CC BY
10
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
стике ЛКМЗ с использованием СЦИ и FISH-исследований позволяет выделять группу крайне неблагоприятного прогноза «double-hit» ЛКМЗ и с комплексными нарушениями кариотипа. Также было показано, что в группе пациентов с изменениями гена C-MYC/8q24 чаще выявлялись ДХА, являющиеся неблагоприятным фактором прогноза: комплексные изменения кариотипа (наличие трех и более аберраций) - 85,7% и 55,6%, и аберрации с вовлечением TP53/l7p13
- 50,0% и 16,9%. Выявление изменений в данных генах ассоциировано с более короткими показателями общей выживаемости. Полученные результаты исследования позволяют выделить группу пациентов высокого риска с необходимостью безотлагательного применения высокодозной химиотерапии и современных эффективных терапевтических подходов.
Я.А. Кожевникова1, Н.В. Рисинская2, Е.Б. Ликольд2, Б.В. Бидерман2, И.С. Февралева 2, А.Б. Судариков2
ВЕРИФИКАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА НР196-1971^ (6 П.Н.) В ДОМЕНЕ TAD2 ГЕНА СЕВРА У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМ МИЕЛОИДНЫМ ЛЕЙКОЗОМ
1Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский
государственный университет имени М.В. Ломоносова», факультет фундаментальной медицины, г. Москва, 2Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва
Введение. Ген CEBPA кодирует транскрипционный фактор C/EBPa (CCAAT/enhancer-binding protein alpha), который участвует в дифференцировке клеток миелоидного ряда. C/ EBPa состоит из C-концевого ДНК-связывающего домена bZIP (basic leucine zipper) и двух доменов трансактивации TAD1 и TAD2 на N-конце. Мутации CEBPA обнаруживаются в 5-14% случаев острого миелоидного лейкоза (ОМЛ). Пациенты с ОМЛ с двойными мутациями CEBPA отличаются благоприятным прогнозом, что определяет выбор терапии. Было показано, что вставка в 6 п.н. в домене TAD2 (HP196-197ins), приводящая к появлению в белке четырех гистидин-пролиновых повторов вместо трех, распространена как среди пациентов с ОМЛ, так и в здоровой популяции, поэтому на данный момент этот полиморфизм не учитывают при стратификации риска. Рутинно для обнаружения мутаций в гене CEBPA используется ПЦР с последующим фрагментным анализом. Этот метод позволяет обнаруживать лишь вставки и делеции в участках гена и не выявляет точечные мутации; более того, он не позволяет определить точную локализацию и последовательность встав-ки/делеции. Таким образом, на данный момент полиморфизм HP196-197ins в домене TAD2 может быть ошибочно принят за мутацию при определении группы риска.
Цель. Сравнить встречаемость вставки 6 п.н. в домене TAD2 гена CEBPA у пациентов с ОМЛ, здоровых людей контрольной группы и у пациентов с гемобластозом немиелоидного происхождения (хроническим лимфоцитарным лейкозом, хЛл) в российской популяции; разработать тест-систему для подтверждения расположения вставки в области гистидин-проли-новых повторов.
Материалы и методы. В исследование включены 117 пациентов с de novo ОМЛ и 100 пациентов с ХЛЛ (70 пациентов без мутаций в области вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов (IGHV), 30 пацентов с мутациями IGHV ), проходящих лечение в Национальном Медицинском Исследовательском Центре гематологии (Москва, Россия) и 120 здоровых людей из контрольной группы. Геномная ДНК была выделена из образцов костного мозга/периферической крови, взятых во время постановки диагноза; у пациентов с ОМЛ мы также анализировали образцы, взятые после лечения. Тестирование образцов ДНК мы проводили с помощью ПЦР с флуоресцентно меченым прямым (F) праймером FAM-5'-CCGGCTACCTGGACGGCAGG-3
'и обратным (R1) праймером 5'-CGTTGCTGTTCTTTGTCCACCGAC TTCTT-3' (T Benthaus et al, 2008) с последующим фрагментным анализом (на генетическом анализаторе ABI3130, Thermofisher Scientific, США). Сравнение частот встречаемости вставки у пациентов проводилось с использованием критерия х2 Пирсона. Для верификации вставки 6 п.н. как HP196-197 нами была предложена система праймеров: прямого F (T Benthaus et al, 2008) и обратного R 5'-TGCGGGTGCGGGTGCGGGT-3' (был подобран нами комплементарным непосредственно последовательности тандемных гистидин-пролиновых повторов).
Результаты. Вставка 6 п.н. в домене TAD2 была обнаружена у 7 из 117 (6%) пациентов с ОМЛ, у 9 из 120 (7,5%) здоровых контролей и у 10 из 100 (10%) пациентов с ХЛЛ (у 8 из 70 пациентов без мутации IGHV и у 2 из 30 пациентов с мутацией IGHV ); различия между этими группами статистически не значимы (х2 = 1,234, df = 2, p = 0,540). Во всех исследованных нами образцах вставка обнаруживалась в гетерозиготной форме. У всех пациентов с ОМЛ с обнаруженной во взятых до лечения образцах вставкой 6 п.н. эта вставка также была обнаружена после лечения. С помощью предложенной нами системы праймеров было подтверждено, что вставка находится в сайте гистидин-пролиновых повторов во всех случаях. Подбор специфичных праймеров затруднен, так как вставка представляет собой дупликацию уже трижды повторяющейся последовательности. Нами подобран праймер, комплементарный и дикому аллелю, и аллелю со вставкой. В результате в случае наличия вставки HP196-197 на электрофореограмме появляются два пика (180 п.н. и 186 п.н) с соотношением высоты 3:1 (дикий аллель - 180 п.н., мутантный аллель - два продукта (180 и 186 п.н)).
Выводы. Встречаемость вставки 6 п.н. в домене TAD2 (HP196-197ins) одинакова у пациентов с ОМЛ и контрольных групп и совпадает с данными по европейской популяции. Вставка у пациентов с ОМЛ сохраняется после лечения, что свидетельствует о ее наследственной природе. В исследованных нами когортах во всех случаях обнаруженные в домене TAD2 вставки 6 п.н. являлись полиморфизмами HP196-197ins, что, однако, не исключает появления более редких вариантов вставки 6 п.н. у пациентов с ОМЛ. Предложенная нами система праймеров позволит отделить полиморфизм HP196-197INS от мутаций, возможно, имеющих клиническое значение.
