combined Immune Deficient Mice // STEM CELLS. — 2009. — V. 27. — P. 2293-2300.
8. Tran T. C., Kimura K., Nagano M. et al. Identification of Human Placenta-Derived Mesenchymal Stem Cells Involved in Re-Endothelialization // J. Cell. Physiol. —
2010. — V. 226. — P. 224-235.
9. Chang Y.-J., Tseng C.-P., Hsu L.-F. et al. Characterization of two populations of mes-enchymal progenitor cells in umbilical cord blood // Cell Biol. Intern. — 2006. — V. 30. — P.495-499.
10. Phipps R. P., Penney D. P., Keng P. et al. Characterization of two major populations of lung fibroblasts: distinguishing morphology and discordant display of Thy 1 and class II MHC // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. — 1989. — V. 1. — P. 65-74.
11. Hwang J. H., Shim S. S., Seok O. S. et al. Comparison of Cytokine Expression in Me -senchymal Stem Cells from Human Placenta, Cord Blood, and Bone Marrow // J. Korean. Med. Sci. — 2009. — V. 24. — P. 547-554.
12. Farias V. A., Linares-Fernandez J. L., Penalver J. L. et al. Human umbilical cord stromal stem cell express CD10 and exert contractile properties // Placenta. —
2011. — V. 32. — P. 86-95.
13. Sueblinvong V., Loi R., Eisenhauer P. L. et al. Derivation of Lung Epithelium from Human Cord Blood-derived Mesenchymal Stem Cells // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. — 2008. — V. 177. — P. 701-711.
14. Kogler G., Sensken S, Airey J. A. et al. A New Human Somatic Stem Cell from Placental Cord Blood with Intrinsic Pluripotent Differentiation Potential // J. Exp. Med. — 2004. — V. 200, N 2. — P. 123-135.
15. Koskull H. V., Virtanen I. Induction of cyto-keratin expression in human mesenchymal cells // J. Cell. Physiol. — 2005. — V. 133, N 2. — P. 321-329.
16. Wuchter P., Boda-Heggemann J., Straub B. K. et al. Processus and recessus adhaerentes:
giant adherens cell junction systems connect and attract human mesenchymal stem cells // Cell Tissue Res. — 2007. — V. 328. — P. 499-514.
17. Dominic M., Blanc K. Le, Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy. — 2006. — V. 8, N 4.— P. 315-317.
ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ ТКАНИ ХО РИ О НА
В. А. Шаблий1 2 М. Д. Кучма2 В. М. Кирик3 Л. Л. Лукаш1 Г. С. Лобинцева2
1Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев 2ООО «Институт клеточной терапии», 3ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины»
В работе показана возможность получения куль ту ры кле ток из кри о кон сер ви ро ва нной ткани хориона с использованием 1,5 М ДМСО. Впервые описаны особенности формирования культуры клеток хориона человека и ее имму-нофенотип. Установлен характер экспрессии маркера CD90 в культурах клеток, полученных из кри о кон сер ви ро ван ной тка ни хо ри о на. Снижение уровня экспрессии CD90 и CD105 наблюдается одновременно с приобретением клетками многоядерности. Показано присутствие по пу ля ции эн до те ли аль ных про ге ни тор -ных кле ток в куль ту ре кле ток хо ри о на че ло ве -ка на первом пассаже. Обнаружена экспрессия цитокератина в популяциях клеток, полученных из нативного и криоконсервированого хо ри о на.
Ключевые слова: хорион, криоконсервирова-ние, куль ту ра кле ток, муль ти по те нт ные ме -зен хи маль ные стро маль ные клет ки.
THE PHENOTIPIC CHARACTERIZATION OF CELL CULTURE DERIVED FROM CRYOPRESERVED CHORIONIC TISSUE
V.A. Shablii1 2 M. D. Kuchma2 V. M. Kyryk3 L. L. Lukash1 G. S. Lobintseva2
institute of molecular biology and genetics of National Academy of Science of Ukraine,
2LLC Institute of Cell Therapy, 3State institute of genetics and regenerative medicine Academy of Medicine of Ukraine
It was shown possibility of cell culture obtaining from cryopreserved chorion tissue using 1.5 M DMSO. For the first time we described features of the cell culture formation from cryopreserved human chorion and its immunophenotype. We described the character of CD90 marker expression in cultures of the cells derived from cryopreserved chorion tissue. Decreasing of expression of the markers CD90 and CD105 was observed together with drop in proliferative activity and acquisition of multi -nuclearity for the cells. The population of endothelial progenitor cells in cell culture was detected on the first passage. Expression of cytokeratins was found in populations of the cells derived from native and cryopreserved chorion tissue.
Key worlds: chorion, cryopreservation, cell culture, multipotent mesenchymal stromal cells.
