CC BY
10УДК 582.281.21: 550.8.014:599.323.4 DOI: 10.24412/1999-6780-2021-4-34-38
ИЗУЧЕНИЕ ВИРУЛЕНТНОСТИ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ МУ-КОРОМИЦЕТОВ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ИНВА-ЗИВНОГО МУКОРМИКОЗА У МЫШЕЙ
1Босак И.А. (с.н.с.), 1Выборнова И.В. (н.с.), 1Чилина Г.А. (зав. лаб.), 1Павлова И.Э. (н.с.), Богомолова Т.С. (зав. лаб.)*, 1Тараскина А.Е. (зав. лаб.), 2Чжан Ф. (профессор), 1Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия; 2Харбинский Медицинский Университет, Харбин, Китай
В статье приведены результаты сравнительного исследования вирулентности клинических изолятов шести видов мукоромицетов из трех родов грибов. На модели интраназального заражения мышей на фоне нейтро-пении, индуцированной циклофосфаном, выявлены межродовые, межвидовые и штаммные различия по летальному действию на мышей. КЫготисог ршШш и ЫсЫЬетаа зрр. были более патогенны, чем Юпгориз зрр.
Ключевые слова: мукормикоз, экспериментальная модель, вирулентность, летальность
INVESTIGATION OF CLINICAL MU-CORALEAN ISOLATES VIRULENCE ON THE EXPERIMENTAL MURINE MODEL OF INVASIVE MUCORMYCOSIS
1Bosak I.A. (senior scientific researcher), Vybornova I.V. (scientific researcher), 1Chilina G.A. (head of the laboratory), 1 Pavlova I.E. (scientific researcher), 1Bogomolova T.S. (head of the laboratory), 1Taraskina A.E. (head of the laboratory), 2Zhang F. (professor), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia; 2Harbin Medical University, Harbin China
Using the experimental model with intranasal infection of neutropenic cyclophosphamide treated mice differences in virulence between genera, species and strains were revealed. Rhizomucor pusillus and Lichtheimia spp. were more virulent in comparison with Rhizopus spp.
Key words: mucormycosis, experimental model, virulence, lethality
Мукормикоз — тяжелая оппортунистическая инфекция, поражающая преимущественно пациентов с некомпенсированным сахарным диабетом и онкоге-матологическими заболеваниями [1]. В настоящее время наблюдается рост заболеваемости мукормико-зом в связи с пандемией COVID-19. В Индии установлено более 40 тысяч случаев мукормикоза у пациентов, заболевших новой коронавирусной инфекцией [2]. К наиболее частым возбудителям мукормикоза относятся микромицеты из трех родов порядка Mucorales: Rhizopus (R. arrhizus, R. microsporia), Lichtheimia (/.. corymbifera, L. ramosa, L. ornata) и Rhizomucor (Rhizomucor pusillus) [3]. При изучении вирулентности природных и клинических изолятов мукоромицетов в экспериментальных моделях на животных были выявлены межвидовые и межштам-мовые различия [4-6]. Механизмы патогенеза мукормикоза, биологические особенности возбудителей, факторы вирулентности, патогенный потенциал различных видов и штаммов возбудителей этого заболевания изучены недостаточно.
Цель нашего исследования: изучить вирулентность различных видов и штаммов мукоромицетов, выделенных от пациентов в России, на разработанной нами экспериментальной модели инвазивного мукормикоза легких у мышей [7J.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы грибов. Изучено 19 штаммов мукоромицетов (Lichtheimia ramosa - 4, L. corymbifera -5, L. ornata - 1, Rhizopus arrhizus - 3, R. microsporia -2, Rhizomucor pusillus - 4), выделенных от больных мукормикозом в Санкт-Петербурге в период с 2009 по 2019 гг. (табл.1). Видовая идентификация была подтверждена методом секвенирования по Сэнгеру локусов рибосомальной ДНК: LSU (большой субъединицы) и/или ITS (внутреннего транскрибируемого спейсера).
Таблица 1
Штаммы мукоромицетов, использованные в работе
№ п.п. № штамма Вид Источник Данные ДНК секвенирования
1 РКПГ F 1456 Lichtheimia ramosa промывные воды бронхов Идентичность 100%, LSU
2 РКПГ F 1969 Lichtheimia ramosa бронхоальвеолярный лаваж Идентичность 100%, ITS
3 РКПГ F 2007 Lichtheimia ramosa бронхоальвеолярный лаваж Идентичность 100%, ITS
4 РКПГ Lichtheimia мягкие ткани ротовой Идентичность
The article presents results of the comparative study on clinical mucoralean isolates virulence (6 species of 5 genera).
* Контактное лицо: Богомолова Татьяна Сергеевна, e-mail: tatiyana.bogomolova@szgmu.ru
F 2019 ramosa полости 100%, ITS
5 РКПГ F 1493 Lichtheimia corymbifera содержимое околоносовых пазух Идентичность 100%, LSU, ITS
6 РКПГ F 1568 Lichtheimia corymbifera отделяемое из раны на лице Идентичность 100%, LSU
7 РКПГ F 1601 Lichtheimia corymbifera биоптат из левого носового хода Идентичность 100%, LSU
8 РКПГ F 1837 Lichtheimia corymbifera биоптат лёгкого Идентичность 100%, LSU
9 РКПГ F 2020 Lichtheimia corymbifera придаточные пазухи носа Идентичность 100%, ITS
10 РКПГ F 1507 Lichtheimia ornata биоптат пазухи носа Идентичность 100%, LSU, ITS
11 РКПГ F 1379 Rhizopus arrhizus раневое отделяемое Идентичность 100%, LSU, ITS
12 РКПГ F 1537 Rhizopus. arrhizus бронхоальвеолярный лаваж Идентичность 100%, LSU, ITS? 28s рНК
13 РКПГ F 2027 Rhizopus arrhizus бронхоальвеолярный лаваж Идентичность 100%, ITS
14 РКПГ F 1497 Rhizopus microsporus бронхоальвеолярный лаваж Идентичность 100%, LSU
15 РКПГ F 1538 Rhizopus microsporus биоптат кишки Идентичность 100%, LSU
16 РКПГ F 1545 Rhizomucor pusillus биоптат лёгкого Идентичность 100%, ITS
17 РКПГ F 1648 Rhizomucor pusillus бронхоальвеолярный лаваж Идентичность 100%, LSU
18 РКПГ F 1845 Rhizomucor pusillus бронхоальвеолярный лаваж Идентичность 100%, ITS
19 РКПГ F 1892 Rhizomucor pusillus бронхоальвеолярный лаваж Идентичность 100%, ITS
Оценку вирулентности штаммов выполняли путем сравнения выживаемости животных методом Каплана-Мейера. Данные статистически обрабатывали с помощью программы STAT1ST1CA for Windows.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Вирулентность штаммов Lichtheimia spp. По
результатам анализа выживаемости лабораторных животных после инфицирования (Рис. 1) штаммы Lichtheimia spp. были распределены на две группы: сильно вирулентные и слабо вирулентные. К сильно вирулентным были отнесены штаммы Lichtheimia spp., вызвавшие гибель 100% зараженных животных через 5-18 дней после заражения; к слабо вирулентным отнесены штаммы, вызвавшие за период наблюдения (25 сут.) гибель менее 100% (40%- 90%) мышей.
Лабораторные животные. Использовали самцов беспородных белых мышей с массой тела 18-20 г. Для введения животных в состояние нейтропении внутрибрюшинно вводили эндоксан (циклофосфан) в дозе 150 мг/кг четырёхкратно (-3, 0, 4 и 8 день).
Методика заражения. Из трехсуточной культуры гриба на агаре Сабуро готовили взвесь спор в стерильном 0,85% растворе NaCl концентрацией 1 -107 КОЕ/мл. Заражение мышей выполняли путём интраназального введения наркотизированным животным 50 ц1 взвеси спор грибов.
Наблюдение за инфицированными мышами проводили ежедневно и учитывали количество погибших в группах. В день гибели животного стерильно извлекали ткани для культурального исследования. Выживших к дню окончания эксперимента мышей умерщвляли путем спинальной дислокации и отбирали материал для культурального исследования. Оценку наличия гриба в тканях зараженных животных осуществляли путем посева тканей лёгких и головного мозга погибших мышей на среду Сабуро агар методом отпечатков. Чашки инкубировали в термостате в течение 3-х суток, подсчитывали количество выросших колоний мукоромицетов. Идентификацию выделенных культур проводили по морфологическим признакам.
Рис. 1. Выживаемость мышей после заражения различными штаммами Lichtheimia spp.
Различия в летальности для животных между группой сильно вирулентных штаммов Lichtheimia spp. и группой слабо вирулентных штаммов были статистически достоверны (р=0,00009) (Рис. 2). В группу сильно вирулентных штаммов вошли все 4 штамма L. ramosa и 2 штамма L. corymbifera (РКПГ F 1837 и РКПГ F 2020), в группу слабо вирулентных — остальные 3 штамма L. corymbifera и штамм L. ornata.
Медиана выживаемости для животных, зараженных L. ornata РКПГ F 1507, составила 14 суток, на день окончания наблюдения выжила одна мышь (10%). В группе заражения L. corymbifera РКПГ F 1493 медиана выживаемости составила 15 суток с двумя выжившими мышами (20%) на 25-й день после инфицирования. В день окончания эксперимента в группе животных, зараженных L. corymbifera РКПГ F 1837, выжило четыре мыши (40%) с медианой выживаемости 12 суток. В группе заражения L. corymbifera РКПГ F 1568 выжило шесть животных (60%) с медианой выживаемости >25 суток.
о
О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13
Дни после заражения -»-РКПГ F 1493 L. corymbifera -»-РКПГ F 1601 L. corymbifera н— РКПГ F 1568 L. corymbifera ^РКПГ F2007 L. ramosa РКПГ F 1969 L. ramosa -•-РКПГ F 1837 L. corymbifera
-■-РКПГ F 1456 L. ramosa
-РКП Г F 1507 L. ornata
-•-РКПГ F 1837 Lichthemia sp.
РКПГ F 2019 L. ramosa -♦-РКПГ F 2020 L. corymbifera
Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier) о Complete + Censored
Time --- hight
Рис. 2. Сравнение выживаемости мышей, зараженных сильно и слабо вирулентными штаммами Lichtheimia spp.
При сравнении выживаемости животных, зараженных различными видами Lichtheimia spp., установлены достоверные различия: наибольшую вирулентность проявили штаммы L. ramosa в сравнении с L. corymbifera (р=0,03) и с L. ornata (р=0,00001). Штамм L. ornata был менее вирулентен, чем штаммы L. corymbifera (р=0,03) (Рис. 3).
Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier) □ Complete + Censored
0,0 1
-u.i -----'------- cor
0 5 10 15 20 25 30^.ram
Time orn
Рис. 3. Сравнение выживаемости лабораторных животных, зараженных различными видами Lichtheimia spp.
В результате культуральных исследований органов зараженных мышей рост Lichtheimia spp. был выявлен в 69,7% проб ткани легких и в 39,5% проб ткани мозга.
Вирулентность штаммов Rhizopus spp. Динамика гибели животных после заражения различными штаммами Rhizopus spp. показана на рисунке 4.
Рис. 4. Выживаемость мышей после заражения различными штаммами ЯЬ/гориз эрр.
В группе животных, инфицированных Я. т1сго8рогш РКПГ V1538, гибель всех мышей наблюдали на 23-й день после заражения. Через 28 дней после инфицирования погибли все животные в группах заражения К. аггЫгш РКПГ Г 1379 и К. т^гохрогш РКПГ Г1497. В группах мышей, инфицированных штаммами К. аггЫгш РКПГ Г1537 и К. аггЫгш РКПГ Г 2027, гибель 100% животных отмечали на 31-й и 35-й дни соответственно. Достоверных различий в вирулентности изученных штаммов не выявлено.
При сравнении кумулятивной выживаемости мышей, зараженных двумя различными видами рода КЫгоргм, достоверных различий не обнаружено (р=0,4) (Рис. 5)._
Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier) □ Complete Censored
Время
Рис. 5. Сравнение выживаемости лабораторных животных, зараженных различными видами эрр.
При культуральных исследованиях органов мышей, зараженных штаммами ЯМгорш эрр., рост возбудителей был получен в 66,6% проб ткани легких и в 44,4% проб ткани мозга.
Вирулентность штаммов ЛЫготисог ринШиъ.
Динамика гибели мышей после заражения четырьмя штаммами К. ршШш показана на рисунке 6.
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Дни после заражения
R. pusillus РКПГ F 1892 R. pusillus РКПГ F 1648
-R. pusillus РКПГ F 1845 -R. pusillus РКПГ F 1545
Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier) □ Complete + Censored
Рис. 6. Выживаемость мышей после заражения различными штаммами Rhizomucor pusillus.
При анализе выживаемости лабораторных животных после заражения штаммы R. pusillus были распределены на две группы: сильно и слабо вирулентные. К сильно вирулентным были отнесены штаммы, вызвавшие гибель 100% животных в течение 16 дней после инфицирования (R. pusillus РКПГ F 1845 и R. pusillus РКПГ F 1545). К слабо вирулентным отнесены штаммы R. pusillus РКПГ F 1892 и R. pusillus РКПГ F 1648, вызвавшие гибель не всех мышей (90%) через 21 день после заражения. Различия между группами сильно и слабо вирулентных штаммов R. pusillus по летальному действию на мышей статистически значимы (р=0,01) (Рис. 7).
Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier) Complete Censored
1.0 0.9 0,8
! 07 ™ 0.6
0.5
0.4
0.3
Ё
8 0.2 0.1 0.0 -0.1
"П-
о—, 0 0
10 12 14
Time
22 24.J,. high -в- low
Рис. 7. Сравнение выживаемости мышей, зараженных сильно и слабо вирулентными штаммами R. pusillus.
При культуральных исследованиях органов мышей рост R. pusillus был выявлен в 29,4% проб ткани легких и 5,8% проб ткани мозга.
Сравнение выживаемости мышей после заражения в зависимости от рода мукоромицета.
При анализе выживаемости животных после инфицирования мукоромицетами трех изученных родов были выявлены межродовые различия по вирулентности (Рис. 8).
1.0
0.9
0.8
О)
> 0,7
t
(Л 0.6
о
s 0.5
ё"
о. 0,4
>
то 0.3
F
О 0.2
0.0
-0,1
20 25 Time
-- Licht 40 45 — Rhiz — Rhimu
Рис. 8. Сравнение выживаемости животных после заражения тремя родами мукоромицетов (Lichtheimia, Rhizopus, Rhizomucor).
Штаммы R. pusillus и Lichtheimia spp. не различались по летальному действию на мышей в состоянии иммуносупрессии (р=0,08) и были более вирулентными по сравнению с Rhizopus spp. (р=0,0001 и р=0,01 соответственно).
В результате проведенного экспериментального исследования вирулентности клинических изолятов возбудителей мукормикоза, выделенных от пациентов в Санкт-Петербурге, на модели интраназального заражения мышей на фоне нейтропении, обусловленной введением циклофосфана, выявлены различия по летальному действию на животных между видами и штаммами рода Lichtheimia, между штаммами R. pusillus, а также между штаммами Rhizopus spp. и возбудителями, относящимися к двум другим родам мукоромицетов.
Полученные нами данные о различиях в вирулентности штаммов Lichtheimia spp. согласуются с результатами исследований других авторов. Kitz D.J. et al. [Kitz D.J., et al. Comparative virulence of Absidia corymbifera strains in mice. Infection and Immunity. 1981; 33 (2): 395-400] отмечали различия в 10-16 раз между средними летальными дозами шести штаммов L. corymbifera при внутривенном заражении мышей.
Schwartze V.U. et al. на модели с куриными эмбрионами также наблюдали штаммовые различия в вирулентном потенциале для видов L. corymbifera и L. ramosa [4]. Schulze В. et al. на модели инвазивного мукормикоза легких при интраназальном заражении мышей на фоне иммуносупрессии, вызванной ацетатом кортизона, обнаружили различия в вирулентном потенциале индивидуальных штаммов Lichtheimia spp., но не выявили достоверных различий по вирулентности между видами L. corymbifera и L. ramosa [6]. В нашем исследовании было установлено, что L. ramosa обладает большей вирулентностью, чем L. corymbifera. Возможно, что различия в полученных результатах связаны с тем, что мы применяли для
иммуносупрессии животных циклофосфан, а не ацетат кортизона.
Нами обнаружены различия в летальном действии на мышей между мукоромицетами, относящимися к разным родам порядка Ммсога/ет. На использованной нами модели наибольшую вирулентность проявили штаммы К. ршШш и ЫсЫЬе1т1а эрр. по сравнению с КИлгорш эрр. Аналогичные результаты получили Ьио О. а1. на модели интратрахеального заражения мышей, обработанных циклофосфаном и ацетата кортизона [5]. Отметим, что те же авторы получили другие результаты на модели интратрахеального заражения мышей с диабетическим кето-ацидозом: наиболее вирулентными на этой модели оказались ЯЫгорш эрр.
В доступной нам литературе мы не обнаружили исследований сравнительной вирулентности изоля-тов Я. ршШш. Вероятно, это связано с относительно редкой встречаемостью этого возбудителя мукормикоза [3]. Однако при анализе данных регистра больных мукормикозом в России среди возбудителей доля К. ршШш составила 20% для взрослых пациентов и 25% для детей [8, 9]. В нашем исследовании мы выявили различия в вирулентном потенциале между штаммами К. ршШш, что позволило разделить их на
группы сильно и слабо вирулентных. Необходимы дальнейшие исследования биологических особенностей мукормицетов, связанных с патогенностью, в том числе на молекулярно-биологическом уровне.
ВЫВОДЫ
1. На модели мукормикоза легких у мышей при интраназальном заражении на фоне нейтропении, индуцированной циклофосфаном, выявлена гетерогенность возбудителей родов Lichtheimia, Rhizopus и Rhizomucor по патогенности. Штаммы родов Lichtheimia и Rhizomucor были более патогенны, чем представители рода Rhizopus.
2. Обнаружены различия по патогенности между видами рода Lichtheimia. Штаммы вида L. ramosa более патогенны, чем L. corymbifera.
3. Установлены штаммовые различия по вирулентности для L. corymbifera и R. pusillus.
Работа выполнена в рамках Государственного задания 056-00056-1900 «Изучение морфо-биологических особенностей патогенных мукоро-мицетов - возбудителей микозов у паг/иентов с им-мунодефицитами».
ЛИТЕРАТУРА
1. Skiada A., Pavleas I., Drogari-Apiranthitou М. Epidemiology and diagnosis of mucormycosis: an update. J. Fungi, 2020; 6: 265-284. doi.org/10.3390/jof6040265
2. Bhatia M. The rise of mucormycosis in COVID-19 patients in India. Expert review of anti-infective therapy. 2021. Ahead-of-print, 1-2. doi.org/10.1080/14787210.2021.1960822
3. Jeong W., Kejghley ('., Wolfe R., et al. The epidemiology and clinical manifestations of mucormycosis: a systematic review and meta-analysis of case reports. Clinical Microbiology and Infection. 2019; 25: 26-34. doi.org/10.1016/j.cmi.2018.07.011
4. Schwartze V.U., Hoffmann K., Nyilasi I., et al. Lichtheimia species exhibit differences in virulence potential. PLoS ONE, 2012 7(7):e40908. doi.org/10.1371/journal.pone.0040908
5. Luo G., Gebremariam Т., Lee H., et al. Efficacy of liposomal amphotericin В and posaconazole in intratracheal models of murine mucormycosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2013; 57 (7): 3340-3347. doi.org/10.1128/AAC.00313-13
6. Schulze В., Rambach G., Schwartze V.U., et al. Ketoacidosis alone does not predispose to mucormycosis by Lichtheimia in a murine pulmonary infection model. Virulence. 2017; 8 (8): 1657-1667. doi.org/10.1080/21505594.2017.1360460
7. Васильева H.B., Босак И.А., Богомолова Т.С. и др. Экспериментальная модель мукормикоза легких, обусловленного Lichthemia ornata. Проблемы медицинской микологии. 2019; 21 (1): 3-6. [Vasilyeva N.V., Bosak I.A., Во-gomolova T.S., et al. Experimental model of pulmonary mucormycosis caused by Lichtheimia ornate. Problems in medical mycology. 2019; 21 (1): 3-6 (In Russ)].
8. Хостелиди C.H., Шадривова О.В., Борзова Ю.В. и др. Клинико-лабораторные особенности мукормикоза у взрослых. Проблемы медицинской микологии. 2020; 22 (2): 22-28. [Khostelidi S.N., Shadrivova O.V., Borzova U.V., et al. Clinical and laboratory features of mucormycosis in adults. Problems in medical mycology. 2020; 22 (2): 22-28 (In Russ)]. doi: 10.24412/1999-6780-2020-2-22-28
9. Хостелиди C.H., Борзова Ю.В., Волкова А.Г. и др. Мукормикоз у детей: результаты проспективного исследования в Санкт-Петербурге. Проблемы медицинской микологии. 2019; 21 (1): 7-10. [Khostelidi S.N., Borzova U.V., Volkova A.G., et al. Mucormycosis in children: results of prospective study in Saint-Petersburg, Russia. Problems in medical mycology. 2019; 21 (1): 7-10 (In Russ)].
Поступила в редакцию журнала 21.12.2021 Рецензент: С.М. Игнатьева
