CC BY
6УДК 582.281.21:528.088.3:615.282 DOI: 10.24412/1999-6780-2021-4-39-43
ПРОФИЛИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ МУ-КОРОМИЦЕТОВ К ПРОТИВОГРИБКОВЫМ ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВАМ IN VITRO
1Выборнова И.В. (н.с.), 1Ковыршин C.B. (студент, лаборант-исследователь), 1Босак И.А. (с.н.с.), 1Павлова И.Э. (н.с.),1'2Вогомолова Т.С. (зав. лаб., доцент)*, 3Хостелиди С.Н. (доцент), 1Чилина Г.А. (зав. лаб.), 4Пинегина О.Н. (биолог отделения клинической микробиологии), 1'2Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: 1НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина; 2кафедра медицинской микробиологии; Зкафедра клинической микологии, аллергологии и иммунологии; 4Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
В статье приведены результаты определения чувствительности к амфотерицину В и позаконазолу in vitro 31 штамма мукоромицетов, выделенных от пациентов с мукормикозом. Установлено, что минимальные подавляющие концентрации амфотерицина В были значительно выше для штаммов Rhizopus spp. и Rhizomucor pusillus в сравнении с изолятами Lichtheimia spp. (р=0,00001 и р=0,0001 соответственно).
Ключевые слова: мукормикоз, мукоромицеты, чувствительность, амфотерицин В, позаконазол
IN VITRO ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY PROFILES OF CLINICAL MUCORALEAN ISOLATES
Vybornova I.V. (scientific researcher), 1Kovyrshin S.V. (student, laboratory assistant), 1Bosak I.A. (senior scientific researcher), 1 Pavlova I.E. (scientific researcher), 1'2Bogomolova T.S. (head of the laboratory, associate professor), 3Khostelidi S.N. (associate professor), 1Chilina G.A. (head of the laboratory), 4Pinegina O.N. (biologist of the clinical microbiology department),12Vasilyeva N.V. (director of the Institute, head of the department)
North-Western State Medical University named after I.I. Mech-nikov: 1Kashkin Research Institute of Medical Mycology; department of Medical Microbiology; department of Clinical
* Контактное лицо: Богомолова Татьяна Сергеевна, e-mail: tatiyana.bogomolova@szgmu.ru
Mycology, Allergy and Immunology; 4Pavlov First Saint Petersburg State Medical University, St. Petersburg, Russia
The article presents results of antifungal susceptibility testing to amphotericin В and posaconazole of 31 clinical isolates obtained from patients with mucormycosis. Minimum inhibitory concentrations of amphotericin В were significantly higher against Rhizopus spp. and Rhizomucor pusillus isolates in comparison to Lichtheimia spp. (p=0,00001 и p=0,0001, correspondingly).
Key words: mucormycosis, mucoromycetes, susceptibility, amphotericin B, posaconazole
ВВЕДЕНИЕ
Мукормикоз — инфекция, вызываемая условно-патогенными низшими мицелиальными грибами, относящимися к порядку Mucorales подотдела Mucoromycotina отдела Mucoromycota [1, 2]. Мукормикоз, как правило, развивается у пациентов на фоне иммунодефицита при тяжелых онкогематологиче-ских и онкологических заболеваниях, длительном приеме глюкокортикостероидов и некомпенсированном сахарном диабете [3]. Наиболее частыми клиническими формами этого заболевания являются рино-орбито-церебральный мукормикоз и мукормикоз легких; реже встречаются абдоминальный, кожный и подкожный мукормикоз, а также поражения других локализаций [4, 5].
Однако в эру пандемии SARS-CoV-2 участились сообщения о случаях мукормикоза в стационарах, в особенности в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ). Практика наблюдений за эпидемиологией мукормикоза в современных условиях показала, что возможны региональные вспышки этого микоза, как это было видно на примере Индии [6].
В качестве противогрибковых лекарственных средств (ПГЛС) для лечения больных мукормикозом рекомендовано применять липосомальный амфотерицин В, липидный комплекс амфотерицина В, позаконазол и изавуконазол, однако летальность при этом заболевании высокая и составляет 20%-80% [7, 8]. Неблагоприятный прогноз связан как с выраженной иммуносупрессией у больных, так и с низкой чувствительностью мукоромицетов к большинству применяемых антимикотиков. Возбудители мукормикоза являются полирезистентными патогенами, in vitro чувствительны к амфотерицину В и позаконазолу, устойчивы к эхинокандинам и вориконазолу. Сведения о чувствительности различных видов мукоромицетов к ПГЛС немногочисленны, а в отношении изолятов, выделенных в России, отсутствуют. Клинически значимые пороговые значения минимальных подавляющих концентраций (МПК) антимикотиков в отношении мукоромицетов еще не разработаны международными комитетами (CLSI и EUCAST). Накопление данных о чувствительности возбудителей мукормикоза, изолированных в различных регионах мира, к антимикотическим препа-
ратам in vitro вносит вклад в разработку клинически значимых критериев чувствительности и резистентности для этих грибов.
Цель работы: охарактеризовать штаммы муко-ромицетов, выделенные от больных, по чувствительности in vitro к двум противогрибковым препаратам - позаконазолу и амфотерицину В.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы мукоромицетов предоставлены Российской коллекцией патогенных грибов (РКПГ) на базе НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашки-на СЗГМУ им. И.И. Мечникова. В исследование включили 31 клинический изолят: 11 штаммов Lichtheimia spp. (/.. corymbifera - 5, L. ramosa - 5, L. órnala - 1), 11 штаммов Rhizopus spp. (R. arrhizus - 9 (в том числе 1 штамм от больной мукормикозом на фоне новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2), R. microsporus - 2), 7 штаммов Rhizomucor pusil-lus, 2 штамма Mucor spp. (M circinelloides - 1, M. racemosus — 1). Штаммы грибов были выделены в период с 2009 по 2021 гг. от пациентов в Санкт-Петербурге, за исключением двух: R. arrhizus РКПГ F-2140 поступил из Волгограда, L. corymbifera РКПГ F-1568 - из Казахстана.
Определение чувствительности мукоромицетов к ПГЛС осуществляли методом серийных микроразведений согласно документу EUCAST E.DEF 9.3.2. [9] с использованием субстанций позаконазола (Sigma-Aldrich, Германия) и амфотерицина В (US Biological Life Sciences, США), жидкой питательной среды RPMI-1640 с глутамином, без бикарбоната, с 2% глюкозы. Определение минимальной подавляющей концентрации проводили визуально. Значение МПК соответствовало минимальной концентрации препарата в лунке, где отсутствовал видимый рост гриба. Статистическую обработку результатов выполняли с помощью программы STATISTICA for Windows с использованием критерия Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Чувствительность изученных мукоромицетов к ПГЛС. Результаты определения чувствительности штаммов мукоромицетов к амфотерицину В и позаконазолу приведены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1
Происхождение изученных штаммов мукоромицетов и их чувствительность к амфотерицину В и позаконазолу in vitro
№ п/п Штамм Год выделения (поступления) Локализация поражения/ биоматериал МПК (мг/л)
амфо-тери-цин В позако-назол
Род Lichtheimia Vuill.
1 L. corymbifera РКПГ F-1493 2012 Верхнечелюстная пазуха 0,125 0,25
2 L. corymbifera РКПГ F-1568 2013 Верхнечелюстная пазуха 0,5 0,25
3 L. corymbifera 2013 Верхнечелюст- 0,5 0,5
РКПГ F-1601 ная пазуха
4 L. corymbifera РКПГ F-1837 2017 Ткань лёгкого 0,06 0,06
5 L. corymbifera РКПГ F-2020 2019 Верхнечелюстная пазуха 0,03 0,06
6 L. ornata РКПГ F-1507 2012 Верхнечелюстная пазуха 0,25 0,06
7 L. ramosa РКПГ F-1456 2011 БАЛ 0,5 0,25
8 L. ramosa РКПГ F-1969 2019 БАЛ 0,06 0,03
9 L. ramosa РКПГ F-2007 2019 БАЛ 0,125 0,03
10 L. ramosa РКПГ F-2019 2018 Ткань нёба 0,06 0,03
11 L. ramosa РКПГ F-2150 2021 Верхнечелюстная пазуха 0,5 0,25
Род Mucor Fresen.
12 M. circinelloides РКПГ F-2008 2019 Ткань лёгкого 0,5 0,25
13 M. racemosus РКПГ F-1435 2011 Ткань пищевода 0,25 0,125
Род Rhizomucor Lucet & Costantin
14 R. pusillus РКПГ F-1341 2009 Мокрота 1 0,06
15 R. pusillus РКПГ F-1536 2012 Мокрота 4 0,06
16 R. pusillus РКПГ F-1508 2012 БАЛ 1 0,06
17 R. pusillus РКПГ F-1545 2013 Ткань лёгкого 4 0,06
18 R. pusillus РКПГ F-1648 2014 БАЛ 4 0,125
19 R. pusillus РКПГ F-1845 2017 БАЛ 1 0,125
20 R. pusillus РКПГ F-1892 2018 БАЛ 4 0,06
Род Rhizopus Ehrenb.
21 R. arrhizus РКПГ F-1379 2009 Раневое отделяемое 1 0,125
22 R. arrhizus РКПГ F-1537 2012 БАЛ 2 0,5
23 R. arrhizus РКПГ F-1816 2017 БАЛ 2 0,5
24 R. arrhizus РКПГ F-1971 2019 БАЛ 4 0,5
25 R. arrhizus РКПГ F-2027 2019 БАЛ 2 0,5
26 R. arrhizus РКПГ F-2053 2020 Верхнечелюстная пазуха 4 0,5
27 R. arrhizus РКПГ F-2054 2020 Раневое отделяемое 1 0,125
28 R. arrhizus РКПГ F-2074 2020 БАЛ 2 0,125
29 R. arrhizus РКПГ F-21404 2021 Верхнечелюстная пазуха 4 0,25
30 R. microsporus РКПГ F-1497 2012 Мокрота 1 0,25
31 R. microsporus РКПГ F-1538 2012 Стенка кишечника 1 0,5
Примечание: *- штамм выделен от больной COVID-19; БАЛ -
бронхоальвеолярный лаваж.
МПК позаконазола (мг/л) составили 0,03-0,5 в отношении ¡ЛсЫкеита эрр., 0,125-0,25 - для ЯЫго-риъ эрр., 0,06-0,125 - для ЯЫготисог ршШш, 0,125-0,25 - для Мисог эрр. Достоверных различий по чувствительности к позаконазолу между видами муко-ромицетов не обнаружено.
МПК амфотерицина В (мг/л) составили 0,03-0,5 в отношении ЫсЫкетга эр р., 1- 4 - для КЫгория
Распределение клинических __по чувствительности к амфотери
spp. и Rhizomucor pusilhts, 0,25-0,5 - для Мисог spp. МПК амфотерицина В были значительно выше для штаммов Rhizopus spp. и Rhizomucor pusilhts в сравнении с изолятами Lichtheimia spp. (р=0,00001 и р=0,0001 соответственно). Распределение штаммов в зависимости от МПК амфотерицина В и позаконазола для родов Lichtheimia, Rhizopus и Rhizomucor показано на рисунке 1.
Таблица 2
изолятов мукоромицетов
цину В и позаконазолу in vitro_
Вид гриба (количество штаммов) Препарат МПК (мг/л)/количество штаммов
0,015 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16
L. corymbifera (5) амфотерицин В - 1 1 1 - 2 - - - - -
позаконазол - - 2 - 2 1 - - - - -
L. ramosa (5) амфотерицин В - - 2 1 - 2 - - - - -
позаконазол - 3 - - 2 - - - - - -
L. ornata (1) амфотерицин В - - - - 1 - - - - - -
позаконазол - - 1 - - - - - - - -
R. pusillus (7) амфотерицин В - - - - - - 3 - 4 - -
позаконазол - - 5 2 - - - - - - -
R. arrhizus (9) амфотерицин В - - - - - - 2 4 3 - -
позаконазол - - - 3 1 5 - - - - -
R. microsporus (2) амфотерицин В - - - - - - 2 - - - -
позаконазол - - - - 1 1 - - - - -
M. circinelloides (1) амфотерицин В - - - - - 1 - - - - -
позаконазол - - - - 1 - - - - - -
M. racemosus (1) амфотерицин В - - - - 1 - - - - - -
позаконазол - - - 1 - - - - - - -
Процентное соотношение штаммов с МПК позаконазола для Lichtheimia spp, Rhizopus spp и
R. pusillus
Lichtheimia spp. Rhizopus spp. R. pusillus
■ 0.5 мг/мл
■ 0.25 мг/мл
■ 0.06 мг/мл 0.03 мг/мл
R.pusillus
■ 0.5 мг/мл
■ 0.25 мг/мл
■ О.О б мг/мл 0.03 мг/мл
■ 0.125 мг/мл
■ 4 мг/мл
■ 2 мг/мл
■ 1 мг/мл
Rhizopus spp.
Lichtheimia spp.
Процентное соотношение штаммов с МПК амфотерицина В для Lichtheimia spp, Rhizopus spp и R. pusillus
Рис. 1. Распределение штаммов мукоромицетов в зависимости от величин МПК амфотерицина В и позаконазола.
Мы определили значения МПК амфотерицина В и позаконазола для 31 клинического штамма муко-ромицетов, выделенных от больных в России. В международном многоцентровом исследовании, проведенном Espinel-Ingroff A. et al., была изучена чувствительность к трем ПГЛС 136 штаммов L. corymbifera, 257 штаммов R. arrhizus, 146 штаммов R. microsporia, 33 штаммов R. pusillus, 123 штаммов М. circinelloides [10]. Авторы использовали метод определения чувствительности мицелиальных грибов к ПГЛС, изложенный в документе CLSI М38А-2 [11]. Диапазоны выявленных в многоцентровом исследовании значений МПК амфотерицина В (мг/л) составили: для L. corymbifera - 0,06-16; для R. arrhizus - 0,03-4; для R. microsporia - 0,06-4; для R. pusillus - 0,06-8; для М. circinelloides - 0,03-1. Диапазоны значений МПК позаконазола (мг/л) в этом исследовании составили: для L. corymbifera - 0,06-4; для R. arrhizus - 0,03-32; для R. microsporia - 0,06-16; для R. pusillus - 0,06-2; для М. circinelloides -0,06-16.
В исследовании, проведенном в США, с помощью протокола CLSI М38А-2 были изучены профили чувствительности к ПГЛС 942 штаммов мукоро-мицетов, выделенных в период с 2015 по 2019 г. Авторы выявили различия между родами возбудителей мукормикоза по чувствительности к азолам и амфо-терицинуВ [12].
Borman A.M. et al. представили результаты определения по протоколу CLSI М38А-2 МПК амфотерицина В, позаконазола, изавуконазола, итрако-назола и вориконазола для 365 клинических изоля-тов грибов из порядка Mucorales, поступивших в Национальную микологическую референтную лабораторию Великобритании в период с 2006 по 2020 гг. В этом исследовании обнаружена видоспецифи-ческая зависимость в чувствительности мукоро-мицетов к изавуконазолу и позаконазолу [13].
Espinel-Ingroff A. et al. предложили значения «эпидемиологических точек отсечения» (англ. epidemiological cut-off values, ECOFF) для амфотерицина В, позаконазола и некоторых видов мукоромице-тов. В отношении L. corymbifera значения ECOFF амфотерицина В и позаконазола составили 1 мг/л.
Для R. arrhizus ECOFF амфотерицина В составила 2 мг/мл, позаконазола - 1 мг/л; для Rh. microsporia - 2 мг/л и 1 мг/л; для М. circinelloides - 1 мг/л и 4 мг/л соответственно [10].
В работе Rivero-Menendez О. et al. отмечено, что значения МПК амфотерицина В и позаконазола в отношении мукоромицетов, выявленные методами, рекомендованными EUCAST и CLSI, существенно не различаются [14]. Анализ полученных нами результатов определения чувствительности клинических изолятов мукоромицетов in vitro показал, что у трех штаммов R. arrhizus (РКПГ F-1971, РКПГ F-2053 и РКПГ F-2140) установленные МПК амфотерицина В (4 мг/л) превышают значение ECOFF, предложенное Espinel-Ingroff A. et al. [10], что позволяет предположить снижение чувствительности к этому ПГЛС.
Таким образом, необходимо проводить мониторинг чувствительности возбудителей мукормикоза к антимикотическим препаратам в РФ, выявлять возможные механизмы резистентности этих грибов на молекулярно-генетическом уровне и на основе полученных результатов разработать клинические рекомендации по определению чувствительности этих грибов к ПГЛС.
ВЫВОДЫ
1. Минимальные подавляющие концентрации амфотерицина В значительно выше для изученных штаммов Rhizopus spp. и Rhizomucor pusillus в сравнении с изолятами Lichtheimia spp. (р=0,00001 и р=0,0001 соответственно).
2. Среди штаммов R. arrhizus, выделенных в России, встречаются изоляты, МПК амфотерицина В для которых превышает значение ECOFF, что позволяет предположить снижение чувствительности к этому противогрибковому препарату.
Работа выполнена в рамках Государственного задания 056-00056-1900 «Изучение морфо-биологических особенностей патогенных мукоромицетов - возбудителей микозов у паг/иентов с им-мунодефицитами» (2019- 2021 гг.).
ЛИТЕРАТУРА
1. Spatafora J. W., Chang Y., Benny G.L., et al. A phylum-level phylogenetic classification of zygomycete fungi based on genome-scale data. Mycologia. 2016; 108 (5): 1028-1046. doi: 10.3852/16-042
2. Walther G., Wagner /.., Kurzai O. Updates on the taxonomy of Mucorales with an emphasis on clinically important taxa. J. Fungi. 2019; 5 (4): 106. doi:10.3390/jof5040106
3. Хостелиди C.H., Шадривова О.В., Борзова Ю.В. и др. Клинико-лабораторные особенности мукормикоза у взрослых. Проблемы медицинской микологии. 2020; 22 (2): 22-28. [Khostelidi S.N., Shadrivova O.V., Borzova Yu.V., et al. Clinical and laboratory features of mucormycosis in adults. Problems in Medical Mycology. 2020; 22 (2): 22-28 (in Russ)]. doi: 10.24412/1999-6780-2020-2-22-28
4. Jeong W., Kejghley C., Wolfe R., et al. The epidemiology and clinical manifestations of mucormycosis: a systematic review and meta-analysis of case reports. Clinical Microbiology and Infection. 2019; 25: 26-34. doi.org/10.1016/j.cmi.2018.07.011
5. Skiada A., Pavleas /., Drogari-Apiranthitou М. Epidemiology and diagnosis of mucormycosis: an update. J. Fungi. 2020; 6: 265-284. doi.org/10.3390/jof6040265
6. Gandra S., Ram S., Levitz S.M. The «Black Fungus» in India: The Emerging Syndemic of COVID-19-Associated Mucormycosis. Ann. Intern. Med. 2021; 174 (9): 1301-1302. doi: 10.7326/M21-2354
7. Кли.мко H.H. Микозы: диагностика и лечение. Руководство для врачей. 3-е изд. перераб. и доп. М.: Фармтек, 2017; 272 с. [Klimko N.N. Mycoses: diagnosis and treatment. A guide for doctors. 3rd ed. reprint, and additional M.: Farmtek, 2017; 272 p. (In Russ)].
8. Cornely O.A., Alastruey-Izquierdo A., Arenz I)., et al. Global guideline for the diagnosis and management of mucormycosis: an initiative of the European Confederation of Medical Mycology in cooperation with the Mycoses Study Group Education and Research Consortium. Lancet Infect. Dis. 2019; 19 (12): e405-e421. doi: 10.1016/S1473-3099(19)30312-3
9. Arendrup M.C., Meletiadis J., Mouton W., et al. and the Subcommittee of Antifungal Susceptibility Testing (AFST) of the ESCMID European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). EUCAST Definitive Document E. DEF 9.3.2. April 2020. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for conidia forming moulds: https://www.eucast.org/astoffungi/methodsinantifungalsusceptibilitytesting/ast_of_moulds/
10. Espinel-Ingroff A., Chakrabarti A., Chowdhary A., et al. A multicenter evaluation of MIC distribution for ECV definition to detect amphotericin B, posaconazole and itraconazole resistance among the most clinically relevant species of Mucorales. Antimicrob. Agents Chemother. 2015; 59 (3): 1745-50. doi: 10.1128/AAC.04435-14
11. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2008. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi, 3rd ed. CLSI document M38-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute, Villanova, PA.
12. Badali H., Gibas С., McCarthy I)., et al. Susceptibility profile of Mucoralean fungi isolated from the United States to current antifungal drugs. Abstract Book "9th Advances against aspergillosis and mucormycosis". 2020: 76-77. www.AAAM2020.org.
13. Borman A.M., Frazer M., Patterson Z., et al. In vitro antifungal drug resistance profiles of clinically relevant members of the Mucorales (Mucoromycota) especially with the newer triazoles. J. Fungi. 2021; 7: 271. doi: 10.3390/jof7040271
14. Rivero-Menendez ()., Cuenca-Estrella M., Alastruey-Lzquierdo A. In vitro activity of APX001A against rare moulds using EUCAST and CLSI methodologies. J. Antimicrob' Chemother. 2019; 74: 1295-1299. doi.org/10.1093/jac/dkz022
Поступила в редакцию журнала 20.01.2022 Рецензент: H.H. Климко
