CC BY
51
КОМПЛЕКСНОЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ
А.А. Солодовник1, А.С. Мкртчян2, В.А. Мисюрин1, Л.А. Кесаева1, Н.Н. Касаткина1, О.М. Вотякова1, О.Ю. Якимович1, Е.Г. Медведовская1, А.С. Антипова1, И.З. Заводнова1, О.А. Коломейцев1, А.Д. Ширин1, Е.А. Османов3, А.В. Мисюрин1, 2
ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478Москва, Каширское ш., 24; 2ООО «ГеноТехнология»; Россия, 117279 Москва, Профсоюзная ул., 104; 3ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет); Россия, 119991 Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 2
Контакты: Алена Александровна Солодовник alionka1363@rambler.ru
Актуальность. Множественная миелома (ММ) — злокачественное В-клеточноелимфопролиферативное заболевание с кло-нальной пролиферацией плазматических клеток, продуцирующих моноклональный иммуноглобулин, в костном мозге и за его пределами. В настоящее время в качестве прогностических факторов исследуется широкий спектр цитогенетических аномалий и молекулярно-биологических параметров.
Цель работы — сравнительное исследование частоты, характера и клинической значимости хромосомных нарушений при ММ методами стандартной цитогенетики и флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).
Материалы и методы. В исследование включены 77больных с ММ, наблюдавшихся в ФГБУ «НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России в 2016—2017 гг. Пациенты были в возрасте от 34 до 77 лет, медиана — 53 года. Женщин было 42 (54,5 %), мужчин — 35(45,5 %).
Результаты. Метод стандартного кариотипирования (G-бэндинг) позволил выявить хромосомные изменения лишь у 1 из 77 больных. Однако методом FISH были обнаружены хромосомные аберрации уже у 26 % пациентов (20 из 77). Делеции различных участков исследуемых локусов хромосом, свидетельствующих о возможном наличии гиподиплоидного клона или потери отдельных регионов, обнаружены у 1 больного только при повторном обследовании с интервалом 6 мес. Среди пациентов с хромосомными нарушениями (n = 20) аномалии типа частичной трисомии 11q, делеции участка q32 хромосомы 14, транслокации ^4;14)(р16;д32) и перестройки генов IGHVобнаружены у 30 % (6 из 20). У14 из 20 больных выявлены 2 и более хромосомных нарушения. Хромосомные аномалии с большей частотой обнаруживаются на более поздних стадиях ММ (IA и IIA стадии — 0 % наблюдений с аберрациями, IIIA и ШВ — 27 и 47 % соответственно).
Заключение. FISH позволяет обнаружить хромосомные нарушения в опухолевых плазматических клетках независимо от фазы митоза. При ММ это приобретает особо важное значение в связи с низкой пролиферативной активностью плазмоцитов. Кроме того, FISH позволяет обнаружить субмикроскопические, т. е. скрытые хромосомные аберрации, которые встречаются у трети больных ММ. Совершенствование панели зондов и широкое применение FISH не означает пренебрежение методами стандартной цитогенетики. G-бэндинг позволяет увидеть нарушения сразу всех хромосом в отличие от локус-специ-фичного FISH-анализа.
Ключевые слова: множественная миелома, цитогенетические нарушения, флуоресцентная in situ гибридизация
DOI: 10.17650/1726-9784-2019-18-1-50-59
COMPLEX CYTOGENETIC RESEARCH OF CRYPTIC CHROMOSOMAL ABERRATIONS IN PATIENTS WITH MULTIPLE MYELOMA
A.A. Solodovnik1, A. S. Mkrtchyan2, V.A. Misyurin1, L. A. Kesaeva1, N.N. Kasatkina1, O. M. Votyakova1, O.Yu. Yakimovich1, E. G. Medvedovskaya1, A.S. Antipova1,1.Z. Zavodnova1, O . A. Kolomeytsev1, A. D . Shirin1, E . A. Osmanov3, A. V. Misyurin1, 2
'N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology of the Ministry of Health of the Russian Federation;
24 Kashirskoe Shosse, Moscow '15478, Russia;
2LLC GeneTechnology; '04Profsojuznaya St., Moscow '17279, Russia;
3Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation; Build. 2, 8 Trubetskaya St., Moscow '1999', Russia
Background. Multiple myeloma (MM) is a malignant lymphoproliferative B-cell disease characterization by clonal proliferation of plasma cells in the bone marrow and beyond its borders. Currently, a wide range of cytogenetic anomalies and molecular-biological parameters are studied as prognostic factors.
Objective: a comparative study of the frequency, features and clinical significance of chromosomal abnormalities in MM by conventional cytogenetic and fluorescent in situ hybridization (FISH) methods.
Materials and methods. 77 patients with MM, which admitted in N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, were included in the study from 2016 to 2017.
Results. Chromosomal alterations were detected only in one case (1/77) by conventional cytogenetic method G-banding. However cytogenetic aberrations were revealed in 26 % of cases (20/77) using FISH. Deletions of different regions of chromosomes, indicating the possible presence of a hypodiploid clone or loss of some regions, were found in one patient in the second FISH analysis after 6 months. In the cohort of patients with chromosomal abnormalities (n = 20) a partial trisomy 11q, a deletion of the region q32 of the chromosome 14, a translocation t(4;14)(p16;q32) andIGHVgene rearrangement were determined in 30 % (6/20) as sole anomalies. Two or more cytogenetic aberrations were identified in the remaining 14 patients. Our study confirms that chromosomal abnormalities are more likely detected at later stages of MM (IA u IIA — 0 %, IIIA u IIIB — 27 and 47 % respectively). Conclusion. FISH allows to detect chromosomal changes in tumor plasma cells regardless of the mitosis phase. In MM, it becomes particularly important in connection with low proliferative activity of plasma cells. Additionally, in the fourth of MM patients in the study submicroscopic chromosomal aberrations were discovered using FISH. The improvement of the probe panel and the widespread use of locus specific FISH don't replace G-banding that allows to see damages of all chromosomes at once.
Key words: multiple myeloma, cytogenetic abnormalities, fluorescence in situ hybridization
Введение
Множественная миелома (ММ) — злокачественная В-клеточная лимфоидная опухоль, характеризующаяся пролиферацией опухолевых плазматических клеток в костном мозге, за его пределами и наличием моноклонового белка (парапротеина) в крови и/или моче [1]. Парапротеин циркулирует в крови и может осаждаться в различных органах и тканях. Осажденный парапротеин может трансформироваться в амилоид (белок, устойчивый к разрушению), который нарушает функцию органов и систем. При ММ наблюдаются остеолитические поражения вследствие резорбции кости и нарушения образования остеобластов — молодых остеообразующих клеток кости. При ММ возможно угнетение нормальных ростков кроветворения с развитием анемии, тромбоцитопе-нии и лейкопении, что приводит, наряду с другими нарушениями, к ослаблению клеточного и гуморального иммунитета. Кроме того, важное значение имеет тот факт, что миелома, как злокачественная опухоль, развертывается в иммунокомпетентной системе.
В литературе обсуждаются 4 этапа развития (прогрессии) моноклональных плазмоклеточных болезненных состояний [2]:
♦ моноклональная гаммапатия неясного генеза (monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS) |
▼
♦ тлеющая плазмоклеточная миелома
I
♦ плазмоклеточная миелома
I
♦ плазмоклеточный лейкоз.
MGUS характеризуется уровнем парапротеина в крови и/или моче <30 г/л, числом плазматических клеток в костном мозге <10 %, отсутствием повреж-
дения органов [3]. При тлеющей миеломе обнаруживается >10 % опухолевых клеток в костном мозге, содержание парапротеина >30 г/л, отсутствуют остео-литические повреждения, анемия и другие вторичные симптомы ММ [4]. Развитие плазмоклеточной миеломы с формированием экстрамедуллярных очагов поражения в различных органах и тканях, а также плазмоклеточный лейкоз как крайняя форма прогрессии опухоли характеризуют наиболее агрессивное течение болезни.
Все перечисленные клональные, плазмоклеточ-ные, нозологически очерченные формы отражают 4 этапа опухолевой прогрессии и характеризуются весьма сложными хромосомными и молекулярно-ге-нетическими нарушениями. Степень выраженности последних позволяет говорить о клональной эволюции генетических нарушений при ММ. Таким образом, обнаружение генетических поломок позволяет выделить различные клональные патологические процессы в сложной многоступенчатой модели прогрессии, которая начинается с MGUS и заканчивается плазмоклеточным лейкозом. Однако низкая пролиферативная активность опухолевых клеток на начальных этапах развития ММ — существенное ограничение для стандартного кариотипирования, поскольку анализ ограничивается только вступившими в метафазу клетками. Кроме того, некоторые хромосомные нарушения невозможно обнаружить методами стандартной цитогенетики (G-бэндинга) из-за чрезвычайно малых размеров поврежденных участков в хромосоме — так называемых скрытых хромосомных аберраций. Все эти ограничения вполне преодолеваются популярным в клинике молекуляр-но-цитогенетическим методом — флуоресцентной in situ гибридизацией (FISH) во всех ее вариациях [5—13].
В период первичной диагностики ММ обнаруживаются различные хромосомные нарушения.
52 Оригинальные статьи
К ним относятся, например, гипердиплоидность за хромосом. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 счет трисомии 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21-й хромо- с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки. сом, гиподиплоидность за счет моносомии хромо- Инкубацию осуществляли 24 и 48 ч при 37 °С. сом, а также транслокации с вовлечением участков В «дневные» культуры за 40 мин до завершения ин-генов, кодирующих вариабельные области тяжелых кубационного периода добавляли 80 мкл 0,25 % кол-цепей иммуноглобулинов — IGHV Статус плоидности хицина, в «ночные» культуры колхицин добавлялся хромосом и перестройка IGHV-генов — это 2 основ- одновременно с посадкой материала. Затем с целью ных параметра, определяющих распределение боль- гипотонии использовали раствор KCl при 37 °С ных в прогностические группы. Гиподиплоидный и осуществляли несколько промывок фиксирующим набор хромосом, а также транслокации t(4;14)(p16;q32) раствором Карнуа (1/4 часть уксусной кислоты и t(14;16)(q32;q23) определяют неблагоприятный и 3/4 96 % метилового спирта). Суспензию клеток прогноз при ММ [14, 15]. В то же время гипердипло- раскапывали на стекла над водяной баней. Окраску идный набор хромосом, t(11;14)(q13;q32) характеризу- проводили 0,25 % раствором трипсина и красителем ют ММ с меньшим риском прогрессирования [16—18]. Гимза. По мере прогрессирования болезни обычно возрастает пролиферативная активность опухолевых Цитогенетическое исследование клеток и увеличивается число вторичных хромосом- Анализировали не менее 20 метафаз. Для карио-ных нарушений. Они характеризуются del(13)(q14), типирования использовали полуавтоматическую del(17)(p13), del(1)(p36) и dup(1)(q21). Обозначенные программу IKAROS (MetaSystems). Кариотип опи-участки хромосом богаты генами, которые также сывали согласно требованиям международной систе-связаны с клеточной пролиферацией и апоптозом. мы номенклатуры хромосом ISCN 2013. Стандарт-Показано, что вышеупомянутые нарушения имеют ный хромосомный анализ был успешно проведен неблагоприятное прогностическое значение [15, 19, 20]. всем исследуемым больным. Нарушения в участках хромосом 8q24, 11q13—q23, Молекулярно-цитогенетический анализ FISH 14q32 наблюдаются в 15—20 % случаев ММ, однако проводили согласно инструкции производителя (Krea-их прогностическое значение не определено. Насто- tech). Технологически методика включает 5 этапов: ящая работа посвящена комплексной цитогенетиче- 1) подготовка клеток; ской оценке хромосомных аберраций у больных ММ 2) предобработка клеток (2 х SSC, 70, 80 и 100 % как первому этапу реализации программы по изуче- этанол); нию экспрессии раково-тестикулярных генов. 3) денатурация (5 мин при 75 °С); Цель настоящей работы заключается в сравни- 4) гибридизация (1 ночь при 37 °С); тельном исследовании частоты, характера и клиниче- 5) постгибридизационная отмывка (0,4 х SSC/0,3 % ской значимости хромосомных нарушений при ММ Twin 20, 2 х SSC/0,1 % Twin 20, 70, 80 и 100 % с использованием методов стандартной цитогенети- этанол). ки и FISH. Использовались зонды фирмы Kreatech IGH (14q32) Break, CCND/IGHt(11;14) Fusion, 11q23/DLEU1 Материалы и методы (13q14), TP53(17p13)/ATM(11q22), 6q21/MYC(8q24), Характеристика пациентов 1q21/SRD(1p36), FGFR3/IGHt(4;14) Fusion. Анали-Исследованы образцы аспирата костного мозга, зировали 100 клеток. Порог чувствительности — до 5 %. полученные у 77 больных с диагнозом ММ, наблюдавшихся в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Бло- Статистический анализ хина» Минздрава России в 2016—2017 гг. Мужчин В настоящем исследовании больные разделены было 35 (45,5 %), женщин — 42 (54,5 %). Медиана на 2 группы. В 1-ю включены пациенты с хромосом-возраста составила 53 года (разброс от 34 до 77 лет). ными нарушениями (n = 20), во 2-ю — без хромосом-Пациентов с первично установленным диагнозом ных аномалий (n = 57). Согласно критерию Колмо-было 43, в ремиссии — 27, с рецидивом/прогрессией горова—Смирнова количественные данные имели болезни — 7. Больные с ММ были распределены со- нормальное распределение. В связи с этим для даль-гласно системе стадирования Дюри—Сальмон (LA ста- нейшего статистического анализа использовались дия — 11 %, IIA — 8 %, IILA — 62 %, IIIB — 19 %). параметрические критерии. Для изучения корреляции хромосомных изменений с качественными параме-Культивирование и фиксация образцов трами применяли критерий х2. Для анализа связи костного мозга хромосомных аномалий с количественными параме-Гепаринизированный аспират костного мозга был трами (возраст больных, уровень лейкоцитов, гемо-обработан согласно стандартной методике культиви- глобина, кальция, альбумина, креатинина и ßj-ми-рования для дифференциального G-окрашивания кроглобулина) использовали t-критерий. Общую
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BIOTHERAPY 1'2019 том 11 | vol. 18
выживаемость анализировали по методу Каплана— Майера. Для построения кривой общей выживаемости продолжительность жизни рассчитывали от даты проведения цитогенетического исследования до летального исхода или даты последней информации о больном. Для сравнения показателей общей выживаемости у пациентов с хромосомными изменениями и без таковых использовали логранговый тест. Количественные данные представлены медианой значений и пограничными значениями в пределах доверительного интервала 0,95. Различия между группами считались статистически значимыми при значениях р <0,05. Статистический анализ проводили с помощью программного пакета Statistica-10.
Результаты
Клинические варианты ММ 77 больных, включенных в настоящее исследование, отражены в табл. 1. В табл. 2 показано число пациентов с хромосомными аберрациями и без них в зависимости от момента проведения исследования. У 76 из 77 больных описан нормальный кариотип (46, ХХ/46, ХY). Множественные хромосомные нарушения обнаружены лишь у 1 пациентки с кариотипом: 46~49,ХХ^ег(1Ж1;9) (р32;р24№е1(1)^^24),ёсг(3Ж3;7)^29д22),+44ег (6Ж6;20)^12^13Мег(6Ж6;22)^21^1?Ме1(6) (рП)^е1(6)(р21)4е1(8)(р21)4ег(9Ж1;9)(р32;р24), dup(9)(q3?2q34),+del(9)(q3), + 11,der(12)ins(7;12) (р15;рЩ24Ме1(7)^10)4е1(12)^12),+ёет(12Ж12;13) (р12^14),М,+18,+184ег(1Ж1;19)да^13Мир(1) (q22q25),der(20)t(1;20)(q21;p13),der(20)t(X;20;6;20) ^13;р12;р12д13)Д(21)^10)[ср15].
Таблица 1. Клинические варианты ММ (n = 77)
Клинический вариант ММ Числобольных, n (%) Хромосомные нарушения (FISH), n (%)
Симптоматическая 75 (97) 20 (26)
Тлеющая (бессимптомная) 1 (1,5) 0
Несекретирующая 1 (1,5) 0
Всего 77 (100) 20 (26)
У 20 (26 %) из 77 больных ММ хромосомные нарушения обнаружены при помощи FISH-исследования. У больных с тлеющей и несекретиру-ющей ММ аберраций не выявлено. Среди 20 пациентов с хромосомными аномалиями 15 были с первичным диагнозом, 1 — с рецидивом и 4 — с про-грессированием ММ. У больных с хромосомными нарушениями имели место более поздние стадии ММ по Дюри—Сальмон, в ряде случаев отмечался
повышенный уровень креатинина (р = 0,0004) и более низкий — гемоглобина (р = 0,03) (табл. 3).
Таблица 2. Хромосомные нарушения в разных группах больных ММ (n = 77)
Группа больных Всего, n (%) С хромосомными изменениями, n (%)
С первично установленным диагнозом 43(100) 15(35)
В ремиссии 27 (100) 3 (11)
С рецидивом/прогрессией болезни 7(100) 2 (28)
Наиболее частыми цитогенетическими нарушениями были dup(11)(q12-23) (35 %), del(13)(q14) (35 %), del(14)(q32) (25 %), dup(1)(q21) (20 %) и t(11;14) (15 %). Из 20 больных ММ у 14 (11 — первичные, 3 — с про-грессированием) хромосомные нарушения были комплексными (табл. 4).
Делеции различных участков большого числа хромосом возможны вследствие частичной или полной их моносомии (гиподиплоидии). Такие нарушения были обнаружены у 1 больного, которому FISH проводили повторно спустя 6 мес после первого исследования с отрицательным результатом (без хромосомных изменений). Продолжительность жизни пациента с t(11;14), делецией гена IGHVи делецией участка q14 хромосомы 13 составила всего 3 мес после установления диагноза ММ. У больной со сложным кариотипом при помощи FISH-анализа были выявлены делеции участков q14 хромосомы 13 и q24 хромосомы 8.
Наличие хромосомных аномалий сокращает сроки жизни больных и ухудшает показатели общей выживаемости в сравнении с пациентами без таковых (р = 0,00171). Медиана общей выживаемости в группе с хромосомными изменениями составила 11,3 мес, при их отсутствии медиана не достигнута (см. рисунок).
Обсуждение
Предполагается, что первичные нарушения происходят на ранних стадиях становления ММ, а вторичные на более поздних и поэтому ассоциируются с более агрессивным течением опухоли [21]. Многие первичные транслокации являются простыми реци-прокными и связаны с онкогеном и с одним из эн-хансеров иммуноглобулинов. Такие транслокации опосредуются ошибками в 1 из 3 механизмов модификации ДНК В-клеток: синтез иммуноглобулино-вых классов, что сопровождается ошибкой в соматической гипермутации, и, реже, VDJ-рекомбинация [22]. Как известно, транслокация с участием IGHV
Таблица 3. Результаты FISH-исследования в группах больных с различными демографическими и клинико-гематологическими параметрами
Показатель Всего Больные без хромосомных изменений Больные с хромосомными изменениями Р
Возраст, лет 53 (34-77) 56 (38-75) 56 (34-77) 0,594
Пол
Женщины 42 (54,5 %) 32 (56,1 %) 10 (50 %) 0,635
Мужчины 35 (45,5 %) 25 (43,9 %) 10 (50 %)
Стадия по Дюри—Сальмон
IA 9 (12 %) 9 (100 %) 0 0,062
IIA 6 (8 %) 6 (100 %) 0 0,145
IIIA 46(61 %) 32 (69,5 %) 14 (30,5 %) 0,722
IIIB 14 (19 %) 7 (50 %) 7 (50 %) 0,078
Тип тяжелой цепи
IgG 47 (62,6 %) 36 (76,5 %) 11 (23,5 %) 0,407
IgA 10 (13,4 %) 7 (70 %) 3 (30 %) 0,797
Другие 18 (24 %) 12 (67 %) 6 (33 %) 0,463
Тип легкой цепи
Каппа 46 (61,3 %) 35 (76 %) 11 (24 %) 0,497
Лямбда 29 (38,7 %) 20 (69 %) 9 (31 %)
Уровень гемоглобина (г/дл)
<8,5 17 (22 %) 10 (59 %) 7 (41 %)
8,5-10,0 11 (14 %) 8 (73 %) 3 (27 %) 0,030
>10,0 46 (60 %) 36 (78 %) 10 (22 %)
Нет данных 3 (4 %) - -
Уровень альбумина (г/л)
<35 13 (17 %) 6 (46 %) 7 (54 %)
>35 45 (58 %) 35 (78 %) 10 (22 %) 0,169
Нет данных 19 (25 %) - -
Уровень креатинина (мкмоль/л)
<110 55 (71 %) 45 (82 %) 10 (18 %)
>110 16 (21 %) 6 (38 %) 10 (62 %) 0,0004
Нет данных 6 (8 %) - -
Уровень кальция (ммоль/л)
<2,5 42 (54,5 %) 32 (76 %) 10 (24 %)
>2,5 17 (22 %) 11 (65 %) 6 (35 %) 0,183
Нет данных 18 (23,5 %) - -
Уровень лактатдегидрогеназы (Е/л)
<450 49 (64 %) 34 (69 %) 15 (31 %)
>450 10 (13 %) 6 (60 %) 4 (40 %) 0,818
Нет данных 18 (23 %) - -
Уровень в—микроглобулина (мг/л)
<3,5 19 (25 %) 16 (84 %) 3 (16 %)
3,5-5,5 12 (16 %) 8 (67 %) 3 (33 %) 0,100
>5,5 9 (12 %) 5 (55,5 %) 4 (44,5 %)
Нет данных 37 (48 %) - -
Таблица 4. Хромосомные нарушения, обнаруженные методом FISH у больных ММ(n = 20)
Название зонда и выявленные изменения в клетке Больные, получающие лечение Первичные больные
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
IGH (14q32) Break
(IGHx1) ■ ■ ■ ■
t(?;14) ■ ■
FGFR3/IGH t(4;14) Fusion
t(4;14) ■ ■
(FGFR3x1) ■
t(4;?;14)
CCND1/IGH t(11;14) Fusion
t(11;14) ■ ■ ■
TP53 (17p13)/ATM (11q22)
(TP53x3) ■
(TP53x4) ■
(TP53x1) ■ ■
6q21/MYC (8q24)
(MYCx3) ■
(MYCx1) ■ ■
(6q21x3) ■
(6q21x1) ■
1q21/SRD (1p36)
(1q21x3) ■ ■ ■
(1q21x4) ■
(SRDx1) ■
(1q21x1)
MM 11q23/DLEU (13q14)
(11q12—q23x3) ■ ■ ■
(11q12—q23x4) ■
(11q23x3) ■ ■ ■
(11q23x4) ■
(11q23x1) ■
(DLEUXx1) ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■
(DLEUXx4) ■
Примечание. Выделенные цветом ячейки обозначают наличие того или иного хромосомного нарушения; в скобках указан ген или регион хромосомы с количеством сигналов, обнаруженных в одной интерфазной клетке; t — транслокация.
56 Оригинальные статьи
1,0
0,9
x 0,8
=1
m ^ 0,7
S
cd 0,6
* 0,5
fu
cd 0,4
h-
0,3
0,2
0,1
0,0
I--H-- I
9-- н---+
А,
Л (---- 1__
1 1
1 1
-H ет ано малик p = 0, 00171
--- E( гть ан омали и
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Время (мес)
Общая выживаемость больных ММ с хромосомными нарушениями (n = 20) и без таковьх (n = 57)
увеличивает возможность прогрессирования болезни от 50 % при MGUS и до 90 % в клеточных линиях миеломы человека [22, 23]. В нашем исследовании транслокация t(11;14) выявлена у 3 первичных больных (4 %). Интересно отметить, что у одного из них данное нарушение обнаружено совместно с потерей одной из деривативных хромосом, с делецией участка q32 хромосомы 14 (возможно, моносомия 14) и делецией участка q14 хромосомы 13. Продолжительность жизни больного составила 3 мес после установления диагноза ММ. У другого больного с t(11;14) наблюдается дополнительная деривативная хромосома от транслокации t(11; 14), у третьего — дополнительная деривативная хромосома от транслокации t(11;14) и частичная трисомия участка q21 хромосомы 1. Транслокация t(4;14)(p16;q32) имела место у 3 больных (15 %). Данная транслокация включает 2 белок-кодирующих гена, которые располагаются на участке р16 хромосомы 4. Первый ген — MMSET (SET-домен ММ), его белок гомологичен гистону метилтрансфераз. Второй ген - FGFR3 (рецептор 3 фактора роста фибробластов), онкогенный рецептор тирозинкиназы [21]. Как было упомянуто ранее, t(4;14)(p16;q32) является криптическим цито-генетическим нарушением, которое можно обнаружить, только с помощью FISH или полимеразной цепной реакции. Транслокация t(4;14) тесно связана с моносомией хромосомы 13 или делецией длинного плеча хромосомы 13 и обычно указывает на низкие показатели выживаемости больных [15, 24—26]. Данное сочетание в нашей когорте встретилось только у 1 больного. У других же 2 пациентов t(4;14) обнаружена как единственное нарушение. В настоящей работе одним из наиболее часто встречающихся нарушений оказалась делеция региона q32 хромосо-
мы 14 — гена ЮНУ. Она имела место у 4 первичных больных и у 1 пациента на фоне противоопухолевого лечения. У первичных больных помимо делеции гена 1СНУнаблюдались дупликации участков q24 и q12—q23 хромосом 8 и 11 соответственно, ^11;14) и дополнительная деривативная хромосома от этой же транслокации, перестройки генов ЮНУ; также она встречалась как единственное нарушение. У больного с делецией гена ЮНУ, находящегося на терапии, обнаружены делеции различных участков большого числа хромосом, что возможно вследствие частичной или полной моносомии хромосом (гиподиплоидии). Пациент оказался резистентным к терапии и умер спустя месяц после проведения FISН-исследования.
Как показывают ранние публикации, при -13Д3q-наблюдается гиперэкспрессия опухолевого супрес-сора RB1, что может приводить к снижению регуляции клеточного цикла опухолевых клеток [27]. В нашем исследовании del(13)(q14) встречается у 7 (35 %) больных (4 — первичные, 3 — с прогрессированием). У первичных больных одновременно с del(13)(q14) встречаются: дупликация участка q12—q23 хромосомы 11, ^11;14), дупликация участка q21 хромосомы 6. Больные с такими дополнительными нарушениями хорошо поддаются противоопухолевому лечению и достигают состояния стабилизации. В то же время у пациента с del(13)(q14), потерей участков р13 и q23 хромосом 17 и 11 соответственно, а также наличием ^4;14) заболевание характеризовалось агрессивным течением [15-18, 26, 28]. У 2 больных с del(13)(q14), получающих терапию, наблюдались делеции участков большого числа хромосом, что резко ухудшает прогноз. Только у одной из этих больных было обнаружено множество хромосомных нарушений при помощи стандартного кариотипирования. Пациентка умерла через 3 мес после цитогенетического исследования. Увеличение числа копий q21 хромосомы 1 встречается у 35-40 % больных ММ и часто совпадает с делецией р36 хромосомы 1, которое наблюдается в 30 % случаев. Оба нарушения связаны с плохим прогнозом [19, 29-32]. Увеличение числа копий участка q21 хромосомы 1 не совпало с del(1)(p36) ни у одного больного. Однако в 1 наблюдении в процессе лечения обнаруживались del(1)(p36) и del(1)(q21), а пациент оказался резистентным к терапии и с агрессивным течением болезни.
Гемизиготная делеция хромосомы 17 и делеция р-плеча встречается у 10 % первичных больных на более поздних стадиях болезни [15, 33, 34]. На коротком плече хромосомы 17 расположен ген опухолевой супрессии ТР53. Показано, что при ММ деле-ция лишь гена ТР53 встречается менее чем в 1 %, а делеция 17р13 наблюдается в 25-37 % случаев. Ген ТР53 принимает участие в регуляции транскрипции, репарации ДНК и апоптозе. При ММ del(17)(p13)
связана с агрессивным фенотипом болезни, экстрамедуллярным распространением и худшей выживаемостью [35—39]. В нашей работе делеция участка р13 хромосомы 17 обнаружена в составе сложных карио-типов у 2 больных, что указывает на более позднюю стадию заболевания с агрессивным течением.
У единственной больной с множеством хромосомных аберраций, выявленных с помощью G-бэндинга при кариотипировании, одновременно проведено исследование методом FISH. При этом обнаружены частичная трисомия участка q12->q23 хромосомы 11, делеция участка q24 хромосомы 8, делеция участка q14 хромосомы 13, что может указывать на более поздние этапы течения заболевания. Больная умерла через 3 мес после повторного обследования, продолжительность жизни от времени установления диагноза составила 7 лет. Известно, что при обнаружении хромосомных нарушений методом дифференциальной окраски в делящихся клетках ММ отличается агрессивным течением и неблагоприятным прогнозом.
Заключение
В настоящей работе были проведены стандартное цитогенетическое исследование и FISH-анализ 77 больным с ММ. У 20 из них хромосомные нарушения обнаружены FISH-исследованием и лишь у 1 пациента хромосомные изменения были также зафиксированы при помощи стандартного карио-типирования. Хромосомные изменения, приводящие к потере участков хромосом, имели более неблагоприятный прогноз с общей продолжительностью жизни больных 3—6 мес. Таким образом, FISH-исследование позволило идентифицировать нарушения, которые либо присутствовали только в не-делящихся интерфазных клетках, либо существовали как субмикроскопические аберрации. Однако нельзя пренебрегать исследованием кариотипа методом дифференциального окрашивания ^-бэндинг), который позволяет увидеть нарушения всех хромосом в отличие от локус-специфичного FISH-ана-лиза.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L. et al. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. 2017. P. 243.
2. Morgan G.J., Walker B.A., Davies F.E. The genetic architecture of multiple myeloma. Nat Rev Cancer 2012;12(5):335-48. DOI: 10.1038/ nrc3257. PMID: 22495321.
3. Kyle R.A., Durie B.G., Rajkumar S.V. et al. Monoclonal gammopathy
of undetermined significance (MGUS) and smoldering (asymptomatic) multiple myeloma: IMWG consensus perspectives risk factors for progression and guidelines for monitoring and management. Leukemia 2010;24(6):1121-7. DOI: 10.1038/leu.2010.60. PMID: 20410922.
4. Kyle R.A., Remstein E.D., Therneau T.M. et al. Clinical course and prognosis
of smoldering (asymptomatic) multiple myeloma. New Engl J Med 2007;356(25):2582-90. DOI: 10.1056/NEJMoa070389. PMID: 17582068.
5. Langer P.R., Waldrop A.A., Ward D.C. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci USA 1981;78(11):6633-7. PMID: 6273878.
6. Luke S., Shepelsky M. FISH: recent advances and diagnostic aspects. Cell Vis 1998;5(1):49-53. PMID: 9660726.
7. Csaki A., Garwe F., Steinbruck A. et al. A parallel approach for subwavelength
molecular surgery using gene-specific positioned metal nanoparticles as laser light antennas. Nano Lett 2007;7(2):247-53. DOI: 10.1021/ nl061966x. PMID: 17249738.
8. Schröck E., du Manoir S., Veldman T. et al. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science 1996;273:494-7. PMID: 8662537.
9. Speicher M.R., Gwyn Ballard S., Ward D.C. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. Nat Genet 1996;12(4):368-75. DOI: 10.1038/ng0496-368.
PMID: 8630489.
10. Liehr T., Pellestor F. Fluorescence
In Situ Hybridization (FISH), chapter Molecular Cytogenetics: The Standard FISH and PRINS Procedure. 2009. Pp. 23-34.
11. Guan X.Y., Trent J.M., Meltzer P.S. Generation of band-specific painting probes from a single microdissected chromosome. Hum Mol Genet 1993;2(8):1117-21. PMID: 8401492.
12. Guan X.Y., Zhang H., Bittner M. et al. Chromosome arm painting probes. Nat Genet. 1996;12(1):10-1. DOI: 10.1038/ ng0196-10. PMID: 8528238.
13. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proc Natl Acad Sci USA 1986;83(9):2934-8. PMID: 3458254.
14. Smadja N.V., Bastard C., Brigaudeau C. et al. Hypodiploidy is a major prognostic
factor in multiple myeloma. Blood 2001;98(7):2229-38. PMID: 11568011.
15. Fonseca R., Blood E., Rue M. et al. Clinical and biologic implications of recurrent genomic aberrations
in myeloma. Blood 2003;101(11):4569-75. DOI: 10.1182/blood-2002-10-3017. PMID: 12576322.
16. Bergsagel P.L., Kuehl W.M. Molecular pathogenesis and a consequent classification of multiple myeloma.
J Clin Oncol 2005;23(26):6333-8. DOI: 10.1200/JCO.2005.05.021. PMID: 16155016.
17. Fonseca R., Bergsagel P.L., Drach J. et al. International Myeloma Working Group molecular classification
of multiple myeloma: spotlight review. Leukemia 2009;23(12):2210-21. DOI: 10.1038/leu.2009.174. PMID: 19798094.
18. Fonseca R., Blood E.A., Oken M.M. et al. Myeloma and the t(11;14) (q13;q32): evidence for a biologically defined unique subset of patients. Blood 2002;99(10):3735-41. PMID: 11986230.
19. Walker B.A., Leone P.E., Chiecchio L. et al. A compendium of myeloma-associated chromosomal copy number abnormalities and their prognostic value. Blood 2010;116(15):e56-65.
DOI: 10.1182/blood-2010-04-279596. PMID: 20616218.
20. Tricot G., Barlogie B., Jagannath S. et al. Poor prognosis in multiple myeloma
is associated only with partial or
complete deletions of chromosome 13 or abnormalities involving 11q and not with other karyotype abnormalities. Blood 1995;86(11):4250-6. PMID: 7492784.
21. Kuehl W.M., Bergsagel P.L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat Rev Cancer 2002;2(3):175-87. DOI: 10.1038/ nrc746. PMID: 11990854.
22. Bergsagel P.L., Kuehl W.M. Chromosome translocations in multiple myeloma. Oncogene 2001;20(40):5611-22. DOI: 10.1038/sj.onc.1204641. PMID: 11607813.
23. Bergsagel P.L., Chesi M., Nardini E. et al. Promiscuous translocations into immunoglobulin heavy chain switch regions in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93(24):13931-6. PMID: 8943038.
24. Keats J.J., Reiman T., Maxwell C.A. et al. In multiple myeloma t(4;14)(p16;q32) is an adverse prognostic factor irrespective of FGFR3 expression. Blood 2003;101(4):1520-9.
DOI: 10.1182/blood-2002-06-1675. PMID: 12393535.
25. Gertz M.A., Lacy M.Q., Dispenzieri A. et al. Clinical implications of t(11;14) (q13;q32), t(4;14) (p16.3;q32), and -17p13 in myeloma patients treated with high-dose therapy. Blood 2005;106(8):2837-40.
DOI: 10.1182/blood-2005-04-1411. PMID: 15976175.
26. Avet-Loiseau H., Attal M., Moreau P. et al. Genetic abnormalities and survival in multiple myeloma: the experience
of the Intergroupe Francophone du Myelome. Blood 2007;109(8):3489-95. DOI: 10.1182/blood-2006-08-040410. PMID: 17209057.
27. Elnenaei M.O., Hamoudi R.A., Swansbury J. et al. Delineation
of the minimal region of loss at 13q14 in multiple myeloma. Genes Chromosomes Cancer 2003;36(1):99-106. DOI: 10.1002/gcc.10140. PMID: 12461754.
28. Drach J., Ackermann J., Fritz E. et al. Presence of a p53 gene deletion
in patients with multiple myeloma predicts for short survival after conventional-dose chemotherapy. Blood 1998;92(3):802-9. PMID: 9680348.
29. Qazilbash M.H., Saliba R.M., Ahmed B. et al. Deletion of the short arm
of chromosome 1 (del 1p) is a strong predictor of poor outcome in myeloma patients undergoing an autotransplant. Biol Blood Marrow Transplant 2007;13(9):1066-72. DOI: 10.1016/j.bbmt.2007.05.014. PMID: 17697969.
30. Wu K.L., Beverloo B., Lokhorst H.M. et al. Abnormalities of chromosome 1p/q are highly associated with chromosome 13/13q deletions and are an adverse prognostic factor of the outcome of highdose chemotherapy in patients with multiple myeloma. Br J Haematol 2007;136(4):615-23.
DOI: 10.1111/j.1365-2141.2006.06481.x. PMID: 17223915.
31. Chang H., Ning Y., Qi X. et al. Chromosome 1p21 deletion is a novel prognostic marker in patients with multiple myeloma. Br J Haematol 2007;139(1):51-4.
DOI: 10.1111/j.1365-2141.2007.06750.x. PMID: 17854306.
32. Hanamura I., Stewart J.P., Huang Y.
et al. Frequent gain of chromosome band 1q21 in plasma-cell dyscrasias detected by fluorescence in situ hybridization: incidence increases from MGUS to relapsed myeloma and is related to prognosis and disease progression
following tandem stem-cell transplantation. Blood 2006;108(5):1724-32. DOI: 10.1182/blood-2006-03-009910. PMID: 16705089.
33. Avet-Loiseau H., Li J.Y., Godon C. et al. P53 deletion is not a frequent event
in multiple myeloma. Br J Haematol
1999;106(3):717-9.
PMID: 10468863.
34. Liebisch P., Wendl C., Wellmann A. et al. High incidence of trisomies 1q, 9q, and 11q in multiple myeloma: results from
a comprehensive molecular cytogenetic analysis. Leukemia 2003;17(12):2535-7. DOI: 10.1038/sj.leu.2403153. PMID: 14523465.
35. Chang H., Qi C., Yi Q.L. et al. p53 gene deletion detected by fluorescence in situ hybridization is an adverse prognostic factor for patients with multiple myeloma following autologous stem cell transplantation. Blood 2005;105(1):358-60. DOI: 10.1182/blood-2004-04-1363. PMID: 15339849.
36. Mazars G.R., Portier M., Zhang X.G. et al. Mutations of the p53 gene
in human myeloma cell lines. Oncogene 1992;7(5):1015-8. PMID: 1373872.
37. Corradini P., Inghirami G., Astolfi M. et al. Inactivation of tumor suppressor genes, p53 and Rb1, in plasma cell dyscrasias. Leukemia 1994;8(5):758-67. PMID: 8182933.
38. Neri A., Baldini L., Trecca D. et al. p53 gene mutations in multiple myeloma are associated with advanced forms
of malignancy. Blood 1993;81(1):128-35. PMID: 8417784.
39. Preudhomme C., Facon T., Zandecki M. et al. Rare occurrence of p53 gene mutations in multiple myeloma.
Br J Haematol 1992;81(3):440-3. PMID: 1390218.
Вклад авторов
А.А. Солодовник: концепция и дизайн, сбор и обработка данных, предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных, подготовка рукописи;
A.С. Мкртчян: концепция и дизайн, сбор и обработка данных, предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных, подготовка рукописи;
B.А. Мисюрин: концепция и дизайн, сбор и обработка данных, предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных;
Л.А. Кесаева: сбор и обработка данных, предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных;
Н.Н. Касаткина: сбор и обработка данных, предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных;
О.М. Вотякова: предоставление материалов исследования;
О.Ю. Якимович: предоставление материалов исследования;
Е. Г. Медведовская: предоставление материалов исследования;
А.С. Антипова: предоставление материалов исследования;
И.З. Заводнова: предоставление материалов исследования;
О.А. Коломейцев: предоставление материалов исследования;
А.Д. Ширин: сбор и обработка данных, предоставление материалов исследования, подготовка рукописи; Е.А. Османов: концепция и дизайн, предоставление материалов исследования, подготовка рукописи;
А.В. Мисюрин: концепция и дизайн, сбор и обработка данных, предоставление материалов исследования, анализ и интерпретация данных, подготовка рукописи.
Authors' contributions
A.A. Solodovnik: concept and design, data collection and processing, provision of study materials, data analysis and interpretation, article preparation;
A.S. Mkrtchyan: concept and design, data collection and processing, provision of study materials, data analysis and interpretation, article preparation;
V.A. Misyurin: concept and design, data collection and processing, provision of study materials, data analysis and interpretation; L.A. Kesaeva: data collection and processing, provision of study materials, data analysis and interpretation; N.N. Kasatkina: data collection and processing, provision of study materials, data analysis and interpretation; O.M. Votyakova: provision of study materials;
0.Yu. Yakimovich: provision of study materials; E.G. Medvedovskaya: provision of study materials; A.S. Antipova: provision of study materials;
1.Z. Zavodnova: provision of study materials; O.A. Kolomeytsev: provision of study materials;
A.D. Shirin: data collection and processing, provision of study materials, article preparation; E.A. Osmanov: concept and design, provision of study materials, article preparation;
A.V. Misyurin: concept and design, data collection and processing, provision of study materials, data analysis and interpretation, article preparation. ORCID авторов/ORCID of authors
А.А. Солодовник/A.A. Solodovnik: https://orcid.org/0000-0001-8399-057X
A.С. Мкртчян/A.S. Mkrtchyan: https://orcid.org/0000-0002-0638-213X
B.А. Мисюрин/V.A. Misyurin: https://orcid.org/0000-0002-0762-5631 Л.А. Кесаева/L.A. Kesaeva: https://orcid.org/0000-0001-8277-8649 Н.Н. Касаткина/N.N. Kasatkina: https://orcid.org/0000-0002-4735-977X О.А. Коломейцев/OA. Kolomeytsev: https://orcid.org/0000-0003-3430-8540 А.С. Антипова/A.S. Antipova: https://orcid.org/0000-0002-1731-8336
И.З. Заводнова/I.Z. Zavodnova: https://orcid.org/0000-0001-6674-8634
Е.Г. Медведовская/E.G. Medvedovskaya: https://orcid.org/0000-0002-4309-2473
А.Д. Ширин/A.D. Shirin: https://orcid.org/0000-0003-3244-7774
Е.А. Османов/EA. Osmanov: https://orcid.org/0000-0002-3067-1601
А.В. Мисюрин/A.V. Misyurin: https://orcid.org/0000-0003-1349-2879
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Благодарность. Авторы выражают благодарность ООО «ГеноТехнология», при поддержке которого была выполнена настоящая работа. Acknowledgments. Authors would like to thank LLC GeneTechnology for supporting this research.
