CC BY
8
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
применения ИСП можно рассматривать все случаи Р/Р ХЛЛ. В то же время, использование ИСП в качестве единственного агента в случаях неблагоприятного кариотипа не является оптимальным. 3) Текущие клинические рекомендации по обследованию пациентов с ХЛЛ, нуждающихся в терапии,
не дают полной информации в плане предикторов прогноза. Требуется их дальнейшая разработка с учетом имеющейся доказательной базы и современных технологий выявления комплексного кариотипа.
Е.В.Клеина1, С.В. Волошин1, Ю.С. Вокуева1, О.Д. Муштакова1, Л.С. Мартыненко1, М.П. Бакай1, Ю.С. Руженкова1, Е.В. Карягина3, О.С. Успенская4, И.С. Зюзгин5, С.С. Бессмельцев1, А.В. Чечеткин1, И.С. Мартынкевич1
ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ АНОМАЛИЙ ПРИ ЛИМФОМЕ ИЗ
КЛЕТОК МАНТИЙНОЙ ЗОНЫ
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии
и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства», г.Санкт-Петербург
2 Клиника Шарите, Берлинский медицинский университет, г.Берлин
3 Городское бюджетное учреждение здравоохранения «Городская больница № 15», г. Санкт-Петербург
4 Городское бюджетное учреждение здравоохранения «Ленинградская областная клиническая больница», г. Санкт-
Петербург
5 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр
онкологии имени Н.Н. Петрова» Минздрава России, г. Санкт-Петербург
Введение. Лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) - В-клеточная лимфома с самой высокой частотой нестабильности генома. Дополнительно к наиболее часто встречающейся транслокации t(11;14)(q13;q32) у большинства пациентов выявляются неблагоприятные вторичные молекулярные изменения и хромосомные аберрации: делеции, дупликации и амплификации участков хромосом, содержащих гены, контролирующие регуляцию клеточного цикла, репарацию поврежденной ДНК, передачу сигнала и апоптоз. Дополнительные хромосомные аномалии ассоциированы с агрессивным клиническим течением опухоли и снижением общей выживаемости.
Цель. Выявить частоту встречаемости хромосомных и молекулярно-генетических аберраций, обуславливающих крайне неблагоприятное течение лимфомы из клеток мантийной зоны.
Материалы и методы. Приведены результаты цитоге-нетического и FISH-исследований 75 пациентов с диагнозом ЛКМЗ. Стандартное цитогенетическое исследование (СЦИ) выполнялось методом G-banding на клетках костного мозга или периферической крови. Транслокация t(11;14)(q13;q22), перестройка локусов генов TP53/17p13, MYC/8q24 определялись FISH исследованием с использованием локус-специ-фичных ДНК-зондов к комплементарным им нуклеотидным последовательностям.
Результаты. Согласно данным последних международных исследований, среди пациентов с ЛКМЗ выделяют наиболее агрессивную подгруппу «double-hit» ЛКМЗ с плеоморф-ным/бластоидным морфологическим вариантом опухоли, рефрактерным течением заболевания и крайне неблагоприятным прогнозом. «Double-hit» ЛКМЗ характеризуются наличием транслокаций как с вовлечением гена CCND1/11q13, так и C-MYC/8q24 (перестройка и амплификация).
Стандартное цитогенетическое исследование выполнено у 51 больного ЛКМЗ. Патологический кариотип был обнаружен у 25/51 (49,0%) пациента. Высокоспецифическая транслокация t(11;14)(ql3;q22) при исследовании карио-типа выявлялась у 23/51 (45,1%) больных. Комплексные нарушения кариотипа обнаруживались у 16/51 (31,4%) пациентов. Параллельное применение FISH метода позволило выявить транслокацию t(11;14)(q13;q22) дополнительно у 18/51 (35,3%) больных. Это были пациенты с нормальным кариотипом при СЦИ. Таким образом, благодаря комплексному подходу с применением сЦи и FISH методов в диагностике ЛКМЗ, транслокация t(11;14)(q13;q22) обнаружена у подавляющего количества пациентов 41/51 (80,4%).
Исследование FISH методом перестроек генов C-MYC/8q24, TP53/17p13 и транслокации t(11;14)(q13;q22) показало следующие результаты. Перестройки гена
C-MYC/8q24 выявлены у 16/75 (21,3%) пациентов, из которых l/l6 (6,3%) - транслокация с вовлечением C-MYC/8q24, 15/16 (93,7%) - амплификация гена C-MYC/8q24. В группе пациентов с изменениями C-MYC/8q24 СЦИ выполнено у 11/16 (68,8%) пациентов. Хромосомные аберрации обнаруживались у 7/11 (63,6%) пациентов, из которых в 6/7 (85,7%) случаев выявлялись комплексные изменения кариотипа. По современным представлениям о прогнозе ЛКМЗ, комплексный кариотип также относят к неблагоприятному прогностическому фактору. Важно отметить, что в составе комплексного кариотипа помимо транслокации t(11;14) (q13;q32) обнаруживались и другие аберрации, ассоциированные с крайне неблагоприятным течением заболевания. Это, в первую очередь, численные и структурные изменения хромосомы 17 - у 4/6 (66,7%) исследуемых больных, а также моносомия хромосомы 7 - у 1/6 (16,7%) пациентов. Транслокация t(11;14)(q13;q32) при анализе кариотипа выявлялась у 7/11 (63,6%) пациентов. FISH - методом аберрации, затрагивающие ген TP53/17p13 обнаружены у 8/16 (50,0%) больных. Применение FISH-анализа наряду со СЦИ позволило у всех пациентов выявить также изменения гена ^MYC/8q24, которые не удалось детектировать при исследовании кариотипа, и в ряде случаев с нормальным карио-типом и отсутствием митозов обнаружить транслокацию t(11;14)(q13;q32) и делецию TP53/17p13.
У 59/75 (78,7%) пациентов изменения гена ^MYC/8q24 выявлены не были. В данной группе СЦИ выполнено у 39/59 (66,1%) пациентов. Хромосомные аберрации обнаруживались у 18/39 (46,2%) пациентов, в том числе комплексные изменения кариотипа - в 10/18 (55,6%) случаев. Транслокация t(11;14)(q13;q32) в кариотипе выявлялась у 16/18 (88,9%) пациентов. При этом неблагоприятные дополнительные аберрации (ДХА), такие как del(7q), аномалии хромосомы 3, делеция гена Tp53/17p13 обнаруживались у 2/18 (11,1%), 3/18 (16,7%), 3/18 (16,7%) соответственно. FISH - методом делеция 17 хромосомы обнаружилась у 10/59 (16,9%) больных, в том числе у пациентов с отсутствием делящихся клеток и нормальным кариотипом.
Предварительный анализ клинических данных и показателей общей выживаемости пациентов с неблагоприятными генетическими аберрациями в сравнении с группой стандартного риска больных нашей исследуемой группы с ЛКМЗ показал значимое неблагоприятное влияние. Во всех случаях клиническое течение характеризовалось быстрой прогрессией, продвинутыми стадиями заболевания и низкой выживаемостью больных. Медиана выживаемости составляла 8 месяцев, в отличие от группы стандартного риска, где медиана общей выживаемости не достигнута.
Выводы. Комплексный подход к генетической диагно-
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
стике ЛКМЗ с использованием СЦИ и FISH-исследований позволяет выделять группу крайне неблагоприятного прогноза «double-hit» ЛКМЗ и с комплексными нарушениями кариотипа. Также было показано, что в группе пациентов с изменениями гена C-MYC/8q24 чаще выявлялись ДХА, являющиеся неблагоприятным фактором прогноза: комплексные изменения кариотипа (наличие трех и более аберраций) - 85,7% и 55,6%, и аберрации с вовлечением TP53/l7p13
- 50,0% и 16,9%. Выявление изменений в данных генах ассоциировано с более короткими показателями общей выживаемости. Полученные результаты исследования позволяют выделить группу пациентов высокого риска с необходимостью безотлагательного применения высокодозной химиотерапии и современных эффективных терапевтических подходов.
Я.А. Кожевникова1, Н.В. Рисинская2, Е.Б. Ликольд2, Б.В. Бидерман2, И.С. Февралева 2, А.Б. Судариков2
ВЕРИФИКАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА НР196-1971^ (6 П.Н.) В ДОМЕНЕ TAD2 ГЕНА СЕВРА У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМ МИЕЛОИДНЫМ ЛЕЙКОЗОМ
1Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский
государственный университет имени М.В. Ломоносова», факультет фундаментальной медицины, г. Москва, 2Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва
Введение. Ген CEBPA кодирует транскрипционный фактор C/EBPa (CCAAT/enhancer-binding protein alpha), который участвует в дифференцировке клеток миелоидного ряда. C/ EBPa состоит из C-концевого ДНК-связывающего домена bZIP (basic leucine zipper) и двух доменов трансактивации TAD1 и TAD2 на N-конце. Мутации CEBPA обнаруживаются в 5-14% случаев острого миелоидного лейкоза (ОМЛ). Пациенты с ОМЛ с двойными мутациями CEBPA отличаются благоприятным прогнозом, что определяет выбор терапии. Было показано, что вставка в 6 п.н. в домене TAD2 (HP196-197ins), приводящая к появлению в белке четырех гистидин-пролиновых повторов вместо трех, распространена как среди пациентов с ОМЛ, так и в здоровой популяции, поэтому на данный момент этот полиморфизм не учитывают при стратификации риска. Рутинно для обнаружения мутаций в гене CEBPA используется ПЦР с последующим фрагментным анализом. Этот метод позволяет обнаруживать лишь вставки и делеции в участках гена и не выявляет точечные мутации; более того, он не позволяет определить точную локализацию и последовательность встав-ки/делеции. Таким образом, на данный момент полиморфизм HP196-197ins в домене TAD2 может быть ошибочно принят за мутацию при определении группы риска.
Цель. Сравнить встречаемость вставки 6 п.н. в домене TAD2 гена CEBPA у пациентов с ОМЛ, здоровых людей контрольной группы и у пациентов с гемобластозом немиелоидного происхождения (хроническим лимфоцитарным лейкозом, хЛл) в российской популяции; разработать тест-систему для подтверждения расположения вставки в области гистидин-проли-новых повторов.
Материалы и методы. В исследование включены 117 пациентов с de novo ОМЛ и 100 пациентов с ХЛЛ (70 пациентов без мутаций в области вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов (IGHV), 30 пацентов с мутациями IGHV ), проходящих лечение в Национальном Медицинском Исследовательском Центре гематологии (Москва, Россия) и 120 здоровых людей из контрольной группы. Геномная ДНК была выделена из образцов костного мозга/периферической крови, взятых во время постановки диагноза; у пациентов с ОМЛ мы также анализировали образцы, взятые после лечения. Тестирование образцов ДНК мы проводили с помощью ПЦР с флуоресцентно меченым прямым (F) праймером FAM-5'-CCGGCTACCTGGACGGCAGG-3
'и обратным (R1) праймером 5'-CGTTGCTGTTCTTTGTCCACCGAC TTCTT-3' (T Benthaus et al, 2008) с последующим фрагментным анализом (на генетическом анализаторе ABI3130, Thermofisher Scientific, США). Сравнение частот встречаемости вставки у пациентов проводилось с использованием критерия х2 Пирсона. Для верификации вставки 6 п.н. как HP196-197 нами была предложена система праймеров: прямого F (T Benthaus et al, 2008) и обратного R 5'-TGCGGGTGCGGGTGCGGGT-3' (был подобран нами комплементарным непосредственно последовательности тандемных гистидин-пролиновых повторов).
Результаты. Вставка 6 п.н. в домене TAD2 была обнаружена у 7 из 117 (6%) пациентов с ОМЛ, у 9 из 120 (7,5%) здоровых контролей и у 10 из 100 (10%) пациентов с ХЛЛ (у 8 из 70 пациентов без мутации IGHV и у 2 из 30 пациентов с мутацией IGHV ); различия между этими группами статистически не значимы (х2 = 1,234, df = 2, p = 0,540). Во всех исследованных нами образцах вставка обнаруживалась в гетерозиготной форме. У всех пациентов с ОМЛ с обнаруженной во взятых до лечения образцах вставкой 6 п.н. эта вставка также была обнаружена после лечения. С помощью предложенной нами системы праймеров было подтверждено, что вставка находится в сайте гистидин-пролиновых повторов во всех случаях. Подбор специфичных праймеров затруднен, так как вставка представляет собой дупликацию уже трижды повторяющейся последовательности. Нами подобран праймер, комплементарный и дикому аллелю, и аллелю со вставкой. В результате в случае наличия вставки HP196-197 на электрофореограмме появляются два пика (180 п.н. и 186 п.н) с соотношением высоты 3:1 (дикий аллель - 180 п.н., мутантный аллель - два продукта (180 и 186 п.н)).
Выводы. Встречаемость вставки 6 п.н. в домене TAD2 (HP196-197ins) одинакова у пациентов с ОМЛ и контрольных групп и совпадает с данными по европейской популяции. Вставка у пациентов с ОМЛ сохраняется после лечения, что свидетельствует о ее наследственной природе. В исследованных нами когортах во всех случаях обнаруженные в домене TAD2 вставки 6 п.н. являлись полиморфизмами HP196-197ins, что, однако, не исключает появления более редких вариантов вставки 6 п.н. у пациентов с ОМЛ. Предложенная нами система праймеров позволит отделить полиморфизм HP196-197INS от мутаций, возможно, имеющих клиническое значение.
