CC BY
80
3. Яковлева В.И., Трофимова Е.К., Давидович Т.П., Просверяк Г.П. Диагностика, лечение и профилактика стоматологических заболеваний. - Мн.: Высшая школа, 1994.
ОТБОР ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СОЕДИНЕНИЙ СРЕДИ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
© Теплякова Т.В.*, Канаева О.И.Ф, Косогова Т.А.*, Костина Н.Е.а, Бардашева А.В.*, Трошкова Г.П.У
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская область, п. Кольцово
Показан цитотоксический эффект экстрактов из грибов в отношении клеток эпидермальной карциномы гортани Hep-2.
Тысячелетия дикорастущие грибы применяются в народной медицине различных стран. Научные исследования показали, что грибы содержат биологически активные вещества, такие как полисахариды, гликопротеины, терпены, стеролы, пигменты и др., которые могут проявлять антибактериальные, антивирусные, противоопухолевые, антипаразитарные и иммуно-модулирующие свойства. Класс базидиальных грибов включает свыше 15 тыс. видов, более 100 видов используются в традиционной медицине Китая, Кореи, Японии и других юго-восточных стран [2]. В Японии выпускают препараты, полученные из плодовых тел высших базидиомицетов, которые составляют около 30 % рынка онкостатиков и иммунокорректоров. Наиболее известные из них: лентинан (из Lentinus edodes), PSP и PSK (из Trametes versicolor), сонифилан (из Schizophyllum commune), ганодеран (из Ganoderma lucidum), плевран (из Pleurotus ostreatus), грифолан (из Grifola frondosa). Цитотоксические, противоопухолевые и иммуномодулирующие свойства экстрактов из базидиальных грибов связаны, главным образом, с полисахаридами - ß-D-глюканами - ксилозой, галактозой, маннозой, глюку-роновой кислотой и другими сахарами. Все главные таксономические группы грибов исследовались на наличие полисахаридов. Более 600 видов содержали противоопухолевые и иммуномодулирующие полисахариды [20, 24, 25].
Полисахариды и их комплексы с белками рассматривают как новый тип противоопухолевых соединений. В отличие от средств химиотерапии, эти ве-
* Заведующий лабораторией, доктор биологических наук, профессор.
* Аспирант, старший лаборант-исследователь. " Младший научный сотрудник.
* Старший научный сотрудник, кандидат химических наук.
* Аспирант, стажер-исследователь. у Заведующий лабораторией.
щества не токсичны, а их действие основано на повышении иммунитета. Показано, что экстракты и полисахариды значительно повышают выработку цитоки-нов Т-клетками и макрофагами, индуцируют экспрессию фактора некроза опухоли in vitro и in vivo, увеличивают фагоцитарную активность нейтрофилов человека. Возможно, полисахариды, в частности, ß-D-глюканы, могут связываться со специфическими рецепторами поверхности лимфоцитов, приводя к увеличению активности макрофагов, Т-лимфоцитов, клеток-киллеров [1, 17, 25].
Многие исследователи отмечают связь противоопухолевой и противовирусной активностей экстрактов и соединений из грибов. Так, полисахарид лентинан из Lentinus edodes, который был открыт как противоопухолевый препарат, проявляет антивирусную активность в отношении вируса везикулярного стоматита, энцефалита, вируса Абельсона, аденовируса 12 типа, вируса гриппа типа А, вируса иммунодефицита человека [23, 25].
У известных противоопухолевых полисахаридов PSK и PSP, выделенных из Trametes vesicolor, in vitro обнаружены антивирусные свойства в отношении ВИЧ и цитомегаловируса [14, 18]. Из Schizophyllum commune выделен полисахарид шизофиллан, проявляющий противоопухолевые и противовирусные свойства [21].
Недавно вышла обзорная статья, в которой проанализированы литературные данные о биологической активности полисахаридов, выделенных из культуральной жидкости, мицелия и плодовых тел базидиальных грибов [7]. Из четырнадцати представленных видов у восьми отмечен противоопухолевый и одновременно противовирусный эффект. Авторы полагают, что механизм такой активности может быть связан с предотвращением адсорбции вируса на клетках, с блокированием вирусных ферментов, необходимых для синтеза нуклеиновых кислот, повышением клеточного иммунитета.
Исследовались водные и метанольные экстракты одного из самых известных противоопухолевых грибов Ganoderma lucidum в отношении вируса простого герпеса и вируса везикулярного стоматита. Исследование состава экстрактов, ингибировавших цитопатический эффект показало, что основными компонентами являются полисахариды (40,6 %) и белок (7,8 %) [15, 16, 19].
Препараты на основе грибов обладают низкой токсичностью, что дает им неоспоримые преимущества. Поиск новых продуцентов противоопухолевых и противовирусных соединений из базидиальных грибов является актуальной задачей для развития медицинской биотехнологии.
Лесные экосистемы на юге Западной Сибири богаты грибами, в том числе и лекарственными видами [3], среди которых имеются перспективные виды и штаммы, проявляющие противоопухолевый и противовирусный эффект.
Цель исследований
Оценка противоопухолевой активности грибов в клеточной культуре Hep-2 (эпидермальная карцинома гортани).
Объекты и методы исследований
Для исследований использовали виды и штаммы грибов, выделенные нами в культуру из местообитаний Западной Сибири.
Водные экстракты готовили из измельченных плодовых тел и мицелиаль-ной биомассы путем смешивания в разных пропорциях с водой и прогреванием суспензии на водяной бане от 20 минут до 6 часов. В полученных экстрактах определяли сухие вещества (мг/мл). Для выделения суммарной полисаха-ридной фракции экстракты обрабатывали 96 %-ным этанолом, смешивая в объемном отношении 1 : 1 при температуре 6-8 °С в течение 18-24 часов.
Оценку биохимического состава экстрактов проводили по следующим показателям: общий белок и полисахариды. Содержание белка в образцах определяли с помощью красителя кумасси G-250 по Бредфорд [13]. Содержание моно и полисахаридов определяли модифицированным антро-новым методом [6].
Полисахариды определяли по показателю оптической плотности с помощью спектрофотометра SmartSpec Plus (X = 430 нм). Количество полисахаридов в образцах рассчитывали, используя калибровочную кривую, предварительно построенную по глюкозе.
Испытывали также препарат гумитон, действующим веществом которого являются гуминовые кислоты, содержащиеся также в чаге, известном грибе с противоопухолевыми свойствами [9].
Оценку прямого цитотоксического эффекта полученных образцов проводили in vitro на клеточной культуре Hep-2 (эпидермальная карцинома гортани) [11]. Исследуемое вещество считается цитотоксически активным, если его ИК50 ниже 100 мкг/мл [12]. В качестве препарата сравнения нами использовался цитотоксический препарат цисплатин (цис-дихлородиаминоплатина (II)), широко применяемый в медицинской практике, как противораковое средство.
Результаты исследований и выводы
Результаты исследований по определению цитотоксической эффективности экстрактов из плодовых тел и мицелия в клеточной культуре Hep-2 (эпидермальная карцинома гортани) представлены в табл. 1.
Как видно из таблицы, по сравнению с контролем (химический препарат цисплатин) для подавления роста клеток Hep-2 требуется гораздо больше (от 50 до 250 мкг/мл) действующих веществ, содержащихся в образцах из базидиальных грибов. Хотя считается, что исследуемое вещество считается цитотоксически активным, если его ИК50 ниже 100 мкг/мл [12], в отношении грибов существует возможность повысить количество в мицелии биологически активных субстанций за счет подбора наиболее эффективных штаммов и условий культивирования.
Наши исследования подтверждают тот факт, что полисахариды грибов и их комплексы с белками обладают противоопухолевыми свойствами [25]. Поскольку многие образцы, представленные нами в таблице, характеризо-
вались высокими показателями подавления репликации вирусов гриппа [4, 5], герпеса [8], ВИЧ-1 [10] в клеточных культурах, то можно предположить, что полисахариды и их комплексы с белками участвуют в этом процессе.
Таблица 1
Цитотоксический эффект экстрактов из грибов в отношении клеток эпидермальной карциномы гортани Нер-2
Наименование гриба, шифр образца Содержание сухого вещества, мг/мл Концентрация белка в экстракте, % сухого вещества Концентрация полисахаридов в экстракте, % сухого вещества Концентрация сухого вещества экстракта, инги-бирующая рост клеток на 50 % (ИК50), мкг/мл
Lycoperdon perlatum 10-38 9,0 1,79 32,37 <50
Calvatia lilacina 10-55 1,0 1,51 38,25 >100
Cyathus olla 10-59 2,7 1,20 37,87 150
Ganoderma applanatum 09-11/5 6.0 0,48 32,71 200
Laetiporus sulphureus 08-09/1-полисахарид 2,0 н/о н/о 200
Pleurotus ostreatus 09-57 5,0 1,25 91,98 >200
Pleurotus pulmonarius 11-13 7,3 0,98 29,94 >200
Trametes versicolor 09-75 2,0 0,79 8,71 >200
Trametes gibbosa 09-85 2,5 0,77 9,35 100
Fomitopsis officinalis 09-19/2 3,6 0,38 5,18 100
Fomes fomentarius 11-11 3,75 0,48 79,64 >200
Piptoporus betulinus 08-43 3,5 0,64 98,22 >200
Flammulina velutipes 09-55 3,0 2,73 30,0 >200
Ischnoderma benzoinum 10-27 1,5 3,06 20,61 >200
Daedaleopsis confragosa 10-29 1,5 7,16 27,07 200
Asterophora lycoperdoides 09-97 1,5 1,28 41,60 >200
Inonotus obliquus 09-26/1 (скле-роций) 8,9 н/о н/о 250
Inonotus obliquus, С-901 10-21 (мицелий) 3,3 2,39 27,89 >200
Inonotus obliquus, Т-9 10-22 (мицелий) 4,0 3,13 22,03 >200
Гумитон, 5 % р-р 1,73 мг/мл гуминовых кислот 34,2 12,06 180
Контроль Цисплатин 1,0
Примечание: н/о - не определяли.
Эти результаты также согласуются с данными других авторов [7, 15, 16, 19] и свидетельствуют о корреляции противоопухолевых свойств грибов и их вирусингибирующей способности. Это может дать возможность разрабатывать комплексные препараты, проводя первичный скрининг образцов из грибов на противоопухолевую эффективность на клеточных культурах. Для подтверждения противовирусных свойств исследования должны продолжаться в соответствующих вирусологических лабораториях.
Следует также помнить, что кроме полисахаридов и белков в грибах содержатся многие другие соединения, которые могут проявлять специфический противовирусный или противоопухолевый эффекты, например, терпе-ноиды, пигменты, стеролы и др. Известно, например, что чага (Inonotus ob-liquus) содержит сложный комплекс, куда входят также меланин, гуминовая кислота [9]. Из результатов данного исследования видно, что гумитон проявляет цитотоксический эффект в отношении клеток Hep-2.
В настоящее время нами проводятся исследования по подбору условий культивирования с целью наработки биомассы наиболее эффективных штаммов грибов и извлечения активных компонентов для их идентификации и испытаний на противовирусную и противоопухолевую эффективность.
Список литературы:
1. Автономова А.В. Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst., трутовик лакированный: штаммовое разнообразие, антибиотические свойства и противоопухолевое действие: дисс. ... канд. биол. наук. - М.: МГУ, 2006. - 121 с.
2. Белова Н.В. Перспективы использования биологически активных соединений высших базидиомицетов в России // Микология и фитопатология. - 2004. - Т. 38, Вып. 2. - С. 1-7.
3. Горбунова И.А., Перова Н.В., Теплякова Т.В. Лекарственные грибы юга Западной Сибири // Материалы 3 Всероссийского конгресса по медицинской микологии. - М., 2005. - С. 259-262.
4. Кабанов А.С., Косогова Т.А., Шишкина Л.Н., Теплякова Т.В., Скар-нович М.О., Мазуркова Н.А., Пучкова Л.И., Малкова Е.М., Ставский Е.А., Дроздов И.Г. Изучение противовирусной активности экстрактов, выделенных из базидиальных грибов, в экспериментах in vitro и in vivo в оно-шении штаммов вируса гриппа разных субтипов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2011. - № 1. - С. 40-43.
5. Кабанов А.С., Шишкина Л.Н., Теплякова Т.В., Пучкова Л.И., Косогова Т.А., Мазуркова Н.А., Скарнович М.О., Сергеев А.Н. Изучение противовирусной эффективности экстрактов, выделенных из базидиальных грибов, в отношении вируса гриппа птиц // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2009. - № 2. - С. 185-186.
6. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Модификация антронового метода количественного определения углеводов и его применение для анализа растительного сырья // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - Прил. 2. - С. 118-119.
7. Полшук О.М., Коваленко О.Г. Бюлопчна акгивтсть глiкополiмерiв базидальних грибш // Biopolymers and Cells. - 2009. - Vol. 25, N 3. - P. 181-193.
8. Разумов И.А., Косогова Т.А., Казачинская Е.И., Пучкова Л.И., Щербакова Н.С., Горбунова И.А., Михайловская И.Н., Локтев В.Б., Теплякова Т.В. Противовирусная активность водных экстрактов и полисахаридных фракций, полученных из мицелия и плодовых тел высших грибов // Антибиотики и химиотерапия. - 2010. - 55, 9-10. - С. 14-18.
9. Сухих А.С., Кузнецов П.В. Перспективы применения гуминовых и гуминоподобных кислот в медицине и фармации // Медицина в Кузбассе. - 2009. - № 1. - С.10-14.
10. Теплякова Т.В., Гашникова Н.М., Пучкова Л.И., Проняева Т.Р., Ко-согова Т.А. Ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа. Патент RU 2375073C1, опубл. 10.12.2009. - Бюл. № 34.
11. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К., Андронова Н.В., Гарин А.М. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ // в кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей ред. член-корр. РАМН проф. Р.У Хабриева. - 2005. - 832 с.
12. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США / Под ред. З.П. Софьиной, А. Голдина. - М., 1980. - С. 105-106.
13. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976. - 72. - P. 248-254.
14. Collins R.A., Ng T.B. Polysaccaropeptide from Trametes versicolor has potential for use against human immunodeficiency virus type 1 infection // Life Scince. - 1997. - Vol. 60, No. 25. - P. 383-387.
15. Eo S.-K., Kim Y.-S., Lee C.-K., Han S.-S. Antiherpetic activities of various protein bound polysaccharides isolated from Ganoderma lucidum // Journal of Ethnopharmacology. - 1999. - Vol. 68, I. 1-3. - P. 175-181.
16. Kim Y.-S., Eo S.-K., Oh K.-W., Lee C., Han S.-S. Antiherpetic activities of acidic protein bound polysaccharide isolated from Ganoderma lucidum alone and in combinations with interferons // Journal of Ethnopharmacology. -2000. - Vol. 72, I. 3. - P. 451-458.
17. Lorenzen K. and Anke T. Basidiomycetes as a Source for New Bioacti-ve Natural Products // Current Organic Chemistry. - 1998. - N 2. - P. 329-364.
18. Moradali M., Mostafavi H., Ghods S., Hedjaroude G Immunomodula-ting and anticancer agent in the realm of macromycetes fungi (macrofungi) // International Immunopharmacoloogy. - 2007. - Vol. 7. - P. 701-724.
19. Oh Ki-Wan, Lee Chong-Kil, Kim Young-So, Eo Seong-Kug, Han Se-ong-Sun. Antiherpetic activities of acidic protein bound polysaccharide isolated from Ganoderma lucidum alone and in combinations with acyclovir and viida-rabin // Journal of Ethnopharmacology. - 2000. - N 72. - P. 221-227.
20. Stamets P. MycoMedicinals. An Informational Yreatise on Mushrooms: Printed in China. - 2002. - 96 p.
21. Tabata K., Itoh W., Kojima T., Kawabate S. and Misaki K. Ultrasonic degradation of schizophyllan, an antitumor polysaccharide produced by Schizo-phyllum commune FRIES // Carbohydr. Res. - 1981. - № 89. - Р. 121-135.
22. Tochikura T.S., Nakashima H., Hirose K., Yamamoto N. A biological response modifier, PSK, inhibits human immunodeficiency virus infection in vitro // Biochem. Biophys. Res. Comm. - 1987. - Vol. 148. - P. 726-733.
23. Tochikura S. Inhibition (in vitro) of replication and of the cytopathic effect of human immunodeficiency virus by an extract of the culture medium of Lentinus edodes mycelia // Med. Microbiol. Immunol. - 1988. - Vol. 177. - N 5. - P. 235-244.
24. Wasser S.P., Weis A.L. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms current perspectives // Int. J. Med. Mush. -1999. - Vol. 1. - N 1. - P. 30-62.
25. Wasser S.P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomo-dulating polysaccarides // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. - V 60. - P. 258-274.
ВРЕМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ КРАЙНЕГО СЕВЕРА
© Фатеева Н.М.*
Тюменский государственный университет, г. Тюмень
В данной работе представлены комплексные биоритмологические исследования системы гемостаза, гемодинамики, показателей перекис-ного окисления липидов и антиоксидантной защиты и выявлены индивидуально-типологические реакции организма, определяющие стратегию адаптивного поведения организма при экспедиционно-вахтовом труде на Крайнем Севере.
В настоящее время массовые трансширотные перелеты людей на большие расстояния рассматриваются как эколого-социальный фактор, воздействие которого испытывают значительные контингенты населения и, прежде всего те, кто работает вахтово-экспедиционным методом в Заполярье. Оценить полностью роль многочисленных факторов, воздействующих на организм в реальных производственных условиях. В связи с этим квалифицированное решение данной проблемы требует систематических наблюдений за нормальными ритмами здорового человека в конкретных природно-климатических условиях. Однако, если вопросы закономерностей перестройки функций организма при дальних широтных перелетах хорошо изучены, то физиологические аспекты меридиональных перемещений в настоящее время еще находятся в стадии разработок [1, 2, 6]. Производственная деятельность человека в условиях Крайнего Севера России подвержена влиянию сложного комплекса факторов как социального, так и геофизического характера. В связи с этим, выяснение конкретных механизмов системной перестройки функций организма при производственных перемещениях является необходимым условием эффективной разработки средств контроля и профилактики разви-
* Профессор кафедры Медико-биологических дисциплин и безопасности жизнедеятельности, доктор биологических наук, профессор.
