CC BY
130
УДК: 577.352.4: 612.111: 547.42
СВОЙСТВА ЭРИТРОЦИТОВ, ЗАМОРОЖЕННЫХ В КОМБИНИРОВАННОЙ СРЕДЕ С ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ И ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДОМ
В. В. Рамазанов
Т. И. Дейнеко Институт проблем криобиологии и криомедицины
Е. Л. Воловельская НАН Украины, Харьков
В. А. Коптелов В. А. Бондаренко
Е-mail: [email protected]
Получено 27.05.2011
Исследовали осмотические, антиоксидантные и морфологические характеристики эритроцитов, замороженных в жидком азоте (-196 °С) в среде, содержащей полиэтиленгликоль-1500, или в комбинированной среде с полиэтиленгликолем-1500 и диметилсульфоксидом. При замораживании в среде, содержащей полиэтиленгликоль-1500, отмечается значительная степень повреждения эритроцитов (55-60%), потеря клетками глутатиона при отмывании криоконсерванта и повышение проницаемости оставшейся части клеток для ионов Н+. В то же время не выявлено существенного увеличения концентрации малонового диальдегида и значительного изменения показателей активности глутатионзависимых энзимов (глутатионредуктазы и глутатионпероксидазы) при замораживании в двух указанных средах. При дополнительном включении в среду диметилсульфоксида степень повреждения эритроцитов во время замораживания снижается (7-9%) с сохранением осмотических, ан ти ок си да нт ных и мор фо ло ги чес ких свойств ос тав шей ся час ти кле ток пос ле от мы ва ния кри о кон -сер ван та. По лу чен ные ре зуль та ты поз во ля ют пред по ло жить, что сох ра не ние ос мо ти чес ких и мор фо -логических свойств эритроцитов, замороженных в комбинированной среде с полиэтиленглико-лем1500 и диметилсульфоксидом, обеспечивается проникновением последнего в клетки и ослаблением гипертонического стресса, обусловленного концентрированием NaCl и ПЭГ-1500 при за мо ра жи ва нии.
Ключевые слова: эритроциты, осмотические, антиоксидантные и морфологические свойства, замораживание, комбинированный криоконсервант.
Окисление гемоглобина в метгемоглобин происходит с образованием супероксидного радикала при последующей его нейтрализации супероксиддисмутазой с образованием пероксида водорода, утилизация которого осуществляется каталазой и глутатионпе-роксидазой [1]. Недостаток глутатиона в эритроцитах приводит к снижению активности глутатионпероксидазы, повышению концентрации пероксида водорода, образованию гид ро пе рок си дов жир ных кис лот и по -вреждению мембран [1, 2]. Некоторые исследователи предполагают, что рост осмо-ти чес кой хруп кос ти эрит ро ци тов пос ле замораживания и хранения при -80 °С опре-де ля ет ся ин дук ци ей пе рок сид но го окис ле -ния липидов (ПОЛ) мембран вследствие окисления гемоглобина в метгемоглобин [3]. При этом с увеличением срока хранения образцов от 1 до 6 мес отмечается корреляция
между ростом концентрации малонового диальдегида (МДА) и повышением осмотической хрупкости эритроцитов [3].
Эритроциты, замороженные в среде без кри оп ро тек то ра, в зна чи тель ной сте пе ни повреждены, а оставшаяся часть клеток (1-2%) морфологически представлена сфе-роцитами и сфероэхиноцитами с миелино-по доб ны ми струк ту ра ми, от ко то рых от де -ляются везикулы. Включение в среду за мо ра жи ва ния декстра на обес пе чи ва ет предотвращение везикуляции и заметного ге мо ли за эрит ро ци тов, при этом ос тав ши е ся клет ки мор фо ло ги чес ки предс тав ле ны в ос -нов ном дис ко ци та ми с не вы со ким со дер жа -ни ем эхи но ци тов [4]. Од на ко та кие мор фо -ло ги чес кие по ка за те ли ха рак тер ны для клеток, которые не отмывались от декстрана после замораживания. Эритроциты, замороженные в среде с декстраном (30%) или гли-
церолом (35%) и отмытые от криоконсерванта изотоническим раствором ЫаС1 (0,9%), являются осмотически хрупкими по сравнению с интактными клетками [4]. Использование глицерола в высокой концентра ции тре бу ет спе ци аль ных под хо дов для его от мы ва ния с ис поль зо ва ни ем ря да ги -пертонических растворов с целью сохранения ос мо ти чес ких свойств эрит ро ци тов [5].
Криоконсервирование эритроцитов с поли мер ны ми неп ро ни ка ю щи ми кри опро тек -то ра ми мо жет иск лю чать про це ду ру их от -мывания, однако после трансфузии клеток с такими криопротекторами выявляются лейкоцитоз, повышение концентрации гемоглобина и билирубина в плазме, а также отмечается задержка выведения криопротек то ров из ор га низ ма [6]. Для уст ра не ния та ких проб лем не обхо ди мо сни зить кон це -нтрацию полимерных криопротекторов или отмывать их перед трансфузией [7]. Однако эрит ро ци ты, за мо ро жен ные с по ли мер ны ми кри оп ро тек то ра ми, ос мо ти чес ки не ус той чи -вы [4, 6].
В связи с вышеизложенным возникает задача разработки криоконсервантов, которые будут не только обеспечивать сохранение осмотических свойств эритроцитов при замораживании, но и упрощать их отмывание от криоконсерванта после размораживания.
Из ве стно, что ес ли сре да, в ко то рой на хо -дят ся эрит ро ци ты, со дер жит не бо лее 6% глицерола, то последующее перенесение клеток в изотонический раствор ЫаС1 не вызывает нарушения осмотической устойчи-вос ти кле ток [8]. Эти дан ные ука зы ва ют на то, что кри о кон сер вант дол жен со дер жать не вы со кую кон це нт ра цию про ни ка ю ще го кри оп ро тек то ра, для то го что бы при от мы -вании эритроцитов изотоническим раствором ЫаС1 получить осмотически нормальные клет ки. Для ди ме тил суль фок си да (ДМСО) и 1,2-пропандиола (1,2-ПД) такая концентрация может быть выше, поскольку их про-ни ца е мость для мемб ран эрит ро ци тов на порядок выше, чем у глицерола [9]. Использование комбинированного криоконсерванта, со дер жа ще го по ли ви нил пир ро ли дон (15%) и ДМСО (25%), позволяет упростить спо соб от мы ва ния эрит ро ци тов пос ле за мо -ра жи ва ния и от мы вать их толь ко дву мя циклами вместо четырех, используемых после замораживания-оттаивания эритроцитов в среде с глицеролом [10].
Установлено, что сочетание в криоконсерванте декстрана или ПЭГ-1500 с ДМСО (15%) приводит к устранению так называемого эффекта «упаковки» [11] — проявле-
ния большей степени повреждения эритроцитов при замораживании-оттаивании с высоким гематокритом по сравнению с низким [12]. При быстром замораживании-оттаивании эффект «упаковки» определяется в основном приростом постгипертонического стресса на клетки при размораживании [13]. В связи с этим устранение эффекта «упаковки» служит показателем ослабления действия пост ги пер то ни чес ко го стрес са и, сле до ва -тель но, раз мо ро жен ные эрит ро ци ты мо гут быть бо лее ос мо ти чес ки ус той чи вы ми при про це ду ре от мы ва ния кри о кон сер ван та, что даст возможность упростить способ их отмывания, исключив гипертонические растворы. Степень постгипертонического повреждения эритроцитов существенно зависит от температуры среды для ресуспендирования: при 35-37 °С клетки проявляют наибольшую ус той чи вость к дан но му пов реж да ю ще -му фактору [14].
Таким образом, для отмывания эритроцитов после размораживания одним изотоническим раствором NaCl без использования ги пер то ни чес ких раст во ров кри о кон сер вант дол жен со дер жать не вы со кие кон це нт ра ции про ни ка ю щих кри оп ро тек то ров. При этом от мы ва ние не об хо ди мо про из во дить при 35-37 °С, а защитная среда должна устранять один из ос нов ных фак то ров пов реж де ния эритроцитов при замораживании с высоким гематокритом — эффект «упаковки», с тем чтобы ослабить повреждающее действие постгипертонического стресса при размора-жи ва нии.
Цель работы — определить осмотические, антиоксидантные и морфологические свой ства эрит ро ци тов, от мы тых изо то ни чес -ким раствором NaCl после замораживания в комбинированной среде с ПЭГ-1500 и ДМСО.
Материалы и методы
В работе использовали NaCl (х. ч.), поли-э ти ле нг ли коль с мо ле ку ляр ной мас сой 1500 (ПЭГ-1500) производства Merck (Германия), диметилсульфоксид (ДМСО) производства Sigma (США). Среды замораживания гото-ви ли на изо то ни чес ком раст во ре NaCl (0,9 %). Криоконсерванты содержали ПЭГ-1500 (20%) или ПЭГ-1500 (20%) в комбинации с ДМсО (15%).
Эритроциты человека получали из крови 2-й группы от доноров мужского пола после четырехкратного отмывания их изотоническим раст во ром NaCl. Ме тал ли чес кие кон тей -неры объемом 10 мл с образцами эритроцитов в средах замораживания с гематокритом
40% инкубировали 30 мин при 25 °С, затем по г ру жа ли в жид кий азот (-196 °С) на 30 мин либо на 35 месяцев. Замороженные образцы эритроцитов размораживали на водяной бане при 40 °С в течение 3 мин. Затем к
1 мл размороженной клеточной суспензии при пе ре ме ши ва нии мед лен но до бав ля ли 9 мл теп ло го (37 °С) изо то ни чес ко го раст во -ра ЫаС1 в течение не менее 30 с (скорость добавления — не более 0,3 мл/с). Суспензию центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 5 мин и удаляли надосадочную жидкость. Про це ду ру раз ве де ния и цент ри фу ги -рования повторяли еще один раз. После этого эритроциты трижды отмывали теплым (37 °С) изотоническим раствором ЫаС1, не учи ты вая при этом ско рость раз ве де ния осад ка эрит ро ци тов.
Ос мо ти чес кий ге мо лиз эрит ро ци тов ис -следовали в среде, содержащей 10 ммоль/л трис-буфера (рН 7,4) и ЫаС1 с различной концентрацией (0,09-0,9%). Клетки в среде объемом 1 мл с гематокритом 0,6% инкубировали в течение 15 мин при 25 °С, далее центрифугировали при 3 000 об/мин 3 мин с пос ле ду ю щим из ме ре ни ем сте пе ни ге мо ли за в над осад очной жидкости.
Сте пень ге мо ли за эрит ро ци тов вы чис ля -ли пос ле спект ро фо то мет ри чес ко го оп ре де -ле ния ко ли че ст ва ге мог ло би на, из ме ряя поглощение в супернатанте образцов при длине волны 543 нм [15]:
степень гемолиза (%) = [А1/А2] х 100%,
где А1 — поглощение супернатанта экспериментального образца;
А2 — пог ло ще ние при пол ном ге мо ли зе конт роль но го об раз ца.
Проницаемость эритроцитов для ионов Н+ исследовали в изотонической сульфатной среде в термостатируемой (37 °С) ячейке с рН-электродом [16].
Содержание глутатиона в эритроцитах определяли спектрофотометрически с исполь-
зо ва ни ем ди ти о бис нит ро бен зой ной кис ло ты при длине волны 412 нм [17].
Оп ре де ле ние МДА про из во ди ли спект ро -фо то мет ри чес ки при дли не вол ны 535 нм, используя тиобарбитуровую кислоту согласно методу [18].
Активность глутатионпероксидазы оценивали по методу [19] с использованием дитиобис-нитробензойной кислоты, активность глута-тионредуктазы — с применением метода [20].
Морфологию эритроцитов до и после замораживания изучали с помощью светового мик рос ко па. В сус пен зию эрит ро ци тов с ге -матокритом 1,7% вносили альбумин в концентрации 1% , взвесь перемешивали и через
2 мин тестировали изменение морфологии. Альбумин является стабилизатором диско-ид ных форм эрит ро ци тов (нор мо ци тов) в крови [21], поэтому по степени их трансформации в дискоциты можно судить об обратимости структурных нарушений в мембранах замороженных клеток.
Статистические расчеты производили на основе результатов, полученных на эритроцитах от пяти доноров. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка. Для определения статистической достоверности результатов использовали непараметрический метод Манна-Уитни при Р < 0,05 [22].
Результаты и обсуждение
Замораживание эритроцитов в среде с ПЭГ-1500 приводит к значительному повреждению клеток — 55 и 60% до и после хра не ния, со от ве т ствен но, а так же к по вы -ше нию про ни ца е мос ти ос тав шей ся час ти эритроцитов для ионов Н+ по сравнению с интактными клетками (табл. 1).
Вклю че ние в сре ду за мо ра жи ва ния ДМСО спо со б ству ет су ще ст вен но му сни же -нию сте пе ни пов реж де ния эрит ро ци тов, при этом показатели проницаемости мембран для ионов Н+ достоверно не превышают аналогичные величины для интактных клеток (табл. 1).
Таблица 1. Степень повреждения и проницаемость мембран для ионов Н+ в эритроцитах, отмытых после замораживания в жидком азоте в среде с ПЭГ-1500 (20%)
в комбинации с ДМСО (15%)
Состав среды замораживания Гемолиз эритроцитов после отмывания криоконсерванта(% ) Проницаемость оставшейся части эритроцитов для ионов Н+ (Р'108 м/с)
Без хранения 35 месяцев хранения Без хранения 35 месяцев хранения
ПЭГ-1500 55,0±3,8 60,0±3,2 2,33±0,31* 2,35±0,29*
ПЭГ-1500 + ДМСО 7,0±1,8 9,0±1,6 1,82±0,29 1,87±0,33
Проницаемость интактных эритроцитов для ионов Н+
1,49±0,18
* — Р < 0,05 по сравнению с интактными эритроцитами.
Предполагается, что рост осмотической устойчивости эритроцитов в интервале показателей концентрации ЫаС1 0,09-0,4%, которые были заморожены в среде с ПЭГ-1500, связан с нарастанием градиента концентрации этого полимера на мембранах клеток во вре мя ох лаж де ния. При этом вклю че ние в среду замораживания ДМСО и поступление его в клетки способствует ослаблению осмотического стресса при замораживании, который индуцируется концентрированием непроникающего полимерного криопротектора [23].
По лу чен ные ре зуль та ты ис сле до ва ния проницаемости эритроцитов для ионов Н+ (табл. 1) и осмотического гемолиза (рис. 1) ука зы ва ют на то, что ком би на ция в сре де за -мораживания ПЭГ-1500 и ДМСО обеспечивает сохранение удовлетворительных осмотических свойств замороженных клеток.
Показатели содержания МДА и глутати-
о на в за мо ро жен ных и хра нив ших ся в жид -ком азо те эрит ро ци тах сви де тель ству ют
о том, что в клетках, не отмытых от криоконсерванта, определяется несколько большая концентрация МДА, чем в отмытых эритро-ци тах (табл. 2), од на ко эти из ме не ния не до -стоверны. В то же время не отмечается зна-чи тель но го рос та МДА пос ле хра не ния эрит ро ци тов, за мо ро жен ных в сре де с ПЭГ-1500 или в среде с ПЭГ-1500 и ДМСО.
В эритроцитах после замораживания и хранения в среде, содержащей ПЭГ-1500, пос ле от мы ва ния кри о кон сер ван та су ще ст -венно уменьшается концентрация глутатиона. Включение в среду замораживания дополнительно ДМСО не приводит к значительному уменьшению глутатиона в эритроцитах пос ле от мы ва ния кри о кон сер ван та (табл. 2). Это указывает на меньшую потерю барьерной функции мембран для глутатиона при замораживании эритроцитов в комбинированном криоконсерванте с ПЭГ-1500 и ДМСО.
Таблица 2. Содержание МДА и восстановленного глутатиона в эритроцитах после замораживания и хранения в жидком азоте в средах с ПЭГ-1500 (20%) и ДМСО (15%)
Условия эксперимента МДА (мкмоль/г НЬ) Глутатион (мкмоль/г НЬ)
Среды замораживания Образцы эритроцитов Без хранения 35 месяцев хранения Без хранения 35 месяцев хранения
ПЭГ-1500 С криоконсервантом 1,15±0,18 1,35±0,21 9,5±1,7 8,3±1,3
После отмывания криоконсерванта 1,02±0,16 1,21±0,19 5,1±0,81* 4,0±0,7*
ПЭГ-1500 + ДМСО С криоконсервантом 1,17±0,19 1,32±0,23 10,0±1,8 9,9±1,6
После отмывания криоконсерванта 1,04±0,15 1,08±0,17 9,1±1,2 8,1±1,4
Для интактных эритроцитов 0,98±0,13 10,5±1,6
Результаты исследования осмотического ге мо ли за за мо ро жен ных эрит ро ци тов пред -ставлены на рис. 1. В солевой среде с концентрацией ЫаС1 0,45-0,9% отмечается сниже ние ос мо ти чес кой ус той чи вос ти эрит -роцитов, замороженных в среде с ПЭГ-1500 (по срав не нию с ин та кт ны ми клет ка ми), в то время как при концентрации соли 0,09-0,4% про ис хо дит по вы ше ние ос мо ти чес кой ус той -чивости (рис. 1, кривая 3). При сочетании в среде замораживания ПЭГ-1500 и ДМСО кривая осмотического гемолиза замороженных эритроцитов несущественно отличается от та ко вой для ин та кт ных кле ток, что ука -зывает на сохранение осмотической хруп-кос ти за мо ро жен ных эрит ро ци тов (рис. 1, кривая 2).
ЫаС1, %
Рис. 1. Зависимость гемолиза от концентрации КаС1 для эритроцитов, отмытых после замораживания и хранения в жидком азоте в различных средах:
1 — интактные клетки; 2 — среда, содержащая 20% ПЭГ-1500 и 15% ДМСО; 3 — среда, содержащая 20% ПЭГ-1500
Активность глутатионзависимых энзимов после замораживания и хранения эрит-ро ци тов в жид ком азо те су ще ст вен но не из -ме ня лась (табл. 3).
На рис. 2 приведены микрофотографии эрит ро ци тов, от мы тых изо то ни чес ким раст -вором ЫаС1. Интактные клетки представлены (1) стоматоцитами (70-87%) и эхиноци-тами (13-30%), а в присутствии альбумина
(2) эрит ро ци ты пре об ра зу ют ся в дис ко ци ты (нор мо ци ты). Эрит ро ци ты, от мы тые пос ле замораживания и хранения с ПЭГ-1500, явля ют ся сфе ро ци та ми (3), при су т ствие альбу ми на в сре де при во дит к из ме не нию фор мы кле ток и они ста но вят ся эхи но ци та -ми (4).
После замораживания и хранения в комби ни ро ван ном кри о кон сер ван те, со дер жа -щем ПЭГ-1500 и ДМСО, эритроциты представлены эхиноцитами и сфероэхиноцитами (5), однако присутствие в среде альбумина вызывает изменение формы клеток (6), и они ста но вят ся в ос нов ном дис ко ци та ми (65-68%) с меньшим количеством содержания стоматоцитов (17-22%) и эхиноцитов (15%). Это свидетельствует о том, что эрит-ро ци ты, за мо ро жен ные в ком би ни ро ван ном кри о кон сер ван те, смо гут вос ста нав ли вать свою функ ци о наль ную пол но цен ность пос ле попадания в кровяное русло.
Таким образом, замораживание и хранение эритроцитов в жидком азоте в среде, содержащей ПЭГ-1500, приводит к значительному пов реж де нию эрит ро ци тов и ухуд ше нию ос -мо ти чес ких и мор фо ло ги чес ких свойств ос -тав шей ся час ти кле ток пос ле от мы ва ния кри о кон сер ван та, од на ко дос то вер но го на -коп ле ния МДА в мемб ра нах и из ме не ния ак -тивности глутатионзависимых энзимов не про ис хо дит. Вклю че ние в сос тав сре ды прони ка ю ще го кри оп ро тек то ра ДМСО при -водит к незначительной степени повреждения эрит ро ци тов и сох ра не нию ос мо ти чес -ких, ан ти ок си да нт ных и мор фо ло ги чес ких свойств оставшейся части клеток после от-мы ва ния кри о кон сер ван та.
Рис. 2. Морфология эритроцитов в среде, содержащей 0,9% КаС1:
1, 3, 5 — без альбумина; 2,4,6 — при наличии альбумина (1%); 1,2 — интактные клетки; 3,4 — после замораживания и хранения в жидком азоте в среде, содержащей ПЭГ-1500; 5,6 — после за мо ра жи ва ния и хра не ния в жид ком азо те в среде, содержащей ПЭГ-1500 и ДМСО
Вос ста нов ле ние мет ге мог ло би на в ге мо -глобин обеспечивается энзимом метгемогло-бинредуктазой с образованием супероксид-ного радикала, при нейтрализации которого образуется пероксид водорода. Из-за недостатка в эритроцитах глутатиона снижается активность глутатионпероксидазы, что спо-со б ству ет об ра зо ва нию гид ро пе рок си дов жир ных кис лот и пов реж де нию мемб ран [1, 2]. Данные литературы указывают на суще-ст во ва ние вза и мос вя зи меж ду ре ак ци я ми ПОЛ и реакциями, поддерживающими гемоглобин в восстановленной форме.
Согласно этим данным, в клетках после за мо ра жи ва ния из ме ня ет ся рав но ве сие меж ду ре ак ци я ми ПОЛ и ан ти ок си да нт ны -ми свой ства ми эрит ро ци тов [3, 24]. При этом в мембранах клеток накапливается конечный продукт ПОЛ — МДА. Степень
Таблица 3. Активность энзимов глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы в эритроцитах после замораживания и хранения в жидком азоте в среде с ПЭГ-1500 (20%) и ДМсО (15%)
Среды замораживания Глутатионпероксидаза (мкмоль глутатиона/мин • г НЬ-1) Глутатионредуктаза (мкмоль НАДФН2/мин • г НЬ-1)
Без хранения 35 месяцев хранения Без хранения 35 месяцев хранения
ПЭГ-1500 145,6±20,2 142,3±23,0 12,4±2,1 11,8±1,9
ПЭГ-1500 + ДМСО 148,5±27,0 145,4±19,5 12,7±2,0 12,2±1,8
Для интактных эритроцитов 155,8±22,4 14,6±2,3
уве ли че ния кон це нт ра ции МДА оп ре де ля ет -ся скоростью замораживания и оттаивания. Чем ниже скорость охлаждения и оттаивания, тем вы ше уро вень об ра зо ва ния МДА в замороженных клетках. Наименьший при рост ко ли че ст ва МДА наб лю да ет ся в быстро замороженных и быстро оттаявших клетках [24]. Кроме того, в быстро за-мо ро жен ных в жид ком азо те эрит ро ци тах в среде, содержащей гидроксиэтилирован-ный крах мал (ГЭК), при пос ле ду ю щем хра -нении их в течение 1-6 мес при -80 °С также вы яв ле но по вы ше ние кон це нт ра ции МДА
[3]. С увеличением срока хранения эритроцитов от 1 до 6 мес отмечалось повышение их осмотической хрупкости. На основе таких результатов авторы пришли к заключению, что ак ти ва ция ПОЛ, при во дя щая к росту осмотической хрупкости эритроцитов, инициируется супероксидным радикалом, формирование которого индуцируется окисле ни ем ге мог ло би на в мет ге мог ло бин при за -мораживании и хранении эритроцитов [3].
Результаты нашей работы указывают на отсутствие достоверного накопления МДА в мембранах эритроцитов после их замора-жи ва ния и хра не ния в жид ком азо те не за ви -симо от состава среды, а уменьшение концентрации восстановленного глутатиона в клетках свя за но с по те рей барь ер ной функ ции мемб -ран при от мы ва нии кри о кон сер ван та (табл. 2). Сле ду ет от ме тить, что эрит ро ци -ты, замороженные в среде с ПЭГ-1500, имеют су ще ст вен ные отк ло не ния ос мо ти чес ких показателей от таковых интактных клеток (табл. 1, рис. 1). Однако при хранении в за-мо ро жен ном сос то я нии в них не вы яв ле но по вы ше ния кон це нт ра ции МДА и су ще ст -венного изменения активности глутатион-превращающих энзимов (табл. 2, 3). Установлено, что на ру ше ние ос мо ти чес ких свойств за мо ро жен ных эрит ро ци тов не за ви сит от их ан ти ок си да нт ных свойств, а оп ре де ля ет ся пов реж де ни я ми, ко то рые про ис хо дят не по -средственно при замораживании-оттаивании. Замораживание и хранение эритроцитов в комбинированной среде, содержащей ПЭГ-1500 и ДМСО, приводит к незначительно му пов реж де нию кле ток и сох ра не нию их осмотических (табл. 1, рис. 1) и морфологических свойств (рис. 2). Это свидетельствует об эффективности использованной комбинированной среды при замораживании эритроцитов.
Согласно данным литературы, среда, со-дер жа щая ПЭК и ДМСО, яв ля ет ся эф фек -тивным криоконсервантом для многих клеток, вклю чая та ко вые кост но го моз га [25], ге мо по э ти чес кие клет ки кор до вой кро ви
[26] и поджелудочной железы человека [27]. В данном случае использование комбинированного криоконсерванта исключает программное замораживание и позволяет замораживать клетки без контроля скорости ох лаж де ния. Ве ро ят но, это свя за но с тем, что при замораживании в таком комбинированном криоконсерванте снижается степень пе ре ох лаж де ния кле точ ных об раз цов, что уменьшает вероятность образования внут-рик ле точ ных крис тал лов ль да [25].
Выявлено, что при замораживании-отта-и ва нии эрит ро ци тов со че та ние в крио кон -серванте декстрана или ПЭГ-1500 с ДМСО приводит к устранению эффекта «упаковки» и, соответственно, к ослаблению постги-пертонического воздействия [11]. Устранение этого эффекта при замораживании в среде с глицеролом обеспечивает сохранение ос мо ти чес кой хруп кос ти эрит ро ци тов [28]. Таким образом, криопротекторную эффективность комбинированной среды, содержащей ПЭГ-1500 и ДМСО, можно объяснить устранением эффекта «упаковки». Существует предположение, что увеличение степени пов реж де ния эрит ро ци тов, свя зан ное с эффектом «упаковки», определяется меха-ни чес ки ми воз дей стви я ми крис тал лов ль да и увеличением концентрации раствора при замораживании [29], а также осмотическими воз дей стви я ми при раз мо ра жи ва нии всле д ствие плав ле ния внек ле точ ных и внут -рик ле точ ных крис тал лов ль да [30]. В ус ло -виях быстрого замораживания и быстрого оттаивания (в нашей работе использовали именно такой подход) увеличение степени гемолиза в эффекте «упаковки» определяется постгипертоническим стрессом на конечной стадии быстрого размораживания из-за разведения внешней среды водой вследствие таяния льда, значительная часть которого была образована из внутриклеточной воды [13].
При замораживании криозащитные ком-по нен ты под вер га ют ся кон це нт ри ро ва нию и оказывают не только протекторное, но и пов реж да ю щее действие. В этом кон те кс те целесообразно проанализировать данные литературы.
Криозащитное действие полимерных непроникающих криопротекторов обусловлено их спо соб ностью обес пе чи вать сох ра не ние ре па ра ци он ных свойств мемб ран, при этом раз мо ро жен ные клет ки не те ря ют спо соб -ности восстанавливать свой катионный баланс. Кроме того, защитное действие поли-ме ров свя за но со струк ту ри ро ва ни ем во ды и поддержанием ее в жидком состоянии при низких температурах в ходе замораживания
(до -35 °С) [31]. Однако наряду с положительными эффектами полимеры, концентрируясь в ходе замораживания, способствуют на рас та нию ги пер то ни чес ко го гра ди ен та и повреждению клеточных мембран [31]. Кри о за щит ное действие про ни ка ю щих кри о -п ро тек то ров свя за но с про ник но ве ни ем их в клетки и уменьшением степени дегидратации кле ток, при этом про ис хо дит за мед ле -ние ги пер кон це нт ри ро ва ния. Вмес те с тем уменьшение степени дегидратации клеток приводит к возрастанию вероятности форми ро ва ния внут рик ле точ ных крис тал лов льда [31]. Таким образом, как у непроникающих, так и у проникающих криопротекторов существуют сопутствующие отрицательные свойства в цикле замораживания-оттаивания кле точ ных сус пен зий, ко то рые, ис хо дя из вышеизложенного, можно ослабить, комбинируя в среде замораживания два вида криопротекторов. Включение проникающего кри оп ро тек то ра в сре ду с неп ро ни ка ю -щим кри оп ро тек то ром и пос туп ле ние его в клет ки мо жет при вес ти к умень ше нию степени их дегидратации и, соответственно, к ослаблению гипертонического стресса в ходе замораживания, обусловленного конце нт ри ро ва ни ем неп ро ни ка ю ще го кри оп ро -тектора. Уменьшение интенсивности гипер-то ни чес кого стрес са соз да ет ус ло вия для ос лаб ле ния вли я ния ос мо ти чес ких ме ха низ -мов повреждения при размораживании, что свя за но с флук ту а ци он ным вхо дом и вы хо -дом во ды в клет ках при мед лен ном раз мо ра -живании [30] либо с постгипертоническим стрессом на конечном этапе быстрого оттаивания [13]. Приведенные данные указывают на ве ро ят ный ме ха низм эф фек тив нос ти
ком би ни ро ван ных кри о кон сер ван тов, со -дер жа щих неп ро ни ка ю щие и про ни ка ю щие криопротекторы, вследствие которого устраняется эффект «упаковки».
Таким образом, замораживание эритроцитов в среде с ПЭГ-1500 приводит к значительному повреждению клеток и существенному из ме не нию ос мо ти чес ких и мор фо ло ги чес -ких свойств ос тав шей ся час ти эрит ро ци тов после отмывания криоконсерванта. В то же вре мя не вы яв ле но дос то вер ных из ме не ний концентрации МДА и активности глутатион-метаболизирующих энзимов после длительно го хра не ния эрит ро ци тов в за мо ро жен ном сос то я нии. Со че та ние в кри о кон сер ван те ПЭГ-1500 и ДМСО обеспечивает эффективные криозащитные свойства комбинированного состава, что снижает действие повреждающих факторов при замораживании-оттаивании и обеспечивает упрощение отмывания эритроцитов после размораживания изотоническим раствором ЫаС1 без использования ги пер то ни чес ких сред. При этом эрит ро ци -ты сохраняют осмотические, антиоксидантные и морфологические показатели, определенные для контроля. На основе полученных результатов с учетом данных литературы мож но пред по ло жить, что кри о за щит ная эффективность использованного комбинированного состава связана с поступлением в клет ки ДМСО и, всле д ствие это го, ос лаб ле -нием гипертонического стресса, обусловлен-но го кон це нт ри ро ва ни ем неп ро ни ка ю щих компонентов среды при замораживании, что обеспечивает сохранение устойчивости клеток к пост ги пер то ни чес ко му стрес су при размораживании.
ЛИТЕРАТУРА
1. Pawlak W, Kedziora J., Zolynski K. et al. Effect of long term bed rest in men on enzymatic antioxidative defense and lipid peroxidation in erythrocytes // J. Gravit. Physiol. —
1998. — V. 5, N 1. — P. 163-164.
2. Throm M. J., Stevens M. D., Hansen C. Benzocaine-induced methemoglobinemia in two patients: interdisciplinary collaboration, management, and near misses // Pharmacotherapy. — 2007. — V. 27, N 8. — P. 1206-1214.
3. Langer R, Herold T., Henrich H. A. Lipid peroxidation and hemolysis in HES cryopre-served erythrocytes // Beitr Inf. Transf. —
1996. — V. 33. — P. 111-116.
4. Pellerin-Mendes C, Million L, Marchand-Arvier M. et al. In vitro study of the protective effect of
trehalose and dextran during freezing of human red blood cells in liquid nitrogen // Cryobiology. —
1997. — V. 35, N 2. — P. 173-186.
5. Аграненко В. А., Федорова Л. И. Замороженная кровь и ее клиническое применение. — М.: Медицина, 1983. — 96 с.
6. Sputtek A., Singbartl G., Langer R. et al. Cryopreservation of erythrocytes using hyd-roxyethyl starch: in vivo results of an autologous retransfusion model in humans // Beitr Inf. Transf. — 1994. — V. 32. — P. 44-47.
7. Wagner C. T, Martowicz M. L., Livesey S. A., Connor J. Biochemical stabilization enhances red blood cell recovery and stability following cryopreservation // Cryobiology. — 2002. — V. 45, N 2. — P. 153-166.
8. Михнович Е. П., Рождественская М. А., Не-дельский Г. Т. Криоконсервация эритроци-
тов при -196 ОС с про ни ка ю щи ми и неп ро -никающими веществами | Act. вопр. крио-биол. криомед. — К.: Наук. дум-
ка, 1974. — С. 161-164.
9. Паніна Ю. Є. Фізи ко-ма те ма тич на те орія гіпо тонічно го ге молізу ерит ро цитів лю ди -ни: Aвтореф. дис. ... канд. фіз.-мат. наук.: 03.00.19. | Ін-т. пробл. кріобіол. кріомед.,
1999. — 17 с.
10. Терехов Н. Т., Петров М. М., Буденная М. П., Тим чен ко Н. В. Дол гос роч ное хра не ние эрит ро ци тов ме то дом за мо ра жи ва ния при умеренно низких (-60°-40 °С) температурах | Метод. рекомендации. — К., 1986. — 1б с.
11. Рамазанов В. В., Бондаренко В. А. Проявление и уст ра не ние эф фек та «упа ков ки» в средах с непроникающими и проникаю-щи ми кри оп ро тек то ра ми || Пробл. кри о -биол. — 2009. — Т. 19, № 3 — С. 312-323.
12. Pegg D. E., Diaper M. P. The paking effect in erythrocyte freezing || Cryo Letters. — 1983. — V. 4, N 2. — P. 129-136.
13. Levin R. L. The limiting effects of heat and mass transfer on the osmotic behavior of cells during freezing and thawing || Cryobiology. — 1982. — V. 19, N 6. — P. 669.
14. Woolgar A. E., Morris C. J. Some combined effects of hypertonic solutions and changes in temperature on posthypertonic haemolysis of human red blood cells || Ibid. — 1973. — V. 10. — Р. 82-86.
1б. Mazur P., Miller R. H. Survival of frozen-thawed human red cells as a function of the permeation of glycerol and sucrose || Ibid. — 1976. — V. 13, N б. — P. 523-536.
16. Рамазанов В. В., Забродский Р. Ф., Най-дюк Я. Ю., Бондаренко В. А. Функ ци о ни ро -ва ние сис те мы транс пор та ио нов Н+ при мо ди фи ка ции мемб ран эрит ро ци тов в ус -ло ви ях, мо де ли ру ю щих ус ло вия за мо ра -живания || Вісн. пробл. біол. мед. — 2010. — Вип. 3 — С. 186-192.
17. Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods. — New York.: Grune&Stratton, 197б. — 160 p.
18. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекис-ное окис ле ние ли пи дов в би о ло ги чес ких мембранах. — М.: Наука, 1972. — 270 с.
19. Разыграев А. В., Арутюнян A. B. Определение глутатионпероксидазной активности в сы во рот ке кро ви че ло ве ка с ис поль зо ва ни -ем пероксида водорода и б,б'-дитиобис (2-нит ро бен зой ной кис ло ты) || Клин. лаб. диагност. — 2006. — № 6. — С. 13-16.
20. Юсу по ва Л. Б. О по вы ше нии точ нос ти оп -ределения активности глутатионредукта-зы эритроцитов || Лаб. дело. — 1989. — № 4. — С. 19-21.
21. Hoffman J. F. On the mechanism and measurement of shape transformations of constant volume of human red blood cells // Blood Cells. — 1987. — V. 12, N 3. — P. 565-588.
22. Ашмарин И. П., Васильев И. П., Амбро-сов В. А. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов. — Л.: Из-во Ленингр. ун-та, 1975. — 76 с.
23. Рамазанов В. В., Бондаренко В. А.. Осмоти-чес кие свой ства эрит ро ци тов, за мо ро жен -ных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами // Пробл. криобиол. — 2010. — Т. 20, № 1 — С. 47-58.
24. Актуальные проблемы криобиологии / Ред: Пушкарь Н. С., Белоус А. М. — К.: Наук. думка, 1981. — 608 с.
25. Luo K. G., Wu G., Q. Wang Q. et al. Effect of dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch in the preservation of fractionated human marrow cells // Cryobiology. — 1994. — V. 31, N 4. — P. 349-354.
26. Liu K. Y., Dong W. C., Wang Y. L. et al. Study on non-programmed process using dimethyl sulfoxide and hydroxyethyl starch as cry-oprotectants in cryopreservation of cord blood hematopoietic cells // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. — 2004. — V. 12, N 5. — P. 670-673.
27. Maruyama M. Kenmochi T., Sakamoto K. et al. Simplified method for cryopreservation of islets using hydroxyethyl starch and dimethyl sulfoxide as cryoprotectants // Transplant Proc. — 2004. — V. 36, N 4. — P. 1133-1134.
28. Wagner C. T., Burnett M. B., Livesey S. A., Connor J. Red blood cell stabilization reduces the effect of cell density on recovery following cryopreservation // Cryobiology. —
2000. — V. 41, N 3. — P. 178-194.
29. Mazur P., Cole K. W. Influence of cell concentration on the contribution of unfrozen fraction and salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes // Ibid. — 1985. — V. 22, N 6. — P. 509-336.
30. Farrant J., Walter C. A., Lee H., McGann L. E. Use of two-step cooling procedures to examine factors influencing cell survival following freezing and thawing // Ibid. — 1977. — V. 14, N 3. — P. 273-286.
31. Bakhach J. The cryopreservation of composite tissues. Principles and resent advancement on cryopreservation of different type of tissues // Organogenesis. — 2009. — V. 5, N 3. — P. 119-126.
ВЛАСТИВОСТІ ЕРИТРОЦИТІВ, ЗАМОРОЖЕНИХ В КОМБІНОВАНОМУ СЕРЕДОВИЩІ З ПОЛІЕТИЛЕНГЛІКОЛЕМ
І ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДОМ
У. У. Рамазанов Т. І. Дейнеко Е. Л. Воловельська У. А. Коптелов В. А. Бондаренко
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків
E-mail: [email protected]
Досліджували осмотичні, антиоксидантні й морфологічні характеристики еритроцитів, заморожених в рідкому азоті (-196 °С) в середовищі, що містить поліетиленгліколь-1500, або в комбінованому середовищі з поліети-ленгліколем ПЕГ-1500 і диметилсульфокси-дом. При заморожуванні в середовищі, що містить поліетиленгліколь-1500, відзначається значний ступінь ушкодження еритроцитів (55-60%), втрата клітинами глутатіону під час відми вання кріокон сер ван ту і підви щен ня проникності частини клітин, що залишилася, для іонів Н+. Водночас не виявлено істотного збільшення концентрації малонового діаль-дегіду і значної зміни показників активності глутатіонзалежиних ензимів (глутатіонредук-тази і глутатіонпероксидази) при заморожуванні в двох зазначених середовищах. У разі додаткового включення в середовище диметил суль фок си ду ступінь уш код жен ня ерит ро -цитів при заморожуванні знижується (7-9%)
зі збе ре жен ням ос мо тич них, ан ти ок си да нт них
і мор фо логічних влас ти вос тей час ти ни клітин, що залишилася, після відмивання кріоконсер-ванту. Отримані результати дозволяють припус ти ти, що збе ре жен ня ос мо тич них і мор -фологічних властивостей еритроцитів, замороже них у комбіно ва но му се ре до вищі з поліети -ленгліколем-1500 і диметилсульфоксидом, забезпечується проникненням останнього в клі-ти ни і ос лаб лен ням гіпер тонічно го стре су, зумовленого концентруванням №С1 та ПЕГ-150 при заморожуванні.
Ключові слова: еритроцити, осмотичні, анти-ок си дантні і мор фо логічні влас ти вості, за мо -рожування, комбінований кріоконсервант.
PROPERTIES OF ERYTHROCYTES FROZEN IN COMBINED MEDIUM WITH POLYETHYLENE GLYCOL AND DIMETHYLSULFOXIDE
V. V. Ramazanov T. I. Dejneko E. L. Volovelskaya V. A. Koptelov V. A. Bondarenko
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv
E-mail: [email protected]
Osmotic, antioxidative and morphological characteristics of erythrocytes frozen in liquid nitrogen (-196 °C) in a medium containing polyethylene glycol -1500 or in combined medium with polyethylene glycol-1500 and dimethylsul-foxide were studied. During freezing in medium containing polyethylene glycol -1500, significant rate of erythrocytes damage (55-60%), glutathione loss by the cells during cryopreservative washing-out and penetration increasing of rest of cells for H+ ions were reported.
At the same time no significant increasing of malonic dialdehyde concentration and valuable change of indices of glutathione-metabolized enzymes activity (glutathione reductase and glutathione peroxidase) during freezing in two indicated media were found out. At additional introduction of DMSO into medium, damage rate of erythrocytes during freezing decrease significantly (7-9%) keeping the sufficient osmotic, antioxidative and morphological properties of the remained part of cells after cryopreservative washing-out.
The findings enable to suggest that osmotic and morphological properties retention of erythrocytes being frozen in combined medium with polyethylene glycol-1500 and dimethylsulfoxide were provided by penetration of the latter into the cells and weakening of hypertonic stress, stimulated by NaCl and polyethylene glycol-1500 concentration during freezing.
Key words: erythrocytes, osmotic, antioxidative and morphological properties, freezing, combined cryopreservative.
