ПРИМЕНЕНИЕ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «HRM-ZYGO-ASP» В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ СВЕЖИХ И ПАРАФИНИЗИРОВАННЫХ, ФИКСИРОВАННЫХ В ФОРМАЛИНЕ ТКАНЕЙ БОЛЬНЫХ МУКОРМИКОЗОМ Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

УДК 582.281.21:582.282123.4:616-006 DOI: 0.24412/1999-6780-2021-3-3-12

ПРИМЕНЕНИЕ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «HRM-ZYGO-ASP» В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ СВЕЖИХ И ПА-РАФИНИЗИРОВАННЫХ, ФИКСИРОВАННЫХ В ФОРМАЛИНЕ ТКАНЕЙ БОЛЬНЫХ МУКОРМИКОЗОМ

1Игнатьева С.М. (в.н.с.)*, Богомолова Т.С. (зав. лаб.), 1Авдеенко Ю.Л. (с.н.с.), 1Фролова Е.В. (зав. лаб.), 1Учеваткина А.Е. (с.н.с.), 1Филиппова J1.В. (с.н.с.), 1Аак О.В. (в.н.с.), 1Соловьева Г.И. (в.н.с.), 1Борзова Ю.В. (зав. клиникой), 1Хостелиди С.Н. (доцент), 1Шадривова О.В. (доцент), 1Козлова О.П. (доцент), 2Попова М.О. (врач-гематолог), 3Чудиновских Ю.А. (врач-гематолог), З3юзгин И.С. (зав. отд.), 4Успенская О.С. (зав. отд.), 1Климко H.H. (зав. кафедрой), 1Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой)

1Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова (НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина; кафедра клинической микологии, аллергологии и иммунологии); 2Институт детской гематологии и трансплантологии им. P.M. Горбачевой; Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. H.H. Петрова; Ленинградская областная больница, Санкт-Петербург, Россия

Цель работы заключалась в апробации разработанной ранее мультиплексной ПЦР-тест-системы «HRM-Zygo-Asp» в режиме реального времени (РВ) с анализом кривых плавления ПЦР-продуктов высокого разрешения (HRM) для выявления и идентификации мукоромицетов. Исследовали 30 клинических образцов от 25 больных му-кормикозом: биоптаты, аутопсийный материал, операционный материал, парафиновые блоки с тканями, фиксированными в формалине. Показаны сравнительные результаты исследования биологического материала молекулярными, микологическими, гистологическими и серологическими методами. Отмечена перспективность использования мультиплексной ПЦР-тест-системы «HRM-Zygo-Asp» для выявления мукоромицетов при отрицательном результате посевов биосубстратов, а также при диагностике сочетанной мукормикоз-аспергиллезной инфекции.

Ключевые слова: мукормикоз, инвазивный аспер-гиллез, биологические образцы, оикогематологические пациенты, мукоромицеты, аспергиллы, мультиплексная тест-система

'Контактное лицо: Игнатьева Светлана Михайловна, e-mail: svetlana.ignatieva@szgmu.ru

THE USE OF THE MULTIPLEX TEST SYSTEM "HRM-ZYGO-ASP" IN REAL TIME IN THE STUDY OF FRESH AND PARAFFINIZED, FORMALIN-FIXED TISSUES OF PATIENTS WITH MUCORMYCOSIS

1lgnatieva S.M. (leading scientific researcher), 1Bogomolova T.S. (head of the laboratory), 1Avdeenko Y.L. (senior scientific researcher), 1Frolova E.V. (head of the laboratory), 1Uchevatkina A.E. (senior scientific researcher), 1Filippova L.V. (senior scientific researcher), 1Aak O.V. (leading scientific researcher), 1Solovyeva G.I. (leading scientific researcher), 1Borzova Yu.V. (head of the clinic), 1Khostelidi S.N. (associate professor), 1Shadrivova O.V. (associate professor), 1Kozlova O.P. (associate professor), 2Popova M.O. (physician-hematologist), 3Chudinovskikh Y.A. (physician -hematologist), 3Zyuzgin I.S. (head of the clinical department), 4Uspenskaya O.S. (head of the clinical department), 1Klimko N.N. (head of the department), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department)

1 North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov (Kashkin Research Institute of Medical Mycology; Department of Clinical Mycology, Allergy and Immunology); R. Gorbachova Institute of Children's Hematology and Transplantology; 3N.N. Petrov Research Institute of Oncology; Leningrad Regional Clinical Hospital, St. Petersburg, Russia

The purpose of the work was to test the previously developed multiplex PCR test system "HRM-Zygo-Asp" in real time (RV) with the analysis of the melting curves of high-resolution PCR products (HRM) for the detection and identification of mucoromycetes. 30 clinical samples from 25 patients with mucormycosis were examined: biopsies, autopsy material, surgical material, paraffin blocks with tissues fixed in formalin. Comparative results of the study of biological material by molecular, mycological, histological and serological methods are shown. The prospects of using the multiplex PCR test system "HRM-Zygo-Asp" for the detection of mucoromycetes with a negative result of biosubstrate crops, as well as in the diagnosis of combined mucormycosis-aspergillosis infection were noted.

Key words: mucormycosis, invasive aspergillosis, on-cogematology patients, mucoromycetes, Aspergillus, polymerase chain reaction (PCR), multiplex test system.

ВВЕДЕНИЕ

Мукормикоз — тяжелая инфекция, характеризующаяся быстрым прогрессированием и высокой летальностью у иммунокомпрометированных и инфи-

цированных COVID-19 пациентов [1, 2]. Для успешного лечения таких больных решающее значение имеют ранняя диагностика и противогрибковая терапия. Традиционные микроскопические и культу-ральные методы идентификации микромицетов обладают рядом недостатков, связанных с длительностью инкубации на питательных средах, морфологическими изменениями возбудителей в патологическом материале и низким высевом мукоромицетов из биологического образца (не превышает 60%). Серологические методы диагностики мукормикозов отсутствуют. При гистологическом исследовании патологического материала иногда сложно различить возбудителей мукормикоза и других микозов [3]. Мукормикоз и аспергиллез имеют сходные рентгенологические и клинические признаки, но их противогрибковая терапия отличается. Для каждой из этих инфекций ранние диагностика и начало направленного лечения имеют важное значение для снижения летальности. При мукормикозе для стартовой терапии используют липидные формы амфотерицина В, а для лечения инвазивного аспергиллеза — ворикона-зол или изавуконазол.

Использование молекулярных методов в исследовании клинического материала может улучшить диагностику и лечение мукормикоза [4]. Известно, что некоторые роды или виды Mucorales различаются по своей чувствительности in vitro, особенно к позаконазолу и изавуконазолу, при этом самый низкий показатель MIC (минимальная ингибирующая концентрация) наблюдается у некоторых Rhizopus spp. [5,6]. Молекулярные методы могут обеспечить быстрое и эффективное лечение путем точного определения рода возбудителя мукоромицета [7]. В связи с этим разработка высокочувствительных и специфичных молекулярных методов для обнаружения и видовой идентификации грибов-патогенов представляется перспективной.

Ранее [8] мы сообщали о разработанной в НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина мультиплексной ПЦР-тест-системе «HRM-Zygo-Asp» в режиме реального времени (PB) и последующим анализом кривых плавления ПЦР-продуктов высокого разрешения (HRM). Тест-система позволяет не только выявлять в биологическом материале больных одновременно возбудителей аспергиллеза и мукормикоза, но и идентифицировать аспергиллы до рода, а мукоромицеты — до вида или комплекса видов: Rhizomucor pusillus, Rhizopus microsporia, Lichtheimia corymbifera, Mucor circinelloides, Cunninghamella echinulata, Syncephalastrum racemosum, Rhizopus arrhizus / Rhizopus stolonifer, Mucor racemosus/ Mucor plumbeus.

Целью данного исследования была дальнейшая апробация разработанной тест-системы на различных типах клинического материала.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследовали 30 клинических образцов от 25 больных мукормикозом, госпитализированных в стационары г. Санкт-Петербурга и других городов РФ с 2013 по 2021 г. Диагноз устанавливали в соответствии с критериями Европейской организации по лечению и исследованию рака/группы, изучающей микозы, и Консорциумом по обучению и исследованиям микозов (EORTC/MSGERC, 2020) [9]. Микологический диагноз ставили на основании обнаружения микромицетов при прямой микроскопии биоматериала с калькофлюором белым и/или высева грибов порядка Mucorales и/или рода Aspergillus, обнаружения морфологических элементов грибов в гистологических образцах, а также положительного результата при определении галактоманнанового антигена Aspergillus spp. в БАЛ (ИОП>1,0) или сыворотке крови (ИОП>0,5) с помощью тест-системы «Platelia Aspergillus Ag» (Bio-Rad Laboratories). В качестве контрольных использовали 34 образца на-тивных и парафинизированных тканей от пациентов без микозов. ДНК выделяли из клинических образцов хлороформ-изоамиловой экстракцией и проводили амплификацию с аспергилл- и мукоромицет-специфичными праймерами и интеркалирующим красителем EvaGreen (Синтол, Москва) в модификации ранее предложенного протокола [10] на приборе Rotor-Gene 6000 (CorbettLifeScience, Австралия). При работе с парафиновыми блоками при выделении геномной ДНК выполняли предобработку образцов ксилолом, направленную на очистку от парафина.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При формировании групп больных для апробации тест-системы на основании клинических и лабораторных данных у 25 пациентов с мукормикозом были диагностированы следующие клинические формы: мукормикоз придаточных пазух носа (ППН) (п=9), мукормикоз легких (п=4), мукормикоз легких и почки (п=1), мукормикоз печени (п=2), мукормикоз желудочно-кишечного тракта (п=3), микст-микоз легкого (п=1), диссеминированный мукормикоз (п=1), диссеминированный микст-микоз, обусловленный грибами порядка Mucorales и рода Aspergillus (п=2). У 15 больных мукормикоз развивался на фоне онкогематологических заболеваний, у 2 — после политравмы, у 8 — на фоне перенесенной COVID-19 (табл. 1). Исследованы 30 образцов биологического материала различного типа: нативные (8) и парафинизированные, фиксированные в формалине ткани больных мукормикозом (22).

Таблица 1

Характеристика и тип клинических образцов больных му-_кормикозом_

Фоновое заболевание Коли- Количе-

Формы мукормикоза чество паци- Клинический материал ство образ-

ентов цов

Онкогема-тология Биоптат 1

Мукормикоз легких 3 Парафиновые блоки 2

Политравма 1 Парафиновые блоки 1

Мукормикоз печени Онкогема-тология 1 Биоптат 1

1 Парафиновые блоки 1

Мукормикоз кишечного тракта Онкогема-тология 3 Парафиновые блоки 3

Политравма 1 Биоптат 1

Мукормикоз Онкогема- 2 Парафиновые 2

придаточных тология блоки

пазух носа 4 Биоптат 4

ССЛ/Ю-19 3 Парафиновые блоки 7

Диссеминиро- Онкогема- 1 Аутопсийный материал 1

ванный мукормикоз тология Парафиновые блоки 1

Мукормикоз Онкогема- 1 Парафиновые 1

легких и почки тология блоки

Мукормикоз лимфатическо- ССЛ/Ю-19 1 Парафиновые блоки 1

го узла

Микст-микоз

легкого (аспер- Онкогема- 1 Парафиновые 1

гиллез + мукор- тология блоки

микоз)

Диссеминиро-

ванныи микст-микоз (аспер-гиллез + мукор- Онкогема-тология 2 Парафиновые блоки 2

микоз)

Биоптат, ауто-

псииныи мате- 8

Всего образцов риал

Парафиновые блоки 22

Итого 25 30

1. Исследование свежих тканей биопсийного, аутопсийного и операционного материала.

Микроскопическое исследование 5 образцов операционного материала, 2 биоптатов тканей и 1 аутопсийного материала от пациентов с мукормикозом позволило обнаружить широкий несептирован-ный мицелий, ветвящийся под прямым углом, в 6 образцах. Однако из клинического материала только 4 больных удалось получить культуру гриба: у 1 пациента с мукормикозом легких — /.. corymbifera и у 3

пациентов с мукормикозом ППН - Я. аггЫгш (табл. 2).

Таблица 2

Исследование нативных тканей пациентов с мукормикозами

При исследовании клинического материала с помощью мультиплексной ПЦР-тест-системы «HRM-Zygo-Asp» во всех 8 образцах свежей ткани были выявлены и идентифицированы возбудители мукормикоза: в 5 образцах операционного материала придаточных пазух носа — Я. аггЫгш и в 3 образцах биопсийного и аутопсийного материала — /.. согутЫ/ега, в том числе в 2 биосубстратах, в которых высев культуры был затруднен (в них была обнаружена ДНК Ь. согутЫ/ега). Результаты ПЦР-теста «НКМ-2у§о-Азр» согласовывались с данными микроскопии и посева в 100% случаев. В биопсий-ном материале контрольной группы 17 больных ДНК мукоромицетов не выявлена.

Таким образом, чувствительность тест-системы «2у§о-Азр-НКМ» в биопсийном и аутопсийном материале была выше, чем посева патологического материала. Применение мультиплексной ПЦР-тест-системы «HRM-Zygo-Asp» для анализа свежих тканей от больных мукормикозом позволяет обнаружить и идентифицировать возбудителя при отрицательном результате посева биосубстрата.

Микологическое исследо-

Коли личе че-ство образ- вание

Клинический материал Пря-мая мик-роско ско- Коли-личе- Молеку-

Диагноз че- лярное

пациента Культура ство (+) посе-се-вов исследование (+)

цов пия (+)

Мукорми- Биоп- 1 1 ИсШета 1 ИсШета

коз легких тат согутЬ^ега согутЬИега

Мукорми- Биоп- 1 1 0 ИсШета

коз печени тат согутЬйега

Мукорми- Опе-

коз придаточных пазух рационный мате- 5 3 Шгорив аггЫгив 3 Шгорив аггЫгиз

носа риал

Диссеми-нирован-ный мукормикоз Аутопсийный материал 1 1 - 0 ИсШета согутЬИега

ИТОГО: 8 6 (75%) 4 (50%) 8 (100%)

2. Исследование тканей, фиксированных в формалине и заключенных в парафин.

В 22 парафиновых блоках от 19 больных с различными формами мукормикоза гистологическими методами исследования окрашенных срезов регистрировали чаще всего наличие несептированного мицелия, ветвящегося под прямым углом, сходного с грибами порядка Mucorales. В одном случае, в клиническом материале у пациента с микст-микозом легкого мукоромицеты не были найдены, но отмечали наличие септированного мицелия, сходного с мицелием грибов рода Aspergillus. В другом случае, у больной риноцеребральным мукормикозом выявляли 2 вида мицелия: широкий несептированный мицелий, сходный с мицелием мукоромицетов, и сеп-тированный мицелий, ветвящийся под острым углом, сходный с мицелием грибов рода Aspergillus. Поскольку видовая идентификация возбудителей при гистологических исследованиях затруднена, клинический материал анализировали молекулярным методом с применением мультиплексной ПЦР-тест-системы «HRM-Zygo-Asp». Чаще всего в пара-финизированных образцах выявляли ДНК R. arrhizus (41%) и R. microsporus (27%), реже - L. corymbifera (18%) и R. pusillus (14%).

У 1 пациента с микст-микозом легкого и у 1 — с риноорбитальным мукормикозом молекулярным методом уточнена смешанная инфекция, вызванная R. arrhizus и Aspergillus spp. У 2 больных с диссемини-рованным микозом выявлена ДНК R. microsporus и Aspergillus spp. (табл. 3).

Таблица 3

Исследование парафинизированных тканей, фиксирован-

ных в формалине, у пациентов с мукормикозом

Диагноз пациента Клинический материал Количество образцов Гистологическое исследование Молекулярное исследование (+)

Lichtheimia

Мукормикоз Ткань 2 Мицелий муко- corymbifera

легких легкого 1 ромицета Rhizopus microsporus

Ткань

кишечника 9 Мицелий муко- Rhizomucor

Ткань ромицета pusillus

Мукормикоз сальника

кишечного Морфологиче-

тракта Ткань толстой кишки 1 ские признаки грибковой инвазии прямой кишки Lichtheimia corymbifera

Широкий несеп-

Мукормикоз Ткань 1 тированныи Rhizopus

печени печени мицелии муко-ромицета arrhizus

Мукормикоз Ткань 2 Мицелий муко- Rhizopus

придаточ- придаточ- ромицета microsporus

ных пазух носа ных пазух носа 6 Мицелий муко-ромицета Rhizopus arrhizus

Мицелий муко-

ромицета + Aspergillus

1 септированныи spp. + Rhi-

мицелии, ветвящийся под острым углом zopus arrhizus

Мукормикоз

лимфати- Ткань лим- 1 Мицелий Rhizopus

ческого фоузлов мукоромицета arrhizus

узла

Диссеми-нирован-ный мукормикоз Фрагменты некротизи-рованной и грануляционной ткани 1 Мицелий мукоромицета Lichtheimia corymbifera

Мукормикоз легких и почки Ткань почки 1 Мицелий мукоромицета Rhizomucor pusillus

Микст-

микоз лег- Септированный Aspergillus

кого (ас- Ткань 1 мицелии, вет- spp. + Rhi-

пергиллез легкого вящийся под zopus

+ мукорми- острым углом arrhizus

коз)

Диссеми-

нирован-ный микст-микоз (ас-пергиллез + мукорми- Ткань печени Ткань 2 Широкий несептированный мицелий муко- Aspergillus spp. + Rhizopus mi-

легкого ромицета crosporus

коз)

Итого 22 22

Диагноз сочетанного микоза подтверждали положительным высевом Aspergillus fumigatus из БАЛ у пациента с микст-микозом легкого, наличием га-лактоманнана Aspergillus spp. в БАЛ у больных с диссеминированным микозом, а также выявлением в гистологическом материале пациента с риноцеребральным мукормикозом двух типов мицелия, различающегося по ширине, характеру ветвления и наличию септ.

В 17 контрольных образцах операционного материала от больных с неподтвержденным лаборатор-но диагнозом микоза ДНК микромицетов не обнаруживали. Таким образом, чувствительность мультиплексной тест-системы «Zygo-Asp-HRM» при исследовании тканей, фиксированных в формалине и залитых парафином, была выше, чем гистологических методов. Данные исследования парафиновых блоков ПЦР-тест-системой согласовывались с результатами гистологических методов в 100% случаев. Высокая корреляция гистологической и молекулярной диагностики мукормикоза была обусловлена корректным взятием образца из патологического материала для постановки ПЦР. Для этого после просмотра окрашенных срезов тканей на стекле отмечали маркером место локализации мицелия мукоро-мицета, затем стекло накладывали на соответствую-

щий отпечаток ткани в парафиновом блоке и для молекулярного исследования брали образец из отмеченной области блока. Эффективность такого протокола подчеркнута в Глобальных рекомендациях по диагностике и терапии мукормикоза [4].

Таким образом, при исследовании 22 тканей, фиксированных в формалине и заключенных в парафиновые блоки, от 19 пациентов с мукормикозом показана перспективность использования ПЦР-тест-системы для выявления возбудителей мукормикоза и/или аспергиллеза и видовой идентификации муко-ромицетов в гистологическом материале больных.

Далее приведены отдельные примеры применения тест-системы «НЯ[\l-Zygo-Asp» в клиническом материале.

Пример 1. Применение мультиплексной тест-системы «HRM-Zygo-Asp» для исследования свежей ткани операционного материала больной с риноце-ребральным мукормикозом.

Пациентка К., 65 лет, с сахарным диабетом 2 типа перенесла новую коронавирусную инфекцию СОУШ-19, длительно принимала глюкокортикосте-роидные препараты. На фоне факторов риска развился острый верхнечелюстной синусит с образованием «черного струпа». 08.09.2021 г. была выполнена операция по удалению очага воспаления. При микроскопии операционного материала с калько-флюором белым выявлен несептированный мицелий, ветвящийся под прямым углом (Рис.1).

несептированные гифы гриба, сходного с мукоро-мицетами (Рис. 2).

Рис.1. Исследование операционного материала пациентки К. люминесцентной микроскопией с калькофлюором белым, х400.

При посеве биоматериала культуру получить не удалось. При гистологическом исследовании окрашенных срезов ткани обнаружено 2 типа мицелия с разной яркостью окрашивания при РАБ-реакции. В тканях, некротических массах, тромбированных сосудах наблюдали широкие, хаотично расположенные

Рис. 2. РАБ-реакция тканей ППН пациентки К. Стрелками указана нить широкого несептированного мицелия муко-ромицета, х400.

Также среди фибрина в некротических массах на поверхности встречались единичные, более узкие фрагменты гиф гриба с редкими септами (Рис.3).

f

Г *t 1

v<

> »г

1 VW

/ Ч

» N

Рис. 3. PAS-реакция тканей ППН пациентки К. Стрелкой указана нить тонкого мицелия с редкими септами, х400.

На основании гистологических данных пациентке сделано заключение о наличии хронического язвенно-некротического микотического синусита.

При исследовании операционного материала больной К. с помощью тест-системы «HRM-Zygo-Asp» получены кривые плавления ПЦР-продуктов ДНК (Рис. 4) с 3 пиками: в области 76-78 °С, характерной для Aspergillus spp., 81-82°С (малый пик) и 84-85°С (основной пик) - для R. arrhizus (=Rhizopus oryzae).

Л Rhizopus

• oryzae

Aspergillus I t

niger Aspergillus ; II

1 fumigatus : 11

/ А : / /1 : I il Образец : 1 j|

i^OKO // j

лнС J 1 ■■ ЛХ Ж J

Температура плавления, °С

Рис. 4. Кривые плавления ПЦР-продуктов ДНК операционного материала больной К. с микст-микозом ППН, вызванного грибами рода Aspergillus и Rhizopus arrhizus (=Rhizopus oryzae). Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Rhizopus oryzae - ДНК культур (положительный контроль), ОКО - отрицательный контроль.

Таким образом, применение мультиплексной ПЦР-тест-системы «HRM-Zygo-Asp» для анализа биоматериала больной К. позволило идентифицировать возбудителей сочетанной инфекции, обусловленной грибами рода Aspergillus и R. arrhizus.

Пример 2. Применение мультиплексной тест-системы «HRM-Zygo-Asp» для исследования парафиновых блоков пациентки С. с политравмой и мукормикозом ППН.

У пациентки С., 45 лет, с политравмой, острым нарушением мозгового кровообращения и сахарным диабетом 2 типа диагностирован некроз слизистой оболочки носа, носовой перегородки, правой гайморовой пазухи на фоне тромбоза кавернозного синуса внутренней сонной артерии (ВСА). Больной была проведена операция по удалению пораженной ткани ППН.

При гистологическом исследовании операционного материала обнаружены широкие нити несепти-рованного мицелия, ветвящиеся под углом 90°, сходного с мукоромицетами (Рис. 5).

Рис. 5. РАБ-реакция тканей ППН пациентки С. Стрелками указаны нити толстого несептированного мицелия мукоро-мицета, х400.

Рис. 6. Профили плавления ПЦР-продуктов ДНК пациентки С. с мукормикозом ППН. ДНК культур грибов - положительный контроль, ОКО - отрицательный контроль.

Ткани операционного материала, фиксированные в формалине и залитые парафином, исследовали с помощью мультиплексной ПЦР-тест-системы «HRM-Zygo-Asp». Как видно из рисунка 6, при молекулярном исследовании парафиновых блоков с тканями ППН пациентки С. мы получили пики плавления ПЦР-продуктов ДНК в диапазоне 85,5 °С, характерном для R. microsporia. Таким образом, муко-ромицет, обнаруженный в гистологическом материале, идентифицирован как R. microsporia.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранняя диагностика является ключевым моментом в лечении мукормикоза. Прямая микроскопия свежих тканей с окрашиванием калькофлюором белым или окрашенных гистологических срезов обычно позволяет отличить несептированные гифы муко-ромицетов от септированного мицелия других грибов [11-13]. Характерным морфологическим признаком мукоромицетов является также ветвление мицелия под прямым углом. Однако в некоторых случаях микроскопические исследования могут быть затруднены, когда в биосубстрате обнаруживают только короткие фрагменты мицелия без типичных лентообразных несептированных гиф. Некоторые авторы это связывают с повреждением мицелия мукоромицетов во время обработки ткани [12, 14]. Кроме того, сочетанная инфекция, вызванная грибами рода Aspergillus и порядка Mucorales, может еще больше затруднить микологическую диагностику [15, 16]. В настоящем исследовании при микроскопическом изучении свежих тканей операционного материала больных мукормикозом широкий нсссптированный мицелий, ветвящийся под прямым углом, был выявлен в 6 из 8 образцов (75%).

Идентификация этиологического агента, вызывающего мукормикоз, крайне важна, поскольку существуют различия в чувствительности к антимико-тическим средствам in vitro среди видов порядка Mucorales [17]. Однако частота выделения культуры мукоромицета из биоматериала обычно не превышает 60-68% при риноцеребральном [18] и 40-50% -

при легочном мукормикозе [19]. Наиболее распространенными возбудителями мукормикоза являются виды Rhizopus (48%), Mucor (14%), Lichtheimia (13%), Cunninghamella (7%) и Rhizomucor (6%) [20, 21]. При получении положительного высева Rhizopus spp. в 75% случаев R. arrhizus является преобладающим возбудителем, вызывающим микоз [22]. Согласно нашим данным, при посеве 8 образцов свежей ткани только в 4 образцах (50%) были выделены культуры мукоромицетов: L. corymbifera (25%) и R. arrhizus (75%), изолированный из операционного материала всех больных с мукормикозом придаточных пазух носа. У 1 пациента с гистологически подтвержденным риноорбитоцеребральным мукормикозом и отрицательным высевом мукоромицетов получен рост культуры Aspergillus flaws, что указывало на наличие сочетанной грибковой инфекции. Низкий уровень культуральной диагностики мукормикоза способствовал поиску новых маркеров инфекции. В 2019 г. Европейской конфедерацией медицинской микологии (ЕСММ) были опубликованы «Глобальные рекомендации по диагностике и терапии мукормикоза» [4], в которых уделено особое внимание мо-лекулярно-генетическим методам на основе ПЦР (сила рекомендаций BII) как потенциально перспективным для точной диагностики на ранней стадии инфекции в различных биоматериалах: свежие и парафинированные, фиксированные в формалине ткани, периферическая кровь, бронхоальвеолярный ла-важ (БАЛ) и спинномозговая жидкость. Наибольшее количество зарубежных публикаций посвящено ПЦР-исследованиям биопсийного и операционного материала больных мукормикозом [3, 23-27]. Эффективность тканевой ПЦР-диагностики во многом зависит от качественной экстракции тотальной ДНК. Для успешного получения генетического материала часто используют классические «домашние» методы на основе хлороформ-изоамиловой экстракции или применяют коммерческие наборы, например QiAmp Tissue DNA Mini Kit (Qiagen, Германия). Особые сложности представляет выявление возбудителя в парафинизированных и фиксированных в формалине тканях. Известно, что фиксация в формалине неблагоприятно сказывается на сохранности геномной ДНК, зачастую вызывая ее деструкцию, уменьшая тем самым диагностическую чувствительность молекулярного метода. Фиксация ткани на более длительный период, чем 1 неделя, может препятствовать амплификации [28]. Кроме того, для наилучшей экстракции ДНК необходима депарафинизация образца, осуществляемая чаще всего с помощью ксилола. Эффективность ПЦР-диагностики возрастает с 50% до 100% при извлечении генетического материала непосредственно с места локализации мицелия мукоромицетов в парафиновом блоке [3, 29, 30]. Нам удалось, используя такой прием, достичь высокого уровня корреляции между гистологическими наход-

ками грибов и молекулярной детекцией их в патологическом материале. В настоящее время отсутствуют стандартизованные протоколы для молекулярной идентификации грибов в тканях, фиксированных формалином и залитых парафином (FFPE), выбора метода экстракции ДНК и мишеней для постановки ПЦР. В недавней публикации Jillwin J. с соавт. [31] сообщили, что предприняли попытку разработки такого протокола. При исследовании 63 образцов тканей от пациентов с гистологически подтвержденным диагнозом инвазивного мукормикоза они показали, что наиболее эффективной является экстракция ДНК при традиционной хлороформ-изоамиловой экстракции ткани с размером образца не менее 50 мкм. Наиболее часто в молекулярных исследованиях для постановки ПЦР используются локусы ITS1 и ITS2, а также полный внутренний транскрибируемый спейсер (ITS1-5.8S-ITS2) 18S и Dl / D2 регион 28S субъединицы рибосомальных генов. Чувствительность теста в тканях, как показали Jillwin J. с соавт., была лучшей при использовании ITS1 (61,9%) в качестве мишени (по сравнению с другими локусами) и составила для грибов с септированным, несепти-рованным мицелием и дрожжей 75,5, 18,7 и 100% соответственно.

Тканевая диагностика требует наличия грибковых элементов в фиксированной формалином и залитой парафином ткани, а также указывает на доказанное грибковое заболевание, но не позволяет идентифицировать возбудитель. В настоящее время для видовой идентификации мукоромицетов в тканях рекомендовано проведение амплификации грибковой ДНК с пан-фунгальными праймерами с последующим секвенированием полученного в ходе реакции фрагмента, но только в случаях, когда морфологические элементы мукоромицетов о б н а р уж и в а ют с я гистологическим исследованием [4, 9]. Допускается также применение методов ПЦР с использованием узкоспецифичных праймеров к конкретному виду/роду возбудителя мукормикоза, позволяющих выявить одного или несколько видов/родов мукоромицетов (мультиплексный анализ) в одном образце. Высокие диагностические характеристики молекулярных методов при анализе клинического материала, заключенного в парафиновые блоки, отмечены во многих публикациях [3, 23, 26]. Springer J. с соавт. [10], например, при проведении Mucorales-специфичного ПЦР в реальном времени с применением флуоресцентного зонда Mucl8S для анализа тканей, залитых парафином, показал высокую чувствительность метода (91%) в гистологически подтвержденных образцах от 16 онкогематологических пациентов с трансплантацией солидных органов и травмами. Pandey M. и соавт. [32] провели проспективное исследование, включающее 239 клинических случаев с подозрением на инвазивный микоз в период 2015-2018 гг., и показали, что для «доказанного

мукормикоза» (п=11) чувствительность Mucorales-специфичной вложенной ПЦР и пангрибковой ПЦР составила 100%, а специфичность - 91,9 и 73,7% соответственно. При «вероятном» мукормикозе (п=129) чувствительность обеих ПЦР составляла 98,5%, а специфичность для пангрибковой ПЦР -73,7% и для Muco rafev - сп с mi ф и ч н о й ПЦР - 91,9%. Таким образом, пангрибковая ПЦР с последующим секвенированием в сочетании с Mucorales-специфической ПЦР, по мнению авторов, может играть важную роль в диагностике ИМ, особенно для тех пациентов, у кого получены отрицательные результаты как при прямой микроскопии, так и при посеве.

Поскольку секвенирование является дорогостоящим исследованием, а клинико-диагностические лаборатории не располагают специальным оборудованием, для рутинной диагностики микоза целесообразен поиск альтернативных методов идентификации основных возбудителей мукормикоза. Jillwin J. с соавт. [38] предлагают в таких случаях использовать полугнездовую ПЦР с мукоромицет-специфичными праймерами с чувствительностью 68,3% в тканях. Более высокие диагностические характеристики молекулярного метода могут быть достигнуты применением интеркалирующих красителей SYBR Green или EVA Green для проведения ПЦР в режиме РВ с анализом кривых плавления ПЦР-продуктов высокого разрешения (ПЦР/HRM), позволяющей определить род или вид возбудителя мукормикоза [33]. В формате ПЦР/HRM нами была разработана мультиплексная ПЦР-тест-система «Zygo-Asp-HRM», которая позволяет выявлять не только мукоромицеты, но и аспергиллы в тканях, а также идентифицировать мукоромицеты до вида или комплекса видов, а Aspergillus spp. - до рода. Тест-система эффективна для исследования различных типов биопсийного и операционного материала (свежие и парафинизиро-ванные ткани) больных мукормикозом. При исследовании 30 свежих и парафинизированных тканей, фиксированных в формалине, чувствительность и специфичность тест-системы «Zygo-Asp-HRM» составляла 100%. В клиническом материале выявлены следующие возбудители мукормикоза: L. corymbifera (23%), R. arrhizus (47%), R. microsporia (20%), R. pusillus (10%). Применение тест-системы особенно актуально при отрицательных результатах микроскопии и/или культуральной диагностики нативных тканей. В нашем исследовании у 3 пациентов не удалось получить культуру гриба при посеве операционного материала, но при постановке ПЦР смогли уточнить возбудителя мукормикоза: L. corymbifera — у 2 гематологических пациентов с мукормикозом печени и диссеминированным микст-микозом и R. arrhizus - у больного риноорбитоцеребральным мукормикозом, ассоциированным с COVID-19. Обладая большей чувствительностью и специфичностью,

чем традиционные микологические и гистологические методы, ПЦР-тест-система может выявлять также смешанную инфекцию, обусловленную грибами рода Aspergillus и порядка Mucorales. При исследовании 8 образцов свежих и 22 фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканей у 5 пациентов (17%) с помощью мультиплексной тест-системы была подтверждена сочетанная инфекция, обусловленная мукоромицетами и аспергиллами. У одного из этих больных при посеве биоптата была получена культура Aspergillus flavus, у другого - обнаружено 2 типа мицелия (септированный и несеп-тированный) с ветвлением под разными углами в окрашенных гистологических срезах, а у 3 человек с диссеминированным мукормикозом и микст-микозом легкого выявлен положительный результат галактоманнанового теста в БАЛ. Полученные нами результаты согласовывались с зарубежными данными, показывающими, что молекулярное обнаружение ДНК Mucorales в образцах тканей имеет клиническое применение как в свежих, так и в образцах с фиксированными формалином парафиновых тканях [3,28-30, 34,35].

В настоящее время в России отсутствуют отечественные зарегистрированные ПЦР-тест-системы для диагностики мукормикоза. За рубежом для молекулярной диагностики мукормикоза в тканях применяют собственные «домашние» методы, разрабатывают стандартизованные протоколы выделения ДНК и амплификации. Недавно появился первый зарубежный коммерческий набор в формате реального времени с использованием пан -Mucorales праймеров, валидированный для клинического применения («MucorGenius» Pathonostics). Тест предназначен для выявления в клиническом материале (бронхоальвеолярный лаваж, сыворотка крови, биопсийные образцы, в том числе парафинизирован-ные) основных возбудителей мукормикоза: Rhizopus spp., Mucor spp., Rhizomucor spp., Lichtheimia spp., Cunninghamella spp. Было проведено ретроспективное мультицентровое испытание набора на 106 образцах крови от 16 пациентов. Чувствительность в периферической крови составила 75%, частота положительных результатов была выше у гематологических больных, чем у негематологических пациентов, при доказанном мукормикозе, чем при вероятном (89% vs 57%).

ВЫВОДЫ

1. Мультиплексная ПЦР-тест-система «HRM-Zygo-Asp» позволяет выявлять и идентифицировать мукоромицеты до вида.

2. Тест-система эффективна для исследования различных типов клинического материала больных мукормикозом: биопсийный, аутопсийный и операционный материал, свежие и формализированные ткани, заключенные в парафин.

3. Тест-система обладает большей чувствительностью, чем традиционные микологические методы диагностики мукормикоза. Применение тест-системы особенно актуально при отрицательных результатах посева свежих тканей.

4. ПЦР-тест-система «HRM-Zygo-Asp» перспективна в лабораторной диагностике сочетанных инфекций, обусловленных грибами рода Aspergillus и порядка Mitcorales.

ЛИТЕРАТУРА

1. Skiada A., Pagano L.,Groll A., el al. European Confederation of Medical Mycology Working Group on Zygomycosis. Zygomycosis in Europe analysis of 230 cases accrued by the registry of the European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Working Group on Zygomycosis between 2005 and 2007. Clin. Microbiol. Infect. 2011; 17 (12): 1859-1867. doi.org/10.1111/j.1469-0691.2010.03456.x

2. Shivaprakash M.R., Martin H., Meis J. /■'., el al. ECMM/ISHAM recommendations for clinical management of COVID-19 associated mucormycosis in low-and middle-income countries. Mycoses. 2021; 64: 1028-1037. doi: 10.1111/myc.13335.

3. Salehi E., Hedayati M.T., Zoll J., et al. Discrimination of aspergillosis, mucormycosis, fusariosis, and scedosporiosis in formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens by use of multiple real-time quantitative PCR Assays. J. Clin.Microbiol. 2016; 54(11): 2798-2803. doi.org/10.1128/JCM.01185-164.

4. Comely O.A., Alastruey-Izquierdo A., Arenz I)., et al. Mucormycosis ECMM MSG Global Guideline Writing Group. Global guideline for diagnosis and management of mucormycosis: an initiative of the European Confederation of Medical Mycology in cooperation with the Mycoses Study Group Education and Research Consortium. Lancet Infect. Dis. 2019; 19 (12): e405-e421. doi: 10.1016/S1473-3099( 19)30312-3

5. Vaezi A., Moazeni M., Rahimi M.T., et al. Mucormycosis in Iran: a systematic review. Mycoses. 2016; 59 (7): 402-15. doi.org/10.llll/myc.12474

6. Guimaraes L.F., Halpern M., de Lemos A.S., et al. Invasive fungal disease in renal transplant recipients at a Brazilian center: local epidemiology matters. Transplant. Proc. 2016; 48 (7): 2306-9. doi.org/10.1016/j.transproceed.2016.06.019

7. Shigemura Т., Nakazawa Y., Matsuda K., el al. Evaluation of Mucorales DNA load in cerebrospinal fluid in a patient with possible cerebral mucormycosis treated with intravenous liposomal amphotericin B. Int. J. Infect. Dis 2014; 29: 200-2. doi.org/10.1016/j.ijid.2014.10.019

8. Игнатьева C.M., Спиридонова B.A., Богомолова Т.С. и др. Апробация мультиплексной тест-системы «HRM-ZYGO-ASP» на клиническом материале больных мукормикозами. Проблемы медицинской микологии. 2019; 21 (4): 36-42. [Ignatieva S.M., Spiridonova V.A., Bogomolova T.S., et al. Approbation of multiplex test system «HRM-Zygo-Asp» on the clinical material of patients with mucormycosis. Problems in medical mycology. 2019; 21 (4): 36-42 (In Russ)]. doil0.24412/1999-6780-2019-4-36-42

9. Donnelly J.P., Chen S.C., Kauffman C.A. Revision and Update of the Consensus Definitions of Invasive Fungal Disease From the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the Mycoses Study Group Education and Research Consortium. Clin. Infect. Dis. 2020; 71 (6): 1367-1376. doi: 10.1093/cid/cizl008

10. Springer J., Lackner M., Ensinger C., et al. Clinical evaluation of a Mucorales-specific real-time PCR assay in tissue and serum samples. J. Med Microbiol. 2016; 65 (12): 1414-21. doi.org/10.1099/jmm.0.000375

11. Marr K.A., Patterson Т., Denning D., et al. Aspergillosis DD. Aspergillosis, pathogenesis, clinical manifestations, and therapy. Infect. Dis. Clin. North Am. 2002; 16: 875-894. doi.org/10.1016/S0891-5520(02)00035-l

12. Lass-Florl C., Mayr A. Diagnosing invasive fungal diseases - limitations of microbiological diagnostic methods. Expert Opin. Med. Diagn. 2009; 3: 461-470. doi.org/10.1517/17530050902878031

13. Schelenz S., Barnes R.A., Barton R.C., et al. British society for medical mycology best practice recommendations for the diagnosis of serious fungal diseases. British society for medical mycology proposed standards of care for patients with invasive fungal infections. Lancet Infect. Dis. 2015; 15: 461-474. doi.org/10.1016/S1473-3099(15)70006-X

14. Comely O.A., Arikan-Akdagli S., Dannaoui E., et al. ESCMID and ECMM joint clinical guidelines for the diagno-sisand management of mucormycosis 2013. Clin. Microbiol. Infect. 2014; 20: 5-26. doi.org/10.1111/1469-0691.12371

15. Vaidya I)., Shah P. Coinfection by Aspergillus and Zygomycetes species in a case of acute rhinosinusitis. Case Rep. Otolaryngol. 2011; 2011: 382473. doi: 10.1155/2011/382473

16. Shashir W., Rupali S., Sujata /.. , Preeti M. Concomitant zygomycosis and aspergillosis of the rhinocerebral region in a post renal transplant patient. Indian J. Transpl. 2014; 8: 25-27. doi.org/10.1016/j.ijt.2013.12.001

17. Espinel-Ingroff A., Chakrabarti A., Chowdhary A., et al. Multicenter evaluation of MIC distributions for epidemiologic cutoff value definition to detect amphotericin B,posaconazole, and itraconazole resistance among the most clinically relevant species of Mucorales. Antimicrob. Agents Chemother .2015; 59: 1745-1750. doi.org/10.1128/AAC.04435-14

18. Chah-abarti A., Chatterjee S.S., Das A., et al. Invasive zygomycosis in India: experience in a tertiary care hospital. Postgrad. Med. J. 2009; 85: 573-581. doi.org/10.1136/pgmj.2008.076463

19. Spellberg В., Ibrahim A.S., Chin-Hong P.V., et al. The deferasirox-ambisome therapy for mucormycosis (DEFEAT Mucor) study: a randomized, double-blinded, placebo-controlled trial. J. Antimicrob. Chemother. 2012; 67 (3): 715-22. doi.org/10.1093/jac/dkr375

20. Petrikkos G., Skiada A., Lortholary ()., et al. Epidemiology and clinical manifestations of mucormycosis. Clin. Infect. Dis. 2012; 54 (Suppl.l): 23-34. doi.org/10.1093/cid/cir866

21. Binder U., Maurer E., Lass-Florl C. Mucormycosis - From the pathogens to the disease. Clin. Microbiol. Infect. 2014; 20: 60-66. doi.org/10.1111/1469-0691.12566

22. Chakrabarti A., Dhaliwal M. Epidemiology of mucormycosis in India. Curr. Fungal Infect. Rep. 2013; 7: 287-292. doi.org/10.1007/sl2281-013-0152-z

23. Drogari-Apiranthitou M., Panayiotides I., Galani I., et al. Diagnostic value of a semi-nested PCR for the diagnosis of mucormycosis and aspergillosis from paraffin-embedded tissue: A single center experience. Pathol. Re.s Prac.t 2016; 212 (5): 393-7. doi.org/10.1016/j.prp.2016.02.010

24. Ruangritchankid K., Chindamporn A., Worasilchai /V, et al. Invasive fungal disease in university hospital: a PCR-based study of autopsy cases. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015; 8 (11): 14840-52. PMID: 26823814

25. Buitrago M.J., Aguado J.M., Ballen A., et al. Efficacy of DNA amplification in tissue biopsy samples to improve the detection of invasive fungal disease. Clin. Microbiol. Infect. 2013; 19 (6): E271-7. doi.org/10.1111/1469-0691.12110

26. Gade /.., Hurst S., Balajee S.A., et al. Detection of mucormycetes and other pathogenic fungi in formalin fixed paraffin embedded and fresh tissues using the extended region of 28S rDNA. Med. Mycol. 2017; 55 (4): 385-95. doi.org/10.1093/mmy/myw083

27. Gholinejad-Ghadi N., Shokohi Т., Seifi Z, et al. Identification of Mucorales in patients with proven invasive mucormycosis by polymerase chain reaction in tissue samples. Mycoses. 2018; 61 (12): 909-15. doi.org/10.llll/myc.12837

28. Springer J., McCormick Smith I., et al. Identification of Aspergillus and Mucorales in formalin-fixed, paraffin- embedded tissue samples: Comparison of specific and broad-range fungal qPCR assays. Med. Mycology. 2019; 57: 308-313. doi: 10.1093/mmy/myy041

29. Sunagawa K., Ishige Т., Kusumi Y., et al. Renal abscess involving mucormycosis by immunohistochemical detection in a patient with acute lymphocytic leukemia: a case report and literature review. Jpn. J. Infect. Dis. 2013; 66 (4): 345-7. doi.org/10.7883/yoken.66.34537.

30. Lass-Florl ('. , Mutschlechner W., Aigner M., et al. Utility of PCR in diagnosis of invasive fungal infections: real-life data from a multicenter study. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (3): 863-868. doi: 10.1128/JCM.02965-12

31. Jillwin J., Rudramurthy S.M., Singh S., et al. Molecular identification of pathogenic fungi in formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. J. Med. Microbiol. 2020; 70 (2). doi.org/10.1099/jmm.0.001282

32. Pandey M., Xess I., Singh G., et al. Conventional PCR as a reliable method for diagnosing invasive mucormycosis in resource-limited settings. J. Med. Microbiol. 2021; 70 (5). doi.org/10.1099/jmm.0.001370

33. Lengerova M., Racil Z., Hrncirova K., et al. Rapid detection and identification of mucormycetes in bronchoalveolar lavage samples from immunocompromised patients with pulmonary infiltrates by use of high-resolution melt analysis. J. Clin. Microbiol. 2014; 52: 2824-2828. doi.org/10.1128/JCM.00637-14

34. Buitrago M.J., Bernal-Martinez /.., Castelli M. V., et al. Performance of panfungal and specific-PCR-based procedures for etiological diagnosis of invasive fungal diseases on tissue biopsy specimens with proven infection: a 7-year retrospective analysis from a reference laboratory. J. Clin. Microbiol. 2014; 52 (5): 1737-40. doi.org/10.1128/JCM.00328-14

35. Zaman K., Rudramurthy S.M., Das A., et al. Molecular diagnosis of rhino-orbito-cerebral mucormycosis from fresh tissue samples. J. Med. Microbiol. 2017; 66 (8): 1124-9. doi.org/10.1099/jmm.0.000560

Поступила в редакцию журнала 17.09.2021 Рецензент: А.Е. Тараскина