CC BY
21
HayKOBHH bîchhk .HHyBME iMeHi C.3. I^H^Koro, 2017, T 19, № 78
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^OHaibHoro ymBepcurery BeTepHHapHOi MegnuUHH Ta 6i0TexH0iroriH iMeHi C.3. f^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
doi: 10.15421/nvlvet7808
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
y^K 602.9:611.018:616-006:636.028
OCOO^HBOCTÎ K^iTHHHoro цнк^у Me3eHxÏMa^bHHx croBÔypoBHx K^ÎTHH 3 ^npoBoi TKaHHHH coOaKH 3a pi3HHx nac<mie Ky^bTHByBaHHH
n.B. KnagHH^Ka [email protected]
Ha^onanbnuü yHieepcumem ôiopecypcie i npupodoKopucmyeaHHn yKpaïHu eyn. nomexiHa, 16, m. Kuïe, 03041, yKpaiHa
ffocnidweHo ocoônueocmi nepeôi3y mimumoao цuкny Kynbmypu Me3eHxiManbHux cmoeôypoeux KnimuH 3 wupoeoï mKanunu coôaKu 3a pi3Hux nacawie Kynbmueyeamn.
Me3enxiManbui cmoeôypoei KnimuHu ompuMyeanu 3 wupoeoï mKanunu co6aKU MemodoM eKcnnaHma y namiü Modurf>iKaw'ï e yMoeaxnaMimpwao 6oKcy. KynbmueyeaHHn KnimuH npoeodunu 3a 37 °C, 100% eonoaocmi i 5% eMicmi C02y cepedoeuwi Kynbmu-eyeaHHM Izna, Moèu^iKoeanoao ffwnbôeKKo i3 dodaeaHHnM 15% fyemanbHoï cupoeamKu ôuuKie ma 1% aHmuôiomuKa-anmuMiKomuKa. Cepedoeuwe KynbmueyeaHHn 3MiHKeanu 2-3 pa3u Ha muwdeHb. OmpuMyeanu Kynbmypy Me3eHxiManbHux cmoeôypoeux KnimuH 2-3o, 7-3o ma 12-3o nacawie. MemodoM npomouHoï ^mo$nyopuMempïï emmuanu pieeHb aHeynnoïdiï ma po3nodin KnimuH 3a $a3aMu mimumoao цuкny. 3a donoMoaoK iHeepmoeaHoao MiKpocKona Axiovert 40 docnidwyeanu MopfyonoaiK KnimuH pi3Hux nacawie.
ffocnidweHo, wo Kynbmypa Me3eHxiManbHux cmoeôypoeux KnimuH 3 wupoeoï mKaHuHu Ha 2-My nacawi Micmuna 3HauHy Kinb-Kicmb KnimuH nponifyepamueHoao nyny (S+G2/M) i cmaHoeuna 29,51 ± 3,56% eid KinbKocmi dunnoïdHux KnimuH. KinbKicmb aHeyn-noidHux KnimuH cmaHoeuna 1,55 ± 0,43%. Yci KnimuHu Manu fyiôpoônacmonodiÔHy MopfyonoaiK.
BcmaHoeneHo, wo Ha cepedHix nacawax (7-ü) y Kynbmypi Me3eHxiManbHux cmoeôypoeux KnimuH 3 wupoeoï mKaHuHu coôaKu He euneneHo docmoeipHux 3MiH y po3nodini KnimuH 3a $a3aMu Knimumoao ^my. KinbKicmb dunnoïdHux KnimuH nponifyepamueHoao nyny G2/M+S ma npecmmemuuHoao nepiody G0/G13anumaembcn ôe3 icmomHux 3MiH. PieeHb aHeynnoïdiï nideuwyembcn y Mewax meHdeH^ï. Mop^onoaiuHo KnimuHu 3ôepi3anu fyiôpoônacmonodiôHy fyopMy.
3a 12-3o nacawy KynbmueyeaHHn eu3Hauew docmoeipHe 3HuweHHn noKa3HuKa KinbKocmi KnimuH nponifyepamueHoao nyny (S + G-/M), HKuü cmaHoeumb 18,93 ± 0,66% eid ycieï KinbKocmi dunnoïdHux KnimuH y nopiewHHi 3 2-m nacaweM. KinbKicmb aHey-nnoïdie docmoeipHo 3pocmae i cmaHoeumb 3,49 ± 0,38%. Mop^ono3iuHo e oKpeMux KnimuH 3'nennKmbcn eidpocmKu. noKa3HuK cunu ennuey nacawyeaHHn Ha eMicm dunnoïdHux KnimuH nponi^epamueHoao nyny G2/M+S e Kynbmypi cmaHoeumb q2x= 70% (npu P < 0,05). Omwe, nepmi xapaKmepHi o3HaKu cmapiHHn Kynbmypu cmoeôypoeux KnimuH 3 wupoeoï mKaHuHu coôaKu 3'nennKmbcn Ha 12-My nacawi Kynbmueyeamn.
Knwnoei cmea: Me3eHxiManbHi cmoeôypoei KnimuHu, wupoea mKaHuHa, coôaKa, KynbmueyeaHHn, KnimuHHuü цuкn, $a3u, aHe-ynnoïdu, dunnoïdu, nponi^epamueHuü nyn.
OcoOeHHocTH K^eTonHoro цнк^a Me3eHXHMa^bHbix CTBOB^OBMX K^TOK H3 ^HPOBOH TKaHH coOaKH Ha pa3Hbix naca^ax Ky^bTHBHpoBaHHH
n.B. KnagHH^aa [email protected]
HaцuoнanbHblü yHueepcumem ôuopecypcoe u npupodononb3oeaHun yKpauHU yn. nomexuHa, 16, 3. Kuee, 03041, yKpauHa
Citation:
Kladnytska, L.V. (2017). The cell cycle features of canine adipose-derived mesenchymal stem cells on different passages of cultivation. Scientific Messenger LNUVMB, 19(78), 36-40.
Науковий вкник ЛНУВМБ iMeHi С.З. Гжицького, 2017, т 19, № 78
Исследованы особенности клеточного цикла культуры мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани собаки при различных пассажах культивирования.
Мезенхимальные стволовые клетки получали из жировой ткани собаки методом экспланта в нашей модификации в условиях ламинарного бокса. Культивирование клеток проводили при 37 °С, 100% влажности и 5% содержании СО2 в среде культивирования Игла, модифицированной Дюльбекко (DMEM) с добавлением 15% фетальной сыворотки бычков и 1% антибиотика-антимикотика. Среду культивирования меняли 2-3 раза в неделю. Получали культуру мезенхимальных стволовых клеток 2-го, 7-го и 12-го пассажей. Методом проточной цитофлуориметрии определяли уровень анеуплоидии и распределение клеток по фазам клеточного цикла. С помощью инвертированного микроскопа Axiovert 40 исследовали морфологию клеток различных пассажей.
Доказано, что культура мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани на 2-ом пассаже содержит значительное количество клеток пролиферативного пула (S + G2/M) и составляет 29,51 ± 3,56% диплоидных клеток. Количество анеуплоидных клеток составляет 1,55 ± 0,43%. Все клетки имели фибробластоподобную морфологию.
Установлено, что на средних пассажах (7-й) в культуре мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани собаки не выявлено достоверных изменений в делении клеток по фазам клеточного цикла. Количество диплоидных клеток проли-феративного пула G2/M + S и пресинтетического периода G0/G1 остается без существенных изменений. Уровень анеуплоидии повышается в пределах тенденции. Морфологически клетки сохраняют фибробластоподобную форму.
На 12-ом пассаже культивирования выявлено достоверное снижение показателя количества клеток пролиферативного пула (S+G2/M), который составляет 18,93 ± 0,66% от всего количества диплоидных клеток по сравнению со 2-м пассажем. Количество анеуплоидных клеток достоверно повышается и составляет 3,49 ± 0,38%. Морфологически в отдельных клетках появляются отростки. Показатель силы воздействия культивирования на содержание диплоидных клеток пролифера-тивного пула (S+G2/M) в культуре составляет ц2х=70% (Р < 0,05). Итак, первые характерные признаки старения культуры мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани собаки появляются на 12-ом пассаже культивирования.
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, жировая ткань, собака, культивирование, клеточный цикл, фазы, анеуплоиды, диплоиди, пролиферативный пул.
The cell cycle features of canine adipose-derived mesenchymal stem cells on
different passages of cultivation
L.V. Kladnytska [email protected]
National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine Potekhina Str., 16, Kyiv, 03041, Ukraine
The features of the cell cycle of culture of adipose-derived mesenchymal stem cells from the for different cultivating passages were studied.
Mesenchymal stem cells were obtained from the adipose tissue of the dog under a laminar flow hood by an explant method in our modification. Cell cultivation was carried out at 37 °C, 100% moisture and 5% CO2 in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% antibiotic-antimycotic. The culture medium was changed 2-3 times per week and the cells were selected by their capacity to attach to the flask surface. When culture flasks became 80% confluence, cells were detached with 0.25% trypsin containing 1 mmol/L EDTA and subsequently replayed at a concentration of 104 cells/cm2for next passaging. A cells culture of adipose derived mesenchymal stem cells was obtained on the 2nd, 7th and 12th passages. The method of flow cytometry determined the level of aneuploid cells and the distribution in the cell cycle phases. The morphology of cells of different passages was studied using an inverted microscope Axiovert 40.
It was investigated that the culture of mesenchymal stem cells from adipose tissue in the 2nd passage contains a significant number of the proliferative pool (S + G2/M) cells and it was 29.51 ± 3.56% of the total number of diploid cells. The number of aneuploid cells was 1.55 ± 0.43%. All cells hadfibroblast-like morphology.
It was established that in the middle passages (7th) in the culture of mesenchymal stem cells from the adipose tissue of the dog no significant changes were found in the distribution of cells in the phases of the cell cycle. The number of diploid cells of the proliferative pool S + G2/M and the G0/G1 pre-synthetic period remains unchanged. The level of aneuploidy increases only within the tendency. Morphologically, cells had fibroblast-like form.
It was determined on 12th passage of cultivation, a significant decrease in the number of cells of the proliferative pool (S+G2/M), which was 18.93 ± 0.66% of the total number of diploid cells compared to the 2nd passage. The number of aneuploid cells increased and it was 3.49 ± 0.38%. Morphologically, separate cells had processes.
The indicator of the effect of cells cultivation on the content of diploid cells of the proliferative pool (S+G2/M) in culture is q2x = 70% (P < 0.05). So, first characteristic properties of the aging of the culture of canine adipose-derived mesenchymal stem cells appear on the 12th passage of cultivation.
Key words: mesenchymal stem cells, adipose tissue, dog, cultivation, cell cycle, phases, aneuploids, diploid, proliferative pool.
Вступ
Корекщя ф1зюлопчних функцш та вщновлюваль-на терашя за патолопчних сташв за допомогою стов-бурових клггин мае все бшьше застосування у гуман-нш та ветеринарнш медициш (Haghighat et al., 2011; Volk and Theoret, 2013; Marx et al., 2014; Arnhold and
Wenisch, 2015; Kathrine et al., 2017). Окрем1 автори наголошують на ввдмшностях бюлопчних властивос-тей мезенх1мальних стовбурових клгган, отриманих з р1зних джерел, зокрема шсткового мозку, жирово! тканини (Dmitrieva et al., 2011; Reich et al., 2012). Zhang Z.X. та шш1 (Zhang et al., 2007). При досль дженш культури мезенх1мальних стовбурових клгтин
Науковий вгсник ЛНУВМБ гмеш С.З. Гжицького, 2017, т 19, № 78
з шсткового мозку людини на 1-му та 3-му пасажах взагалi не виявили анеупло!дних, полiплоiдних клгган та порушень хромосомного апарату. При дослщженш МСК з жирово! тканини макак резус виявили появу анеуплощних клгган пiсля першого пасажу, це була резус-хромосома, яка тсля першого пасажу мала тетрапло!дний карiотип. Цг результати вказують на те, що довгострокове культивування МСК призводить до значних змш у кiнетицi клгганного циклу що засвгд-чуе необхщшсть його вiдстеження перед клiнiчним застосуванням (Zhang et al., 2007). Для яшсного на-дання послуг необхгдно оцiнювати бiологiчнi власти-востi культури клiтин, яка застосовуеться для трансплантаций. При тривалому культивуваннi вгдбуваються змiни пролГферативно! активностi клiтин, з'являються змiни в хромосомах, i як наслгдок, бiологiчне старiння культури. Дослгдження клiтинного циклу культури забезпечуе визначення особливостей клiтин культури за рiзних пасажiв культивування. Данi щодо бюлопчних властивостей культури мезенхiмальних стовбурових клгган собак, отриманих з рiзних джерел, у сучас-нш лiтературi обмеженi. Отже, визначення особливостей клгганного циклу мезенхiмальних стовбурових клгган з жирово! тканини собаки за рiзних пасаж1в культивування е актуальним питанням.
Матерiал i методи досл1джень
Дослщи проводили на собаках рГзних поргд вжом до 12-ти шсяцш. Вс дослгдження на тваринах були проведет ввдповщно до Правил належно! лаборатор-но! практики щодо використання експериментальних тварин та з дотриманням закону Укра!ни «Про захист тварин вщ жорстокого поводження».
Для отримання МСК з жирово! тканини застосову-вали метод експланта у нашш модифiкацi! (Kladnytska et al., 2016). Культивування клгган проводили за 37 °С, 100% вологосп i 5% вмкп СО2 у середовищГ культивування 1гла, модифiкованого Дюльбекко Гз додаванням 15% фетально! сироватки бичшв та 1% антибютика-антимГкотика. Середовище культивування змГнювали 2-3 рази на тиждень. Отримували культуру мезенхГмальних стовбурових клгган 2-го, 7-го та 12-го пасажгв, проводили дослщження рГвня анеупло-!дп, розподш клгган за фазами клгганного циклу методом проточно! цитофлуориметрп (Nicoletti et al., 1991) та визначали морфологгю клгган. До осаду кль тин рГзних пасажгв у шлькосл 1 х106 на пробу додавали 300 мкл Тритон Х-100, який забезпечуе руйну-вання клгганно! мембрани, 200 мкл фосфатно-буферного розчину, 10 мкл рибонуклеази, яка роздь ляе нитки ДНК, та 15 мкл Р1 (пропщй юдгду), що вибГрково зв'язуеться з ДНК (уа реагенти фГрми «Sigma Chemical Co», USA). Шсля обережного стру-шування компоненти нуклеарно! суспензи шкубували за 22-25 °С впродовж 30 хв у темрявг Для оцшки дольового вмГсту клгган в основних фазах клгганного циклу (G0/Gi, S, G2+M) пстограми розподшу оброб-ляли за допомогою спещалГзовано! математично! програми Mod Fit LT 2.0 (BDIS, США) для комп'ютерГв Macintosh. Реестрацш даних виконували на проточному цитометрГ FACS Calibur («Becton
Dickinson», США) Гз застосуванням вузькосмужково-го фГльтра 585/42 нм для вимГрювання флуоресценци Р1. З кожного зразка нуклеарно! суспензи аналГзу тдлягало 10000 подш. Визначали показники: кшь-кгсть дипло!дних i анеуплощних клгган у зразках, розподш клгган кожно! популяци за фазами клгганно-го циклу G0/Gi, S, G2/M.
Для дослщження шльшсних результапв досль дження визначали значення середнього (М) i помилку середнього (m). Для порГвняння середшх показнишв дослщжуваних груп визначали параметричний t-критерш Стьюдента, здшснювали одно факторний дисперсшний аналГз.
Результати та Тх обговорення
Для отримання МСК з жирово! тканини собак за-стосовували методику експланта у нашш модифшацп. МатерГалом експланта слугував абдомшальний жир собак вшом до 12-ти мюящв, який вгдбирали у стери-льних умовах шд час виконання планових операцш. Жирову тканину тричГ промивали фосфатно-буферним розчином i переносили у шший стерильний посуд. Первинний матерГал тддавали мехашчнш дезагрегаци i розмГщували у культуральних чашках. У культуральний посуд вносили середовище для культивування DMEM, 15% фетально! сироватки бичшв (FBS), 1% антибютика-антимшотика. Культуральш чашки з експлантом абдомшально! жирово! тканини культивували за стандартних умов у СО2 шкубаторГ за температури 37 оС.
Морфолопчно клггани 2-го пасажу мали фГброб-ластоподГбну морфолопю, культура кл1тин була однородною. На 7-му пасаж1 фГбробластоподГбна мор-фолопя клгган залишалась сталою. На 12-му пасаж окремГ клггани культури набували морфолопчних змш - в них з'являлися додатковГ вщростки.
АналГз показникгв, отриманих за проточно! цито-метри дав можливГсть оцшити розподш клгган культур за рГзних пасажгв за фазами клгганного циклу, оцшити !х рГвень генетично! стабГльносп. Встановле-но, що за умов культивування вщбувалися вГропдш змши у розподш популяци клгган на дипловдш та анеупловдш, а також за фазами клгганного циклу.
Ранш пасажг культури МСК з жирово! тканини характеризуются високим вмГстом дипло!дних клгган, шльшсть яких становить на 2-му пасажг 98,45 ± 0,39% (табл. 1). РГвень анеуплогдних клгган на 2-му пасажг низький Гз показником 1,55 ± 0,43% (табл. 2). Це за-свгдчуе сталГсть карютипу клгган, що культивуються на раншх пасажах. Серед дипло!дних клгшн за розпо-дшом за фазами клгганного циклу ми бачимо високий показник пролГферативного пулу G2/M + S, який становить 25,51 + 3,56% (табл.1).
Пресинтетичний перюд G0/G 1 характеризуеться перевагою анаболГчних процесГв у клгганах, якг за-безпечують збГльшення маси тсля подшу, анатомГчне та функцГональне вгдновлення органел, збГльшення карГолеми, посилення процесГв транскрипцГ!, трансля-цГ!, синтезу тригерних бГлкгв, активаторГв S фази кль тинного циклу.
HayKobnñ вкник ЛHУBMБ iмeнi С.З. Тжи^^го, 2017, т 19, № 78
Тaблuця 1
Вмкт диптовдв та рoзпoдiл мeзeнхiмальних cтoвбурoвих клiтин з жирoвoï тканини за фазами кл^иншго
naca»: Bмicт диплoïдiв G0/G1 S g2/m g2/m+s
2-й 98,45 ± 0,39 70,49 ± 3,17 20,58 ± 1,94 8,93 ± 1,63 29,51 ± 3,56
7-й 98,28 ± 0,56 73,52 ± 5,01 17,43 ± 0,91 9,05 ± 1,16 26,15 ± 0,29
12-й 96,51 ± 0,38* 81,07 ± 0,61* 13,42 ± 0,82* 5,51 ± 0,52 18,93 ± 0,66*
Примiткa: * - Р < 0,05 - пoрiвнянo з пoкaзникaми 2-ro пacaжy.
Зaвдяки цим бшкш клiтинa прoxoдить тoчкy рecт-рикци R i cпрямoвyeтьcя y S горазд. Bмicт диплoïдниx клiтин y G0/G1 фaзi cтaнoвить 70,49 ± 3,17%.
Сeрeд aнeyплoïдiв y G0/G1 фaзi зaрeecтрoвaнo 87,35 ± 1,29, a шгазник прoлiфeрaтивнoгo пулу G2/M + S cтaнoвить 12,65 ± 1,02% (тaбл. 2). TaKi дaнi вкaзyють нa зaтримкy aнeyплoïдниx клгган y фaзi рeпрoдyктивнoгo cпoкoю G0.
Ha 7-му пacaжi кyльтивyвaння MCK з жирoвoï ткaнини ми бaчимo,щo кiлькicть диплoïдниx клiтин
зaлишaeтьcя ra тoмy caмoмy рiвнi, a тaкoж рoзпoдiл клiтин зa фaзaми клiтиннoгo циклу нe мae дocтoвiр-нт змiн. Отримaнi дaнi дaють пiдcтaвy зрoбити ви-cнoвoк, щo y кyльтyрi клiтин з жирoвoï ткaнини нa 7-му пacaжi те з'являютьcя oзнaки змiн, пoв'язaниx з бioлoгiчним вiкoм клiтин тa впливу нa ниx рeaгeнтiв пiд чac кyльтивyвaння. Тoбтo збeрiгaютьcя вci oзнaки якicнoï культури клiтин i ïï мoжнa зacтocoвyвaти для трaнcплaнтaцiï.
Тaблuця 2
PiBeHb а^ул^тов та рoзпoдiл мeзeнхiмальних cтoвбурoвих клiтин з жирoвoï тканини за фазами клЬ
Пacaж Bмicт клГтин G0/G1 S g2/m g2/m+s
2-й 1,55 i 0,43 87,35 i 1,29 8,74 i 0,47 3,91 i 0,58 12,65 i 1,02
7-й 1,72 i 0,19 86,37 i 0,93 8,12 i 0,72 5,43 i 0,57 13,55 i 0,31
12-й 3,49 i 0,38* 88,31 i 0,69 9,43 i 0,62 2,26 i 0,18 11,69 i 1,12
Примпта: * - Р < 0,05 - пoрiвнянo з пoкaзникaми 2-fo naca:®y.
Зoвciм iншy кaртинy ми бaчимo нa 12-му пacaжi кyльтивyвaння. Bмicт диплoïдниx клiтин в кyльтyрi зaлишaeтьcя нa виcoкoмy рiвнi, aлe дocтoвiрнo змeн-шyeтьcя вГд тaкoгo нa 2-му пacaжi кyльтивyвaння. Фaзa cпoкoю G0/G1 xaрaктeризyeтьcя дocтoвiрним пiдвищeнням пoкaзникa вмicтy клiтин нa 10,58%. S фaзa рeплiкaцiï ДHK тa cинтeзy гicтoнiв зa 12-ro пacaжy xaрaктeризyeтьcя дocтoвiрним знижeнням пoкaзникa кiлькocтi диплoïдниx клiтин нa 7,38% шрь внянo з 2-им пacaжeм.
Bмicт диплoïдниx клiтин прeмiтoтичнoï i мгготич-нoï фaзи G2/M нa 12-му пacaжi змeншyeтьcя нa 3,42% y мeжax тeндeнцiï, щo xaрaктeризye знижeння прoлi-фeрaтивнoï aктивнocтi культури. Зa диcпeрciйним aнaлiзoм кiлькicть пacaжiв чинить стльний вплив нa вмicт клгган прoлiфeрaтивнoгo пулу G2/M+S y культура Пoкaзник cили впливу пacaжyвaння нa вмicт клiтин прoлiфeрaтивнoгo пулу G2/M+S в кyльтyрi cтaнoвить ^2x= 70% (при Р < 0,05).
Юльисть aнeyплoïдниx клiтин дocтoвiрнo зрocтae дo 3,49 ± 0,38%. Сeрeд aнeyплoïдниx клiтин 12-ro пacaжy, зaгaльнa кiлькicть якиx зрocтae в ^o^ci кyльтивyвaння, вмicт клiтин G0/G1 пулу пiдвищyeтьcя в мeжax тeндeнцiï. Bмicт клiтин прoлiфeрaтивнoгo пулу G2/M+S, гавгаки, знижyeтьcя в мeжax тeндeнцiï. Ha гашу думку да пoв'язaнo з oбмeжeнням нeрeгy-льoвaнoгo рoзмнoжeння клгган зaвдяки дй' стиму-люючoгo фaктoрa нa рГвш тoчки рecтрикцiï R при пeрexoдi клгган з фaзи cпoкoю G0/G1 дo S шрюду.
Отжe, ми бaчимo щo га 12-му пacaжi культиву-вaння культури MCK з жирoвoï ткaнини з'являютьcя пeршi oзнaки змши бioлoгiчнoгo CTany клгган, як1 нeoбxiднo врaxoвyвaти при трaнcплaнтaцiï.
Biiciiobuii
1. Дocлiджeння кл^интого циклу мeзeнxiмaльниx cтoвбyрoвиx клгган з жирoвoï ткaнини coбaки зa рГз-ниx пacaжiв кyльтивyвaння e iндикaтoрoм бioлoгiчнo-ro cтaнy культури.
2. Paннi пacaжi MCK з жирoвoï ткaнини xaрaктe-ризyютьcя фiбрoблacтoпoдiбнoю мoрфoлoгieю, виш-ким вмicтoм диплoïдниx клгган прoлiфeрaтивнoгo пулу G2/M + S, низьким рiвнeм aнeyплoïдiï.
3. Kлiтини культури 7-ro пacaжy збeрiгaють фГб-рoблacтoпoдiбнy мoрфoлoгiю i нe зaзнaють дocтoвiр-ниx змш y рoзпoдiлi зa фaзaми клiтиннoгo циклу тa рiвнeм aнeyплoïдiï, щo зacвiдчye збeрeжeння бioлoгiч-ниx влacтивocтeй культури.
4. У культурГ мeзeнxiмaльниx cтoвбyрoвиx клгган з жирoвoï ткaнини 12-ro пacaжy рeecтрyютьcя бioлo-пчш змши - шршГ oзнaки рeплiкaтивнoгo cтaрiння. Kyльтyрa xaрaктeризyeтьcя вжюким вмicтoм клгган прoлiфeрaтивнoгo пулу G2/M+S, aлe дocтoвiрнo ниж-чим вГд тaкoгo 2-ro пacaжy i cтaнoвить 18,93 ± 0,66% ycix диплoïдниx клгган. Kiлькicть aнeyплoïдiв дocтo-вiрнo пiдвищyeтьcя i cтaнoвить 3,49 ± 0,38%. Фaзa cпoкoю G0/G1 xaрaктeризyeтьcя дocтoвiрним збшь-шeнням кiлькocтi диплoïдниx клгган дo 81,07 ± 0,61%.
5. Пoкaзник стли впливу прoцecy кyльтивyвaння нa вмют диплoïдниx клгган прoлiфeрaтивнoгo пулу G2/M+ S в культурГ cтaнoвить ^2x= 70% (при Р < 0,05).
nepcne^ueu тдальшш дocлiджень будуть cпря-мoвaнi нa визнaчeння ocoбливocтeй клiтиннoгo циклу культури мeзeнxiмaльниx cтoвбyрoвиx клгган з кicт-кoвoгo мoзкy coбaк зa рiзниx пacaжiв кyльтивyвaння.
HayKOBHH BicHHK ^HyBME iMeHi C.3. I^H^Koro, 2017, t 19, № 78
eis^iorpa^inm iiocii. lanim
Marx, C., Silveira, M.D., Selbach, I., da Silva, A.S., Braga, L.M., Camassola, M., Nardi, N.B. (2014). Acupoint injection of autologous stromal vascular fraction and allogeneic adipose-derived stem cells to treat hip dysplasia in dogs. Stem Cells. 2014:391274.
Haghighat, A., Akhavan, A., Hashemi-Beni, B., Deihimi, P., Yadegari, A. (2011). Adipose derived stem cells for treatment of mandibular bone defects: An autologous study in dogs. Dent. Res. J. 8(1), 1-7.
Volk, S., Theoret, C. (2013). Translating stem cell therapies: the role of companion animals in regenerative medicine. Wound Repair Regen. 3, 382-394.
Kathrine, K.J., Christian, G., Jensen, D.H., FischerNielsen, A., Hjuler, T., von Buchwald, C. (2017). Mesenchymal stem cell therapy for laryngotracheal stenosis: A systematic review of preclinical studies. PLOS ONE 21 Sep 2017
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0185283
Arnhold, S., Wenisch, S. (2015). Adipose tissue derived mesenchymal stem cells for musculoskeletal repair in veterinary medicine. Am. J. Stem Cells. 4(1), 1-12.
Reich, C., Raabe, O., Wenisch, S., Bridger, P., Kramer, M., Arnhold, S. (2012). Isolation, culture and chon-drogenic differentiation of canine adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells a comparative study. Vet. Res. Commun. 2, 139-148.
Dmitrieva, R.I., Minullina, I.R., Bilibina, A.A., Tarasova, O.V., Anisimov, S.V., Zaritskey, A.Y. (2011). Bone marrow- and subcutaneous adipose tissue-derived
mesenchymal stem cells: Differences and similarities. Cell Cycle. 11(2), 377-383.
Zhang, Z.X., Guan, L.X., Zhang, K., Wang, S., Cao, P.C., Wang, Y.H., Wang, Z., Dai, L.J. (2007). Cytogenetic analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged in vitro. Cell Biol. Int. 31(6), 64, 5-8.
Kladnytska, L.V., Mazurkevych, A.Y., Velychko, S.V., Zhyhunova, O.V. (2016). Otrymannia kultury stovbu-rovykh klityn iz zhyrovoi tkanyny sobaky. Visnyk Sumskoho natsionalnoho ahrarnoho universytetu. Se-riia «Veterynarna medytsyna». 6(38), 19-24 (in Ukrainian).
Kladnytska, L.V., Mazurkevych, A.I., Velychko, S.V. (2016). Patent Ukrainy na korysnu model №109148.Sposib otrymannia mezenkhimalnykh stovburovykh klityn iz zhyrovoi tkanyny sobaky; zaiavnyk i vlasnyk Natsionalnyi universytet bioresur-siv i pryrodokorystuvannia Ukrainy. № u201602329; zaiavl. 11.03.2016; opubl. 10.08.2016, Biul. № 15 (in Ukrainian).
Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M.C. (1991). A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J. Immunol. Methods. 139(2), 271-280.
Received 5.09.2017 Received in revised form 26.09.2017 Accepted 2.10.2017
