CC BY
154
ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ ИЗ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА
© Гашникова Н.М.*, Косогова Т.А.*, Пучкова Л.И.¥, Балахнин С.М.А, Теплякова Т.В."
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская область, п. Кольцово
Базидиальные грибы являются перспективными продуцентами для разработки препаратов против вируса иммунодефицита человека. Наиболее эффективными, по результатам настоящего исследования, были экстракты грибов из родов Inonotus, Lentinus и Pleurotus. Индекс селективности водного экстракта гриба Inonotus obliquus (IS50) превышает 19000, а 10 % раствора аптечного препарата «Бефунгин», содержащего 30-32 % экстрактивных веществ чаги, равен 20533.
В последнее десятилетие значительно возрос интерес к исследованию биологически активных метаболитов грибов-базидиомицетов с целью создания лекарств на основе природных веществ. Известно, что базидиальные грибы, многие из которых являются съедобными, содержат широкий спектр различных биологически активных компонентов - полисахариды, органические кислоты, липиды, стероидные вещества, тетрациклические тритерпены и другие соединения, проявляющие противоопухолевую, ан-тибластическую активность, цитостатическое действие и противовирусный эффект. Класс базидиальных грибов включает свыше 15 тыс. видов, более 100 видов используются в традиционной медицине Китая, Кореи, Японии и других юго-восточных стран [1]. Выявлены некоторые природные соединения грибов, оказывающие ингибирующее действие на вирус иммунодефицита человека. Известны данные о подавлении ВИЧ-1 экстрактом гриба Trametes versicolor, содержащим полисахаридпептиды [2]. Аналогичные результаты получены с экстрактами гриба Grifola frondosa, действующим началом которого является глюкан [3]. Имеются научные сведения об антивирусной активности съедобного гриба шиитаке - Lentinus edodes в отношении ВИЧ-1. Этот гриб широко применяется в медицинских целях в Юго-Восточной Азии. Полисахарид лентинан, образующийся в клеточных
* Заведующий отделом, доктор биологических наук.
* Младший научный сотрудник. " Ведущий научный сотрудник.
* Старший научный сотрудник.
* Заведующий лабораторией, доктор биологических наук, профессор.
стенках гриба, обладает иммуномодулирующим, антибактериальным и антивирусным свойствами. Известно применение экстракта мицелиальной культуры гриба Fuscoporia oblique (Fr.) Aoshima, выращенного на искусственной жидкой питательной среде, в качестве активного компонента, ингиби-рующего вирус иммунодефицита человека [4]. Описано также применение экстракта черной наружной части склероция этого же гриба в качестве активного ингредиента, ингибирующего вирус иммунодефицита человека [5].
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» располагает собственной коллекцией бази-диальных грибов, отработанными методами их культивирования и вирусологической базой, позволяющей проводить поиск эффективных в отношении ряда вирусов препаратов.
Цель наших исследований заключалась в проверке противовирусной активности водных экстрактов базидиальных грибов в отношении ВИЧ-1.
Материалы и методы исследования
Объектами исследования служили виды и штаммы высших базидиальных грибов из следующих родов: Ganoderma, Lentinus, Pleurotus, In-onotus, Laetiporus, Volvariella.
Мицелий гриба Ganoderma lucidum (образец 07-03), полученный путем стационарного культивирования на жидкой питательной среде, подвергали механохимической обработке и получали водный экстракт путем смешивания сухого порошка с водой (1 : 10).
Образцы из гриба Lentinus edodes получены путем культивирования гриба в течение 60 суток в стационарных условиях на жидкой среде (образец 46/2) и на качалке в течение 20 суток при 180 об/мин (образец 52). Измельченную биомассу грибов суспендировали в воде (1 : 5) и обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут, после чего центрифугировали.
Образцы вешенки (Pleurotus) были получены путем выращивания культур на пептонно-кукурузном агаре, с наложением стерильного целлофана на его поверхность, в течение 3-х недель (образцы 07-09, 07-10, 07-12). Для экстрагирования БАВ измельченную сухую биомассу смешивали с водой (1 : 4) и подвергали воздействию ультразвука в течение 10 минут, после чего центрифугировали для освобождения от осадка.
Образцы чаги Inonotus obliquus получены из аптечного сырья путем суспендирования измельченного гриба в воде в соотношении 1 : 20. Образец 07-05 готовили без нагревания водной суспензии, а 08-10 - путем прогревания на водяной бане в течение 20 минут. Образец 07-45/1 содержал большую концентрацию чаги (соотношение с водой 1 : 4) и также подвергался нагреванию в течение 20 минут.
«Бефунгин» (образец 08-08) представлял собой готовый аптечный препарат из чаги, содержащий 30-32 % экстрактивных веществ чаги. Был приготовлен 10 % водный раствор из данного препарата.
Образец из Laetiporus sulphureus (08-09) был получен из свежего замороженного плодового тела путем смешивания биомассы с водой (1:2) и прогревания в течение 30 мин на водяной бане.
Образец из Volvariella volvacea (07-34/1) был получен из 2-х недельной культуры на жидкой среде путем поверхностного выращивания. Высушенную биомассу растирали и смешивали с водой (1 : 10), затем прогревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа.
Исследование противовирусной активности экстрактов грибов в отношении ВИЧ-1 проводили на перевиваемой линии лимфоцитов человека МТ-4. Клетки инфицировали ВИЧ-1 штамм ГКВ 4046 с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку.
Токсичность экстрактов исследовали методом прижизненного окрашивания клеток МТТ [6]. Определяли концентрацию вещества, не оказывающую токсического действия на клетки МТ-4.
Профилактическое действие экстрактов оценивали по подавлению ви-руспродукции в клетках МТ-4 при добавлении препарата при адсорбции вируса. Терапевтическое действие экстрактов оценивали по подавлению продукции ВИЧ-1 в клетках МТ-4 при добавлении препаратов грибов после адсорбции вируса на поверхности клетки. Контролями служили неин-фицированные клетки МТ-4; инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-4 без добавления препаратов; в качестве положительного контроля препарата в экспериментах использовали азидотимидин (AZT). Планшеты инкубировали при 37 °С в атмосфере 5 % СО2 в течение 3-х суток.
Анти-ВИЧ активность экстрактов оценивали по изменению накопления вирусного белка р24 в контрольных и опытных образцах количественным определением р24 методом прямого иммуноферментного анализа с использованием тест-системы «ВектоВИЧ-1 р24-антиген-подтверждаю-щий тест ФСП 42-0117-5686-04» (Вектор-Бест, Россия). Определяли 50 % и 100 % ингибирующие концентрации исследуемых препаратов (1С50, Юн»). Индекс селективности (18) рассчитывали по соотношению СС50 к 1С50 для каждого независимого эксперимента. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами [7].
Результаты исследования и обсуждение
В табл. 1 представлены характеристики экстрактов базидиальных грибов, исследованных в данной работе. Анализ цитотоксичности образцов, проведенный на культуре лимфобластоидной линии клеток человека МТ-4, показал, что диапазон концентраций экстрактов, токсичный для 50% клеток, варьирует от 0,0058 до 0,616 мг/мл (табл. 1).
В табл. 2 приведены результаты оценки антиретровирусной эффективности экстрактов базидиальных грибов. Анализ полученных данных показывает, что наибольшую эффективность в отношении ВИЧ-1 проявили образцы из чаги Inonotus obliquus.
Таблица 1
Содержание сухих веществ в экстрактах, полученных из базидиальных грибов. Цитотоксические характеристики исследуемых образцов
Род грибов Исследуемый образец Содержание сухого вещества в экстракте, г/мл *Нетоксичная концентрация экстракта, мг/мл
СС50 СС100
Pleurotus 07-09 2,5 ± 0,06 0,025 ± 0,007 0,004 ± 0,001
07-10 3,5 ± 0,07 0,044 ± 0,009 0,010 ± 0,003
07-12 2,4 ± 0,11 0,060 ± 0,011 0,008 ± 0,005
08-04 1,5 ± 0,09 0,075 ± 0,023 0,002 ± 0,001
Lentinus 08-06 2,3 ± 0,05 0,115 ± 0,034 0,004 ± 0,002
52 3,2 ± 0,07 0,160 ± 0,069 0,040 ± 0,013
Ganoderma 07-03 5,0 ± 0,11 0,0078 ± 0,002 0,008 ± 0,005
Laetiporus 08-09 5,0 ± 0,09 0,0503 ± 0,009 0,008 ± 0,002
Inonotus 07-05 3,7 ± 0,05 0,0058 ± 0,009 0,006 ± 0,001
07-45/1 15,2 ± 0,11 0,380 ± 0,0162 0,050 ± 0,018
08-08 19,7 ± 0,14 0,616 ± 0,0490 0,206 ± 0,058
08-10 10,0 ± 0,07 0,125 ± 0,0130 0,031 ± 0,009
Volvariella 07-34/1 5,0 ± 0,06 0,25 ± 0,0052 0,060 ± 0,014
Примечание: * СС50, СС10о, цитотоксическая концентрация, при которой клетки сохраняют 50 % и 100 % жизнеспособность, результат трех независимых экспериментов.
Готовый аптечный препарат «Бефунгин» (образец 08-08), который представляет собой концентрированный водный экстракт (30-32 %) с добавлением солей кобальта, имея самое высокое содержание экстрактивных веществ, оказывал выраженный ингибирующий эффект на ВИЧ-1 как при одновременном внесении с вирусом в культуру клеток, так и при внесении его после инфицирования культуры. Этот же образец обладает наибольшим терапевтическим диапазоном концентраций и наивысшим индексом селективности из всех исследованных образцов. Близкие характеристики противовирусной эффективности имеет 25 % экстракт Inonotus obliquus (образец 0745/1), полученный путем прогревания водной суспензии чаги на водяной бане. Данный образец обладает низкой токсичностью и, соответственно, широким терапевтическим диапазоном, высоким индексом селективности. Образцы чаги, содержащие меньшую концентрацию вещества, либо приготовленные без прогревания (08-10, 07-05), показали более слабую эффективность в отношении ВИЧ-1.
Образцы, полученные из Lentinus edodes, также характеризовались достаточно высокой активностью в отношении подавления репродукции ВИЧ-1. Образец 52, полученный из биомассы 20-суточного глубинного мицелия гриба шиитаке edodes, 3760), при относительно низкой токсичности для клеток имеет индекс селективности 3200, тогда как 1850 образца 46/2 (биомасса гриба выращена на поверхности жидкой среды) составляет 1643.
Таблица 2
Антиретровирусная эффективность экстрактов высших базидиальных грибов, определенная на модели культуры клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1
Род грибов Исследуемый образец Профилактическая анти-ВИЧ эффективность экстракта Терапевтическая анти-ВИЧ эффективность экстракта
*1С50, мкг/мл **Й50 *1С50, мкг/мл **^50
Pleurotus 07-09 0,04 ± 0,01 625 ± 87 0,08 ± 0,02 313 ± 82
07-10 0,11 ± 0,03 400 ± 104 0,11 ± 0,01 400 ± 46
07-12 0,08 ± 0,01 750 ± 95 н.о. н.о.
08-04 0,19 ± 0,04 395 ± 56 н.о. н.о.
Lentinus 08-06 0,07 ± 0,02 1643 ± 509 0,14 ± 0,03 821±164
52 0,05 ± 0,01 3200±651 0,10 ± 0,02 1600±388
Ganoderma 07-03 0,78 ± 0,14 10 ± 2 0,78 ± 0,09 10 ± 2
Laetiporus 08-09 0,62 ± 0,02 81 ± 6 н.о. н.о.
Inonotus 07-05 0,06 ± 0,01 97 ± 15 0,12 ± 0,05 48 ± 23
07-45/1 < 0,02 >19000 0,09 ± 0,02 4222 ± 967
08-08 < 0,03 > 20533 0,03 ± 0,01 20533 ± 780
08-10 < 0,08 > 1562 0,16 ± 0,01 781±107
Volvariella 07-34/1 1,56 ± 0,90 160 ± 54 6,25 ± 1,23 40 ± 8
Примечание: * 1С50, ингибирующая концентрация исследуемого препарата, вызывающая 50 % подавление прироста вирусспецифического белка р24 при внесении в культуру клеток вируса и препарата, результат трех независимых экспериментов;
** 18 индекс селективности рассчитывали как соотношение СС50 к 1С50 для каждого независимого эксперимента; н.о. - не определено.
Большая часть исследованных в работе экстрактов высших базидиальных грибов обладает способностью подавлять репликацию ВИЧ-1 на модели острой инфекции, чувствительной к вирусу культуры клеток. Необходимо отметить, что экстракты Inonotus obliquus, показавшие наибольшую активность в отношении ингибирования репродукции ВИЧ-1, содержали не менее 10 мг/мл сухого вещества в образце (образцы 07-45/1, 08-08, 08-10). Препараты Inonotus obliquus с более низкой концентрацией активных веществ были менее эффективны против ВИЧ-1. Возможно, выбранная нами концентрация экстрактов для изучения других видов грибов, является недостаточной для полноценного проявления их противовирусной активности. Проведенные исследования также выявили, что на цитотоксичность и противовирусные свойства экстрактов, полученных из базидиальных грибов, значительно влияют как способы их культивирования, так и способы экстрагирования из грибов биологически активных веществ. Так, образец 07-05 был приготовлен без нагревания водной суспензии, а 08-10 и 0745/1 - путем прогревания на водяной бане в течение 20 минут. Концентрация сухого вещества в экстрактах 08-10 и 07-45/1 была больше, чем в образ-
це 07-05 (в 2,7 и в 4,1 раза, соответственно), тем не менее, наблюдалась обратная зависимость, с увеличением концентрации экстрактов их токсичность понижалась (в 21,6 и в 65,5, соответственно).
Образец 52 из L. edodes, полученный из биомассы гриба глубинной культуры, обладал более высокими противовирусными свойствами, чем образец 46/2, биомасса которого была выращена на поверхности культу-ральной среды. Аналогичные данные были получены в результате исследований ряда дереворазрушающих грибов (Lentinus, Ganoderma), показывающие, что по содержанию некоторых активных компонентов, в том числе полисахаридов, глубинный мицелий значительно превосходит даже плодовые тела грибов [8].
Из других исследованных экстрактов грибов интересны образцы из рода Вешенка (Pleurotus). Грибы данного рода представляют пищевую ценность и культивируются во многих странах мира. Все исследованные виды вешенки проявляют анти-ВИЧ активность. Из результатов исследований других авторов известно, что четыре вида вешенки, в том числе Pl. djamor и Pl. Ostreatus, обладали антимикробной активностью, а из гриба Р^т-Ш ostreatus (вешенка устричная) был выделен убиквитинподобный глико-протеин, который проявлял активность против обратной транскриптазы ВИЧ-1 [9]. Среди испытанных нами видов наиболее широкое распространение в природе, в том числе, и в Сибири, представляет вешенка Р^т-^ ostreatus. Это делает возможным поиск штаммов, которые по противовирусной эффективности не будут уступать другим видам вешенки, как, например, Р1. eryngii (образец 07-09) и Р1. djamor (образец 07-12), проявившим
в данном исследовании наиболее высокие показатели в отношении ВИЧ-1.
* * *
Несмотря на большое количество разработанных в настоящее время ан-ти-ВИЧ препаратов, существует проблема эффективности и доступности противовирусных лекарственных средств. Наиболее серьезные проблемы -это токсичность эффективных препаратов и их высокая стоимость. Кроме того, к большинству применяемых химически синтезированных лекарственных средств ВИЧ-1 способен вырабатывать устойчивость. Поэтому крайне актуальной остается проблема разработки эффективных и недорогих противовирусных средств, не обладающих токсическим действием на организм человека и характеризующихся высоким барьером к развитию устойчивости ВИЧ-1.
В данной работе продемонстрирована высокая антиретровирусная активность гриба Inonotus obliquus, что, возможно, связано с его сложным биохимическим составом, главную роль в котором играет полифенолкар-боновый комплекс (ПФК), включающий также меланины, гуминовые кислоты [10].
Выявлена перспективность использования для разработки антиретро-вирусных средств биологически активных веществ гриба шиитаке (Lenti-nus edodes), так как даже при низких концентрациях экстракт на основе мицелия шиитаке показал высокий индекс селективности.
Эффективность и безопасность препаратов на основе базидиальных грибов в большой мере зависит от способа экстрагирования, фракционирования и очистки активных компонентов.
Проведенные исследования показали, что высшие базидиальные грибы являются перспективным источником для поиска и разработки эффективных, безопасных и экономически доступных препаратов для профилактики и лечения ВИЧ-инфекции.
Список литературы:
1. Белова Н.В. Перспективы использования биологически активных соединений высших базидиомицетов в России // Микология и фитопатология. - 2004. - Т. 38, Вып. 2. - С. 1-7.
2. Collins R.A. and Ng T.B. Polysaccaropeptide from Trametes versicolor has potential for use against human immunodeficiency virus type 1 infection // Life Scince. - 1997. - V 60, N 25. - P. 383-387.
3. Nanba H., Kodama N., Schar D., and Turner D. Effect of Maitake (Grifola frondosa) glucan in HIV-infection patients // Mycoscience. - 2000. - V. 41.
- P. 293-295.
4. Патент США № 20040105859, МПК А61 35/78, опубл. 03.06.2004 г.
5. Патент Японии № 9191891, МПК A61K35/84, С 12Р 1/02, опубл. 29.07.1997 г.
6. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J Immunol Methods. -1983. - V 65, N 1-2. - P. 55-63.
7. Зайцев Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной биологии. - М.: Наука, 1984. - 424 с.
8. Бабицкая В.Г., Щерба В.В. Углеводы глубинного мицелия ксило-трофных базидиомицетов // Прикладная биохимия и микробиология. -2004. - Т. 40, № 6. - С. 634-638.
9. Wang H.X. and Ng T.B. Isolation of a novel ubiquitin-like protein from Pleurotus ostrestus mushroom with anti-human immunodeficiency virus, translation-inhibitory and ribonuclease activities // Biochem Biopnys Res Commun.
- 2000. - V. 256. - P. 587-593.
10. Кукулянская Т.А., Курченко Н.В., Курченко В.П., Бабицкая В.Г. Физико-химические свойства меланинов, образуемых чагой в природных условиях и при культивировании // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38, № 1. - С. 68-72.
