CC BY
17УДК 582.281.21:621.384.8
DOI: 10.24412/1999-6780-2021-4-44-50
МАСС-СТТЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МУКОРМИКОЗА
1'2Рябинин И.А. (м.н.с., ассистент кафедры)*, 1Ковыршин C.B. (студент, лаборант-исследователь), 1'2Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой)
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: 1НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина; 2кафедра медицинской микробиологии, Санкт-Петербург, Россия
Работа посвящена исследованию клеточной биомассы и белково-пептидного экстракта мукоромицетов методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии культуры с целью совершенствования видовой идентификации этих грибов. Изучены 36 штаммов, относящихся к Lichtheimia corymbifera, L. ornata, L. ramosa, Mucor circinelloides, M. racemosHS, Rhizomucor pusillus, Rhizopus arrhizus (oiyzae), Rhizopus microsporus, Absidia caerulea, Cunninghamella echimilata и Syncephalastrwn racemosum. Для масс-спектрометрической съемки культуры подготовлены двумя методами, которые включают получение колоний на жидкой питательной среде в различных условиях с последующим выделением экстракта (метод 1) или кислотным травлением биомассы на мишени масс-спектрометра (метод 2). Предложен оригинальный прием съемки типовых MALDI-масс-спектров высокой сум-мации. Описаны особенности композиции масс-спектров представителей различных таксономических групп.
Создана оригинальная «библиотека», включающая 49 типовых масс-спектро-профилей для всех изученных видов мукоромицетов, предназначенная для совершенствования идентификации этих грибов с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии.
Ключевые слова: «библиотека» масс-спектро-профилей, видовая идентификация, мукормикоз, MALDI-TOF-масс-спектрометрия, Mucoromycotina
MASS SPECTROMETRY CHARACTERISTIC OF MUCORMYCOSIS CAUSATIVE AGENTS
12Ryabinin I.A. (scientific researcher, assistant of the department), 1Kovyrshin S.V. (student, laboratory assistant), 12Vasilyeva N.V. (director of the Institute, head of the department)
North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: 1Kashkin Research Institute of Medical Mycology; department of Medical Microbiology, St. Petersburg, Russia
* Контактное лицо: Рябинин Игорь Андреевич, e-mail: lgor.Ryabinin@szgmu.ru
The study is devoted to investigation of cell biomass and protein extract of mucoromycetes by MALDI-TOF-mass-spectrometry from the culture in order to improve the species identification of these fungi. 36 strains belonging to Lichtheimia corymbifera, L. ornata, L. ramosa, Mucor circinelloides, M. racemosus, Rhizomucor pusillus, Rhizopus arrhizus (oryzae), Rhizopus microsporus, Absidia caerulea, Cunninghamella echimilate and Syncephalastrum racemosum were studied. Cultures were prepared by 2 methods, which include obtaining colonies on liquid nutrient medium under various conditions, followed by isolation of the extract (method 1) or acid etching of the biomass on the mass-spectrometer target (method 2). An original technique for recording typical MALDI-mass-spectra of high summation is proposed. The features of the composition of mass-spectra of representatives of various taxonomic groups are described.
An original «library», including 49 typical main spectral profiles for all studied species of mucoromycetes, designed to improve the identification of these fungi using MALDI-TOF mass-spectrometry, was created.
Key words: «library» of main spectral profiles, species identification, mucormycosis, MALDI-TOF-mass spectrometry, Mucoromycotina
ВВЕДЕНИЕ
Линейная матрично-активированная лазерная ионизационно/десорбционная времяпролетная масс-спектрометрня (MALDI-TOF-MS) клеточной биомассы или клеточного экстракта микроорганизмов — хорошо зарекомендовавший себя эффективный подход к видовой идентификации бактерий и микроскопических грибов. Возможность идентификации бактерий этим методом была показана еще в 1990-е годы XX в., а в 2001 г. Amiri-Eliasi В. и Fenselau С. сообщили об опыте получения клеточного лизата из Saccharomyces cerevisiae с помощью муравьиной кислоты и его белково-пептидной композиции, которую исследовали методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии [Amiri-Eliasi В., Fenselau С. Anal. Chem. 2001; 73 (21): 5228-31]. Также эти авторы указали на различия композиции масс-спектров подобных простых экстрактов, получаемых из дрожжей разных видов, и высказали идею о возможности использования такого подхода для видовой идентификации микромицетов. Данная работа, по-видимому, является одной из наиболее ранних в сфере внедрения MALDI-TOF-MS в медицинскую микологию, поскольку сообщения, опубликованные до этого, в основном касались вопросов биохимии грибов, изучения свойств отдельных белков, то есть имели в большей степени фундаментальный характер.
Трудно определить причины, вследствие которых MALDI-идентификация грибов развивалась сравнительно медленно: почти в то же время, что и ранее названное сообщение, в свет вышли работы по использовании MALDI-TOF-MS для исследования протеома S. cerevisiae, разделённого методом
двумерного гель-электрофореза (значительно более сложная процедура!) [Wildgruber R., et al. Proteomics. 2002; 2 (6): 727-32], a в бактериологию уже внедряли метод PCR-MALDI как альтернативу классическому таргетному ДНК-секвенированию [von Wintzingerode F., et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2002; 99 (10): 7039-44].
В 2000-2005 гг. также появились первые сообщения о получении характеристических MALDI-масс-спектров у мицелиальных грибов: Pénicillium spp., Aspergillus spp., Trichophyton rubrum, Scytalidi-um (Neoscytalidium) dimidiatum [Weiham K.J., et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000; 14 (5): 307-10; Li T.Y., Liu B.H., Chen Y.C. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000; 14 (24): 2393-400; Chen H.Y., Chen Y.C. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005; 19 (23): 3564-8]. В этих работах использовали споры грибов, впоследствии от такого материала стали отказываться по причине сравнительно слабой деталировки получаемых масс-спектров и невысокой дискриминационной способности метода. Необычный опыт представлен Valentine N.B. и соавторами [Valentine N.B., et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2002; 16 (14): 1352-7], где в числе разных методов пробоподготовки они использовали двустороннюю липкую ленту, на которой получали отпечаток материала колонии и монтировали его затем на мишень масс-спектрометра. Такой подход опробован ими для Aspergillus niger, Rhizopus oryzae (arrhizus), Trichoderma reesei и Phanerochaete (Phanerodontia) chrysosporium.
В результате развития данного направления в конце первого десятилетия XXI в. появились сообщения об успешном применении MALDI-TOF-MS с целью видовой идентификации мицелиальных грибов. Ранние исследования посвящены идентификации дерматомицетов [Erhard M., et al. Exp. Dermatol. 2008; 17 (4): 356-61], а также представителей родов Aspergillus и Pénicillium [Hettick J.M., et al. Anal Biochem. 2008; 380 (2): 276-81; Hettick J.M., et al. Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 2008; 22 (16): 2555-60]. Авторы этих сообщений работали с материалами колоний, которые включали и мицелий, и споры (конидии). Однако приведённые Hettick J.M. масс-спектры в сравнении с результатами современных съемок еще были несовершенны.
В настоящее время большинство коммерчески «библиотек» масс-спектро-профилей (МСП) для идентификации микроорганизмов (например, SARAMIS, Andromas, MALDI Biotyper, Bacto-SCREEN) содержат в своем составе большое количество записей по дрожжевым грибам, что позволяет проводить определение практически всех медицински значимых представителей этой группы с надежностью, приближающейся к таргетному ДНК-секвенированию. В стандартных «библиотеках» МСП мицелиальных грибов обычно представлены в
небольшом разнообразии, для более эффективной работы с данной группой часто необходимо устанавливать дополнительные тематические «библиотеки» (например, Fungi Library). При их составлении и далее в практической работе используют получение взвешенных в жидкой питательной среде микроколоний-«пеллет», не содержащих споры, либо фрагментов краевого мицелия колонии, выращенной на плотной питательной среде.
Многими исследовательскими коллективами установлено, что коммерческие «библиотеки» типовых МСП, необходимые для MALDI-идентификации микроорганизмов, требуют дополнения по разделу мицелиальных грибов. Разработаны базы (библиотеки) МСП, позволяющие дифференцировать важнейших возбудителей мукормикоза человека на уровне видов и вариантов [1-3], однако в отечественной практике таковые отсутствуют.
Кроме того, в ряде исследований удалось выявить связь композиции MALDI-масс-спектра Aspergillus spp. и Candida spp. с особенностями чувствительности микромицетов к противогрибковым лекарственным средствам (ПГЛС). Как показано рядом авторов, этот феномен может проявляться как в присутствии антимикотика в питательной среде [4, 5], так и в его отсутствии [6]. Однако мукоро-мицеты еще не изучены в данном аспекте.
Цель работы: охарактеризовать штаммы му-коромицетов по физико-химическим свойствам, выявляемым посредством MALDI-TOF-масс-спектрометрии, для совершенствования подходов к идентификации возбудителей мукормикоза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы мукоромицетов предоставлены Российской коллекцией патогенных грибов: Lichtheimia corymbifera РКПГ F-1493, F-1568, F-1601, F-1837, F-2020; Lichtheimia ornata РКПГ F-1507; Lichtheimia ramosa РКПГ F-1456, F-1969, F-2007, F-2019, F-2150; Mucor circinelloides РКПГ F-1977*, F-2008; Mucor racemosus РКПГ F-1435, F-35*; Rhizomucor pusillus РКПГ F-1341, F-1536, F-1508, F-1545, F-1648, F-1845, F-1892; Rhizopus oryzae РКПГ F-1379, F-1537, F-1816, F-1971, F-2027, F-2053, F-2054, F-2074, F-2140; Rhizopus microsporus РКПГ F-1497, F-1538; Absidia coerulea РКПГ F-63*; Cunninghamella echinulata РКПГ F-178; Syncephalastmm racemosum РКПГ F-1380. Штаммы, отмеченные знаком «*», были выделены из объектов внешней среды. Видовая идентификация штаммов выполнена путем тар-гетного ДНК-секвенирования локуса внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) согласно международному протоколу CLSI MM18-2nd Ed. Данные любезно предоставлены НИЛ молекулярно-генетической микробиологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина.
Подготовка культур к MALDI-TOF-масс-спектрометрии.
Штаммы мукоромицетов предварительно выращивали на скошенном картофельно-глюкозно-дрожжевом агаре при 25 °С 10 суток.
Далее пробоподготовку к масс-спектрометрическому выполняли по двум протоколам. Первый метод (пробный): культуры пересевали в биологические пробирки на 5 мл среды Сабуро в модификации Эммонса, инкубировали при 28 °С 4 суток.
Затем первый «урожай» биомассы снимали для экстракции белков и пептидов, еще через 3 суток получали новый материал, который также подвергали экстракции. Получение и подготовку экстрактов для MALDI-TOF-масс-спектрометрии провели, как описано ранее [8]. Таким методом обрабатывали культуры штаммов: А. caerulea РКПГ F-63; С. echinulata РКПГ F-178; L. ramosa РКПГ F-1456; М. racemosus РКПГ F-35; R. pusillus РКПГ F-1341; R. microsporia РКПГ F-1497; R. arrhizus РКПГ F-1048; S. racemosum РКПГ F-1380. После оценки эффективности пробоподготовки первым методом для всех штаммов Lichtheimia spp., Mucor spp., R. pusillus, Rhizopus spp. осуществили подготовительные манипуляции с использованием второго метода.
Второй метод заключался в следующем: культуры с плотной питательной средой пересевали в пробирки типа Эппендорф объемом 2,5 мл, наполненные на 1 мл средой Сабуро в модификации Эммонса. Такие посевы закрывали стерильными ватными пробками и инкубировали при 28 °С 4 суток.
Затем из полученных культур удаляли питательную среду и обрабатывали их 70% водным этанолом в объеме 1 мл 2 ч, после чего этанол удаляли. Далее биомассу из каждой пробирки извлекали, наносили на мишень MALDI-TOF-масс-спектрометра «МТР 384 target plate polished steed ВС», распределяя стерильными палочками равномерно вдоль рядов мишени так, чтобы объем биомассы, попавшей на позиции, был примерно эквивалентен. Таким образом, материал мини-колонии размещался в форме ленты. Образцы распределяли на мишени «через ряд», чтобы при экстракции жидкие продукты разных образцов не смешивались. Далее биомассу колоний протравляли 70% муравьиной кислотой и высушивали под тягой. После этого каждую «ленту» биомассы колонии с помощью микродозатора покрывали равномерно слоем MALDI-матрицы. В качестве матрицы использовали насыщенный при 25 °С раствор альфа-циано-4-гидроксициннамовой кислоты в растворителе «OS» (Bruker Daltonik GmbH, Германия). Объем раствора матрицы подбирали индивидуально для каждой пробы биомассы, чтобы покрыть ее равномерно.
Съемку MALDI-масс-спектров провели на масс-спектрометре Autoflex speed TOF/TOF с пакетом программного обеспечения flexControl v. 3.4, flex Analysis v. 3.4, MALDI Biotyper v. 3.1 с базами «Bruker Taxonomy» и «Fungi Library» (Bruker Daltonik GmbH, Германия) в режиме «МВТ» с ручным управлением процессом ионизации. Полученные масс-спектры преобразовывали методом «псевдогелей» с нормализацией, для их наиболее подробной выкопировки программное окно MALDI Biotyper ОС распределили на 2 рабочих монитора. Кроме того, собранные MALDI-масс-спектры сравнивали методом построения матрицы сложного коэффициента корреляции (для всего диапазона съемки спектра в данном режиме), а также преобразовывали их в МСП и сопоставляли с типовыми МСП мукоромицетов, депонированными в библиотеке «Fungi Library», путем иерархической кластеризации (расчёт дистанции по Минковскому, связь по Уорду).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Особенности съемки MALDI-масс-спектров мукоромицетов.
При исследовании культур мукоромицетов, подготовленных первым способом, отметили, что просмотр «единичных» масс-спектров во всем диапазоне ионизации часто не позволяет понять, какие именно спектры следует суммировать при съемке образцов. Для преодоления этой проблемы применили оригинальный прием съемки: после просмотра нескольких не суммированных единичных спектров, снятых с разных точек позиции мишени, выбирали лучший и сужали область просмотра спектра до пределов пика или комплекса пиков, которые в нем видны наиболее отчетливо. После этого все последующие единичные спектры суммировали с предыдущим только на основании наличия избранного пика или комплекса пиков. Когда в результате ручной ионизации позиции мишени оператор более не мог выбрать новых точек, дающих результативный спектр, суммацию прекращали. После снятия границ искусственно установленного окна просмотра появлялся характеристический MALDI-масс-спектр, отражающий особенности исследуемой культуры. Таким способом удалось снять MALDI-масс-спектры со всех четырехсуточных культур мукоромицетов, подготовленных первым способом. Но пролонгированная инкубация (получение второго «урожая» биомассы культуры на 7-е сутки) не позволила получить удовлетворительную съемку у Rhizopus spp., М. racemosus, R. pussillus, S. racemosum. При сравнении снятых MALDI-масс-спектров мукоромицетов методом «псевдогелей» установили, что в масс-спектрах штаммов А. caerulea, С. echinulata и L. ramosa имелись пики, стабильно присутствующие на разных сроках инку-
бации культуры, а также и вариабельные пики, появляющиеся только на конкретном сроке инкубации (Рис. 1). Кроме того, наблюдали отдельные пики, повторяющиеся в MALDI-масс-спектрах, из культур мукоромицетов разных видов: (1) у R. pusiUus и S. racemosum (2) у R. microsporus и R. arrhizus, (3) у L. ramosa и А. caerulea, (4) у С. echinulata, М. racemosus, R. microsporus и R. arrhizus, (5) у R. pusillus, S. racemosum и С. echinulata.
Rh. pusillus Syncephalastrum sp. C. echinulata (2) C. echinulata (1) M. racemosus R. microsporus R. oryzae A. caerulea (2) Д. coerulea (1) L. ramosa (2) L. ramosa (i)
—пики, стабильные у штамма
— пики, общие у разных видов
— вариабельные пики внутри одного штамма
—•—'—-—I— 8 т/г (10А3) 10
(1) - 4 суток инкубации; (2) - 7 суток инкубации
Рис. 1. Сравнительные особенности композиции MALDI-масс-спектров различных мукоромицетов, показанные методом «псевдогелей».
Как оказалось, примененный здесь альтернативный прием сбора суммарного MALDI-масс-спектра образца требует большой кратности съемки. Так, для стандартной съемки экстракта из клеток Aspergillus spp. или Candida spp., по опыту исследования этих грибов [9, 10], требуется 12-17 тыс. ла-зер-импульсов, а для мукоромицетов — 20-30 тыс. Поэтому для основной совокупности штаммов нами был применен второй способ пробоподготовки.
Краткая характеристика полученной базы MALDI-масс-спектров. В результате проведённой съемки удалось создать базу, включающую 2 масс-спектра А. caerulea, 2 - С. echinulata, 10 - L. corymbifera, 6 - L. ramosa, 1 - L. ornata, 4 - M. circinelloides, 2 - M. racemosus, 8 — R. pusillus, 3 — R. microsporus, 10 - R. arrhizus, 1-5". racemosum. Из части изученных штаммов MALDI-масс-спектры были сняты повторно: по два — из А. coerulea РКПГ F-63, С. echinulata РКПГ F-178, L. ramosa РКПГ F-2150, R. pusillus РКПГ F-1341 и R. microsporus РКПГ F-1497; по три - из L. ramosa РКПГ F-1456, М. circinelloides «35-2» и L. corymbifera РКПГ F-2020. Масс-спектры сняты с использованием высокой суммации для того, чтобы, несмотря на сложности работы с микромицетами этой группы, полученные записи послужили для формирования типовых МСП. Для формирования одного масс-спектро-
профиля в суммарный спектр включали единичные спектры, снятые от 8100±5300 лазер-импульсов (в формате М±2о). При сравнении полученных оригинальных МСП с типовыми МСП оказалось, что подавляющее большинство оригинальных МСП формируют обособленную кладу, отделяющуюся от клады МСП мукоромицетов из зарубежных коллекций на высоком уровне ветвления дендрограммы. Наблюдали также и исключения. Так, масс-спектро-профили М. circinelloides РКПГ F-1977 оказались включенными в общую ветвь МСП Mucor spp. из зарубежных коллекций, МСП R. microsporus РКПГ F-1497 расположились вблизи «ветви» R. microsporus RVA 081 VML, а МСП R. pusillus РКПГ F-1341 попали в «сестринскую» группу клады R. pusillus IBML 092 VML и IBML 024 VML. B-целом использованная стандартная «библиотека» МСП позволила идентифицировать только 2 штамма из включенной в исследование выборки — L. corymbifera и М. circinelloides, притом показатель достоверности идентификации («Score Value») оказался сравнительно невысоким, порядка 1,7 — 1,8.
Таким образом, предпринятый здесь метод получения пленчатой мини-колонии позволяет снимать MALDI-масс-спектры с несколько иной композицией, нежели методы получения взвеси микро-колоний-«пеллет» или травления краевого мицелия, которые используют в зарубежной практике. Однако метод пленчатых мини-колоний более оправдан с гигиенической точки зрения, поскольку в нем минимизируется образование аэрозоля аллергенных продуктов микромицетов (как это может возникнуть в методе «пеллет») и контаминация поверхности мишени спорами микромицетов (как это происходит в методе травления краевого мицелия).
Созданная база (библиотека) масс-спектро-профилей из представителей Mucoromycotina получена в формате, совместимом с программным обеспечением MALDI-TOF-масс-спектрометров, что позволяет в дальнейшем использовать ее для масс-спектрометрической идентификации мукоромицетов.
В работе Dolatabadi S. и соавт. [1] создали сравнительно простую базу из 30 МСП штаммов R. arrhizus и R. microsporus, но примечательно, что с помощью этой базы удается дифференцировать трудноразличимые варианты R. arrhizus var. arrhizus (классический) и R. arrhizus var. delemar (имеет промышленное значение). Сравнительно подробная база МСП для идентификации мукоромицетов была разработана Schwarz Р. и соавторами [2], она позволяет дифференцировать 12 видов и вариантов мукоромицетов, включая L. corymbifera, L. ramosa, L. ornata, M. circinelloides f. circinelloides, M. indicus, R. miehei, R. pusillus, R. microsporus var. chinensis, R. microsporus var. oligosporus, R. arrhizus, S. racemosum, C. bertholletiae. Данная база показала
свою эффективность в ходе практической апробации. Однако к ее особенностям следует отнести сравнительно небольшое число штаммов основных возбудителей мукормикоза, взятых для получения МСП. Некоторые авторы представили не самостоятельные базы (библиотеки) МСП, а дополнения для стандартных коммерческих баз. Так, Shao J. и соавторы [3] использовали «Fungi Library», которую дополнили МСП М. irregularis, М. hiemalis, М. racemosus, С. echinulata, С. bertholletiae и С. phaeospora.
Таким образом, сформированная нами база МСП по своему таксономическому составу соответствует уровню современных разработок в этой сфере.
Особенности композиции MALDI-масс-спектров у основных возбудителей мукормикоза
определены путем сравнения нормализованных «псевдогелей» и матриц сложного коэффициента
корреляции (Рис. 2). Как оказалось, наиболее однородную группу представляют штаммы /?. ртШив. Внутри группы с другими изолятами отчетливые различия демонстрирует только Я. ршШш РКПГ Б-1892. В составе их масс-спектра находится доминантный высокоинтенсивный пик 7,6 кЕ)а, также «дуплет» из пиков в сегменте 6,6-6,8 кЕ)а (в более низкомолекулярной области от него иногда заметна серия из 3-4 пиков от уровня около 6,2 кЕ)а), а также отчетливые пики 3,2 кОа и 3,8 кОа (последний — двойной). У большинства штаммов также имеется комплекс 4,4-4,6 Юа, а также малоинтенсивный пик в диапазоне 5,2-5,4 Юа (но у К. ршШш РКПГ Б-1341 он может быть доминантным). У атипичного штамма Я. ршШш РКПГ Г-1892 пик 7,6 Юа имеет малую интенсивность, комплекс 4,4-4,6 кОа не определяется, но есть 3 собственных комплекса близко расположенных пиков в диапазоне 3,2-3,6 кБа.
Mucoromycotina
■
■
■
■
■
■
■
1 ■
■
■
■ 1
■
■ ■
46: Syncephalastrum_racemosum_RCPF_F-1380
45: Rhizopus_oryzae_RCPF_F-2140
44: Rhizopus oryzae RCPF_F-2074
43: Rhizopus_oryzae_RCPF_F-2054
42: Rhizopus_oryzae_RCPF_F-2053
41: Rhizopus_oryzae_RCPF_F-2027
40: Rhizopus_oryzae_RCPF_F-1971
39: Rhizopus_oryzae_RCPF_F-1537
38: Rhizopus_oryzae_RCPF_F-1379
37: Rhizopus_oryzae_RCPF_F-1048
36: Rhizopus_microsporiis_RCPF_F-1538
35: Rhizopus_microsporiis_RCPF_F-1497_sc2
34: Rhizopus_microsporus_RCPF_F-1497_sc1
33: Rhizomucor_pusilus_RCPF_F-1341_sc1
32: Rhizomucor_pusillus_RCPF_F-1892
31: Rhizomucor_pusillus_RCPF_F-1845
30: Rhizomucor_pusillus_RCPF_F-1648
29: Rhizomucor_pusillus_RCPF_F-1545
28: Rhizomucor_pusillus_RCPF_F-1536
27: Rhizomucor_pusillus_RCPF_F-15D8
26: Rhizomucor_pusillus_RCPF_F-1341_sc2
25: Mucor_racemosus_RCPF_F-35
24: Mucor_racemosus_RCPF_F-1435
23: Mucor_circinelloides_RCPF_F-35-2_sc3
22: Mucor_circinelloides_RCPF_F-35-2_sc2
21: Mucor_circinelloides_RCPF_F-2008
20: Mucor circinelloides CMM 3B-2_sc1
19: Lichtheimia_ramosa_RCPF_F-2150
1B: Lichtheimia_ramosa_RCPF_F-1456
17: Lichtheimia_ornata_RCPF_F-1507
16: Lichtheimia_corymbtfera_RCPF_F-2020_sc3
15: Lichtheimia_corymbrfera_RCPF_F-2020_sc2
14: Lichtheimia_corymbifera_RCPF_F-2020_sc1
13: Lichtheimia_ramosa_RCPF_F-2019
12: Lichtheimia_ramosa_RCPF_F-2007
11: Lichtheimia_ramosa_RCPF_F-1969
10: Lichtheimia_corymbifera_RCPF_F-1837
Lichtheimia_corymbifera_RCPF_F-1601
Lichtheimia_corymbifera_RCPF_F-1568
Lichtheimia_ramosa_RCPF_F-1456_1st_extract
Cunningamella_echinulata_RCPF_F-178_1st_extract
Absidia_coerulea_RCPF_F-63_2nd_extract
Cunningamella_echinulata_RCPF_F-178-2nd_extract
Lichtheimia_corymbifera_RCPF_F-1493
Lichtheimia_ramosa_RCPF_F-1456_2nd_extract
Absidia coerulea RCPF F-63 1st extract
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46
Рис. 2. Сопоставление MALDI-масс-спектров мукоромицетов методом построения матрицы сложного коэффициента корреляции. По вертикальной и горизонтальной оси матрицы цифрами обозначены масс-спектры, справа указаны советующие им штаммы. Обозначения: sei, sc2, sc3 - субкультуры штамма; 1st extract, 2nd extract - последовательно полученные экстракты из культур, подготовленных первым способом (см. «Материалы и методы»); М. circinelloides CMM 35-2 = РКПГ F-1977. На пересечении перпендикуляров к горизонтальной и вертикальной оси показаны результаты попарного сравнения масс-спектров, значение коэффициента корреляции отражено цветом шкалы тепловизора.
Несколько более гетерогенной представляется группа штаммов Lichtheimia spp. Внутри группы L. corymbifera атипичные свойства проявил штамм РКПГ F-2020. Примечательно, что масс-спектры штамма L. ornata и ряда штаммов L. ramosa не имеют отчетливых отличий от штаммов L. corymbifera. Из штамма L. ramosa РКПГ F-1456 удалось получить 3 масс-спектра, из них 2 отличались от группы масс-спектров L. corymbifera и других штаммов L. ramosa, но третий, напротив сходен с ними. У большинства Lichtheimia spp. виден комплекс из 1-3 близко расположенных пиков около 7 kDa, пик 6,2 kDa (у L. ornata РКПГ F-1507 и L. ramosa РКПГ F-1456 может не прослеживаться или быть низкоинтенсивным), комплекс 5,0-5,2 kDa (у L. ornata РКПГ F-1507 и L. ramosa РКПГ F-1456 более широкий), высокая серия пиков 4,4-4,9 kDa (у L. ornata РКПГ F-1507 и L. ramosa РКПГ F-1456 смещена в низкомолекулярную строну), «дуплет» из пиков 3,8 kDa. У всех представителей роды виден пик по m/z чуть более 3,2 kDa, за ним нередко следует близко расположенная серия пиков высокой интенсивности.
Наиболее гетерогенными оказались штаммы R. arrhizus: коэффициент корреляции в матрице у этой группе имел наименьшие значения. При сравнении масс-спектров между собой трудно выявить стабильные компоненты. К таким можно условно отнести: пики 8,0 и 7,0 kDa, «дуплет» из пиков 3,8 kDa, серии пиков, расположенные в областях 3,2-3,4 kDa, 3,4-3,6 kDa, а также 4,0 kDa. У различных штаммов встречается множество других сочетаний пиков, в части случаев они повторяются, иногда, напротив, уникальны для конкретного штамма.
В отношении других изученных групп мукоро-мицетов сложнее судить о масс-спектрометрическом разнообразии из-за небольшого количества доступных для исследования штаммов. У R. microsporus относительно постоянные компоненты представлены в MALDI-масс-спектре пиками 7,1; 6,2; 5,8 kDa, группами по 3 пика в интервалах 6,4-6,8 и 4,2-4,4 kDa, сериями пиков в диапазонах 3,2-3,6 kDa и 3,8-4,0 kDa. В масс-спектрах из культур М. circinelloides ярко представлены такие компоненты, как пики 7,0; 6,8; 6,45; 5,6; 5,4; 5,0; 3,4 kDa, комплекс из 4-х пиков в интервале 4,0-4,0 kDa; серия пиков в интервале 6,0-6,2 kDa.
ВЫВОДЫ
1. Метод получения поверхностной мини-колонии с обработкой биомассы на масс-спектрометрической мишени в форме ленты является оптимальным приемом пробоподготовки мукоро-мицетов к MALDI-TOF-масс-спектрометрии.
2. Метод масс-спектрометрической съемки с использованием «узкого просмотрового окна» отчетливого пика/комплекса пиков и высокой сумма-ции позволяет получать характеристические MALDI-масс-спектры из сложных для исследования образцов, какими являются пробы белковых экстрактов или обработанной биомассы мукоромице-тов.
3. В композиции MALDI-масс-спектров муко-ромицетов имеются пики, специфичные для группы таксонов, рода, вида, штамма.
4. Масс-спектрометрический полиморфизм основных возбудителей мукормикоза возрастает в ряду R. pusillus —> Lichtheimia spp. —> R. arrhizus.
5. L. corymbifera, L. ornata и L. ramosa имеют масс-спектрометрические различия, однако их недостаточно для дифференцировки штаммов этих видов друг от друга во всех случаях.
6. Использованная стандартная «библиотека» масс-спектро-профилей не эффективна для видовой идентификации культур мукоромицетов, подготовленных предложенными способами, с целью устранения этого недостатка разработана оригинальная «библиотека» МСП.
Коллектив авторов благодарит заведующую Российской коллекцией патогенных грибов Чилину Галину Анастасъевну, ассистента кафедры медицинской микробиологии Богданову Татьяну Владимировну, старшего лаборанта Алексеева Андрея Юрьевича за предоставление штаммов мукоромицетов для исследования, а также сотрудников НИЛ молекулярно-генетической микробиологии за предоставление данных о результатах видовой идентификации штаммов.
Работа выполнена в рамках Государственного задания 056-00056-1900 «Изучение морфо-биологических особенностей патогенных мукоромицетов - возбудителей микозов у пациентов с им-мунодефицитами» (2019- 2021 гг.).
ЛИТЕРАТУРА
1. Dolatabadi S., Kolecka A., Versteeg М., et al. Differentiation of clinically relevant Mucorales Rhizopus microsporus and R. arrhizus by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). J. Med. Microbiol. 2015; 64 (7): 694-701. doi: 10.1099/jmm.0.000091
2. Schwarz P., Guedouar H., Laouiti F., et al. Identification of Mucorales by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. J. Fungi (Basel). 2019; 5 (3): 56. doi: 10.3390/jof5030056
3. Shao J., Wan Z, Li R., Yu J. Species identification and delineation of pathogenic Mucorales by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2018; 56 (4): e01886-17. doi: 10.1128/JCM.01886-17
4. Vatanshenassan M, Boekhout T., Meis J.F., et al. Candida auris identification and rapid antifungal susceptibility testing against echinocandins by MALDI-TOF MS. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2019; 9: 20. doi:10.3389/fcimb.2019.00020
5. Gitman M.R., McTaggart /.., Spinato J., et al. Antifungal susceptibility testing of Aspergillus spp. by using a composite correlation index (CCI)-based matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry method appears to not offer benefit over traditional broth microdilution testing. J. Clin. Microbiol. 2017; 55 (7): 2030-2034. doi: 10.1128/JCM.00254-17
6. Vasilyeva N.V., Riabinin I.A., Bogomolova T.S., Borzova J.V. Mass-spectrometric differences of Aspergillus spp. with different sensitivity to itraconazole and amphotericin B. Aspergillus & Aspergillosis Website. 2018: https://www.aspcrgillus.org.uk/confcrcncc_abstracts/mass-spcctromctric-diffcrcnccs-aspcrgillus-spp-diffc
7. Vasilyeva /V , Vybornova I., Kovyrshin S., et al. In vitro susceptibilities of mucormycosis etiologic agents to amphotericin В and posaconazole. Journal of Fungi. 2021; 7 (11): 311-312. doi: 10.3390/jof7110916
8. Vasilyeva N., Riabinin /., Rasulova S., Ignatyeva S., Taraskina A. Features of clusterization of mass-spectra of Aspergillus spp. cellular extracts. 28th ECCMID, 2018: http://www.eccmidlive.org/#resources/features-of-clusterization-of-mass-spectra-of-aspergillus-spp-cellular-extracts
9. Vasilyeva N., Riabinin I., Jolya Y., et al.. The similarities and differences of Aspergillus and Pénicillium strains detected by MALDI-TOF mass spectrometry of the hyphal extracts. ESCMID eLibrary. ECCMID 2019. P2204.: https://www.escmid.org/escmid_publications/escmid_elibrary/?q=Jolya&id=2173&L=0&x=17&y=19
10. Лунина С.С., Рябинин И.А. Спектрообразующие полипептиды Candida glabrata. «Трансляционная медицина: от теории к практике»: Материалы 6-й научно-практической конференции молодых ученых специалистов. Под ред. д.м.н. А.В. Силина. СПб.: Из-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2018: 27-28. [Lunina S.S., Ryabinin I.A. Spectrum-forming polypeptides of Candida glabrata. «Translational medicine: from theory to practice»: Proceedings of the 6th scientific-practical conference of young scientists. Ed. by A.V. Silin, M.D. SPb.: Publishing house of the Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, 2018: 27-28 (in Russ)].
Поступила в редакцию журнала 12.01.2022 Рецензент: Т. С. Богомолова
