CC BY
68□01:10.24412/1999-6780-2019-4-36-42
УДК 582.281.21:582.282.123.4:577.214.3
АПРОБАЦИЯ
МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ «HRM-ZYGO-АЭР» НА КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ БОЛЬНЫХ МУКОРМИКОЗАМИ
1 Игнатьева С.М. (в.н.с.)*, Спиридонова В.А. (н.с.), 1Богомолова Т.С. (зав. лаб.), 1Авдеенко Ю.Л. (с.н.с.), 1Борзова Ю.В. (зав. клиникой), 1Хостелиди С.Н. (доцент кафедры), 1Шадривова О.В. (доцент кафедры), 2Попова М.О. (врач-гематолог), 3Чудиновских Ю.А. (врач-гематолог), 3Зюзгин И.С. (зав. отд.), 4Успенская О.С. (зав. отд.), 1Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой) Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина и кафедра клинической микологии, аллергологии и иммунологии; Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова; 2Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой; Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Петрова; 4Ленинградская областная больница, Санкт-Петербург, Россия
Цель работы заключалась в апробации разработанной мультиплексной ПЦР-тест-системы «HRM-Zygo-Asp» в режиме реального времени (РВ) с анализом кривых плавления ПЦР-продуктов высокого разрешения (НЕМ) для выявления и идентификации аспергиллов и мукоромицетов. Исследовали различный биологический материал (биопсийный и аутопсийный), в т.ч. в парафиновых блоках и БАЛ от больных мукормикозами. Представлены сравнительные результаты исследования 19 образцов биоматериала от 13 больных мукормико-зом микологическими, гистологическими, серологическими и молекулярными методами. Показаны примеры эффективного использования тест-системы для отдельных клинических случаев при анализе различных типов биологического материала, а также возможность выявлять смешанную мукормикоз-аспергиллезную инфекцию.
Ключевые слова: мукормикоз, инвазивный аспергиллез, онкологические пациенты, мукоромицеты, аспергиллы, полимеразно-цепная реакция (ПЦР), мультиплексная тест-система
APPROBATION OF MULTIPLEX TEST SYSTEM «HRMZYGO-ASP» ON THE CLINICAL MATERIAL OF PATIENTS WITH MUCORMYCOSIS
1Ignatieva S.M. (leading scientific collaborator), 1Spiridonova V.A. (scientific collaborator), 1Bogomolova T.S. (head of the laboratory), 1Avdeenko Y.L. (leading scientific collaborator), 1Borzova Yu.V. (head of the clinic), 1 Khostelidi S.N. (associate professor), 1Shadrivova O.V. (associate professor), 2Popova M.O. (physician-hematologist), 3Chudinovskikh Y.A. (physician-hematologist), 3Zyuzgin I.S. (head of the clinical department), 4Uspenskaya O.S. (head of the clinical department), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department)
Контактное лицо: Игнатьева Светлана Михайловна, e-mail: svetlana.ignatieva@szgmu.ru
1North-Western State Medical University named after I.I. Metchnikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology and Department of Clinical Mycology, Allergy and Immunology; 2R. Gorbachova Institute of Children's Hematology and Transplantology; 3N.N. Petrov Research Institute of Oncology; 4Leningrad Regional Clinical Hospital, St. Petersburg, Russia
The purpose of the work was to test the previously developed multiplex PCR test-system "HRM-Zygo-Asp" in real time (RT) with analysis of the melting curves of high-resolution PCR products (HRM) to detect and identify aspergillus and mucoromycetes. We studied various biological material: biopsy samples, autopsy material, paraffin blocks with tissues affected by micromycetes, BAL from patients with mucormycosis. Comparative results of a study of 19 clinical samples from 13 patients with mucormycosis by molecular, mycological, histological and serological methods are presented. Examples of the effective use of the test system for individual clinical cases in the analysis of various types of biological material, as well as the ability to detect mixed mucormycosis-aspergillosis infection are shown.
Key words: mucormycosis, invasive aspergillosis, cancer patients, mucorales, aspergillus, polymerase chain reaction (PCR), multiplex test system
ВВЕДЕНИЕ
Мукормикоз - тяжелая инфекция, частота которой в 21 веке возросла у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и у реципиентов трансплантатов гемопоэтических стволовых клеток [1, 2]. Мукормикоз вызывают представители порядка Mycorales, из которых наиболее распространенными являются виды Rhizopus (48%), Mucor (14%), Lichtheimia (13%), Cunninghamella (7%) и Rhizomucor (6%) [2-4]. У онкогематологических пациентов г. Санкт-Петербурга основные возбудители мукормико-за - представители родов Rhizopus (47%), Rhizomucor (28%), Lichtheimia (17%) и Mucor (8%) [5]. Для успешного лечения пациентов с этим заболеванием решающее значение имеют ранняя диагностика и быстрое начало противогрибковой терапии. Лабораторная диагностика мукормикоза сложна, диагноз подтверждается, как правило, при прямой микроскопии биоматериалов и/ или получением культуры возбудителя (только в 50% случаев) [6]. При гистологических исследованиях патологического материала иногда сложно различить возбудителей аспергиллеза и мукормикоза [7]. Серологическая диагностика этого заболевания отсутствует. Одним из наиболее перспективных направлений в диагностике мукормикоза является использование быстрых молекулярных методов идентификации гриба непосредственно в инфицированных тканях [8, 9] и биологических жидкостях, таких как бронхо-альве-олярный лаваж (БАЛ), плазма или сыворотка [10, 11] и моча [12]. Среди молекулярных методов детекции представителей Mucorales применяют, главным образом, различные модификаций ПЦР [13-16].
Например, вариант ПЦР в режиме реального времени (РВ-ПЦР) с праймерами к фрагменту гена 18Sр ДНК Mucorales с использованием флуоресцирующих интеркалирующих красителей (Eva Green, Sybr Green) и последующим анализом кривых плавления ПЦР-продуктов высокого разрешения (HRM - от англ. high - resolution melting) позволяет различать род и вид в зависимости от температуры плавления ампликонов. В 2010 г. Hrncirova K. с соавторами [17] впервые применила этот метод для выявления и идентификации основных клинически значимых мукормицетов в образцах тканей и изолятах, показав высокую аналитическую и диагностическую чувствительность (92%) и
Í--
специфичность (100%) метода.
На основе данной технологии в НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина впервые в России была разработана мультиплексная ПЦР-тест-система «HRM-Zygo-Asp» в режиме РВ. Тест-система позволяет обнаружить в одном клиническом образце одновременно ДНК грибов рода Aspergillus и/или порядка Mucoralis, а последующий анализ кривых плавления ПЦР-продуктов высокого разрешения (HRM) - идентифицировать аспергиллы до рода и мукоромицеты -до вида или комплекса видов.
Цель данного исследования - апробация мультиплексной ПЦР-тест-системы «HRM-Zygo-Asp» в режиме РВ при исследовании различных типов биологического материала от пациентов с мукормикозами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали 19 клинических образцов: БАЛ (6), биоптат печени (2), биоптат легкого (1), ау-топсийный материал (1), парафиновые блоки (10) от 10 гематологических больных с мукормикозом и 3 - с микст-микозом смешанной этиологии, госпитализированных в стационары г. Санкт-Петербурга с 2013 по 2019 гг. В качестве контрольных использовали 17 образцов тканей и 20 образцов БАЛ от пациентов без микозов. Диагноз мукормикоза и аспергиллеза устанавливали в соответствии с критериями Европейской организации по лечению и исследованию рака /группы, изучающей микозы (EORTC/MSG, 2008) [18], и Европейского общества клинических микробиологов и инфекционных заболеваний, Европейской конфедерации медицинских микологов и Европейского респираторного общества (ESCMID-ECMM-ERS, 2017) [19]. На основании обнаружения микромицетов при гистологическом исследовании срезов, окрашенных по методу Гомори-Грокотт и PAS, и/или при микологическом исследовании патологического материала, включающего в себя прямую микроскопию образцов с добавлением калькофлюора белого и посев на среду Сабуро, подтверждали диагноз микоза. Кроме того, определяли галактоманнановый антиген Aspergillus spp. в БАЛ с помощью тест-системы «Platelia Aspergillus Ag» (BioRad Laboratories). Выделение ДНК из клинических образцов проводили методом хлороформ-изоамиловой экстракции. При работе с парафиновыми блоками совершали предобработку ксилолом, направленную на очистку от парафина. В одном образце при отсутствии культуры возбудителя проводили секвенирование ДНК, полученной из тканей, заключенных в парафин, согласно рекомендациям Института Клинических и Лабораторных стандартов США (CLSI) [20]. Амплификацию осуществляли на приборе Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science, Австралия) с помощью разработанной нами ПЦР-тест-системы «HRM-Zygo-Asp», включающей в себя две пары праймеров (аспергилл- и мукоромицет-специфичных) и набора реагентов для проведения ПЦР в реальном времени с интеркалиру-ющим красителем Eva Green (Синтол, Москва) в модификации ранее предложенного протокола [21]. При использовании Eva Green уровень его флуоресценции резко возрастает при связывании с двухцепочечной ДНК, а при достижении температуры плавления ам-пликонов - снижается. Наличие пика с соответствующей температурой на дифференциальной кривой
плавления означает присутствие специфического продукта ПЦР. Для микромицетов наличие пика при 76,8-77,7 °С свидетельствовало о наличии ДНК аспер-гиллов, а при 83-86 °С - о наличии ДНК мукормицетов (Рис.1).
Rhizopus oryzBB I Rhizomucor ptisllltis
75 fiO 85
гряд.
Рис.1. Кривые плавления ПЦР-продуктов ДНК микромицетов: Тпл Aspergillus spp. - 77 - 78°С, Тпл Mucorales - 83-86 °С.
Разные виды Aspergillus spp. имели пики плавления в узком диапазоне температур (76,8-77,8 °C), а разные виды мукоромицетов -индивидуальные температуры плавления, по которым их можно было дифференцировать: представителей Aspergillus spp. - до рода и мукоромицетов Rhizomucor pusillus, Rhizopus microsporus, Mucor circinelloides, Cunninghamella echinulata, Syncephalastrum racemosum, Lichtheimia corymbifera, Rhizopus arrhizus / Rhizopus stolonifer, Mucor racemosus/ Mucor plumbeus - до вида или комплекса видов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На основании клинических и лабораторных данных у 8 онкогематологических больных были зарегистрированы локализованные формы мукормикоза: легких (5), кишечного тракта (2) и печени (1),а также поражение двух органов - легких и почки (1), микст-микоз легкого (2) и генерализованные формы, обусловленные грибами рода Aspergillus и порядка Mucorales (2). Наиболее часто мукормикоз развивался на фоне острого лимфо-бластного лейкоза (ОЛЛ) - 39%, неходжинской лимфо-мы (НХЛ) и острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) - по 23%, реже - при лимфоме Ходжкина (ЛХ) -15%.
При исследовании 9 нативных образцов больных (3 биоптата и 6 БАЛ) методом прямой микроскопии в 8 (89%) случаев выявлен широкий несептированный мицелий мукормицета (табл.1).
Положительный высев мукоромицетов из клинического материала больных получен в 6 (67%) образцах. Основными возбудителями мукормикоза были: Rhizopus spp. (66%), L. corymbifera (17%) и Rhizomucor spp. (17%). У 1 пациента (3Б) диагностировали микст-микоз, т.к. при микроскопическом исследовании, кроме мицелия мукорового гриба, обнаруживали элементы септированного мицелия, ветвящегося под острым углом, характерного для грибов рода Aspergillus, а при культуральном - выделили Rhizopus spp. и Aspergillus fumigatus. С помощью РВ-ПЦР мукоромицет идентифицировали как R. arrhizus. Галактоманнановый тест в БАЛ был положительным. Таким образом, молекуляр-но-генетическое исследование нативных 9 образцов с помощью мультиплексной ПЦР-тест-системы «HRM-Zygo-Asp» позволило идентифицировать мукоромицеты до видов: R. arrhizus (44%), L. corymbifera (33%), R. pusillus (11%) и R. microsporus (11%). Результаты ПЦР-исследований биоптатов и БАЛ от больных с мукорми-
козами совпадали с данными прямой микроскопии в 89% случаев и в 67% - с результатами посевов, а при анализе «положительные микроскопия и/или посев»
- полностью коррелировали с общими показателями микологических исследований. У пациента 8-Ш, кроме выявленного микроскопически и полученного из БАЛ изолята R. arrhizus методом ПЦР, была обнаружена ДНК двух возбудителей - R. arrhizus и Aspergillus spp., что способствовало (вместе с положительным галак-томаннановым тестом Aspergillus в БАЛ) уточнению лабораторного диагноза микст-микоза.
В 10 парафиновых блоках от больных мукормико-зом был представлен следующий операционный материал: ткань легкого (3), почки (1), печени (1), кишечника (2) и сальника (1), фрагмент ткани (1) от больного с диссеминированным процессом (табл. 2).
При гистологическом исследовании окрашенных срезов во всех случаях были обнаружены морфологические элементы грибов (широкий несептированный мицелий, ветвящийся под прямым углом), в нескольких заключениях указаны признаки их сходства с ми-кромицетами рода Aspergillus или/и порядка Mucorales. Молекулярно-генетическое исследование всех тканей, заключенных в парафин, позволило выявить в 100% случаев мукоромицеты и идентифицировать их до вида: L. corymbifera - в 5 образцах (56%), R. pusillus
- в 3 (33%) и R. microsporus - в 1 (11%). Чувствитель-
Исследование биоптатов тканей
ность мультиплексной тест-системы «Zygo-Asp-HRM» при исследовании операционного материала была выше, чем гистологических методов. Так, при гистологическом исследовании срезов ткани легкого от пациента 3-Б был обнаружен септированный мицелий, сходный с Aspergillus spp., в то время как с помощью тест-системы «Zygo-Asp-HRM» была выявлена ДНК Aspergillus sp. и R. arrhizus. Учитывая, что у данного больного был положительным галактоманнановый тест в БАЛ и выделены культуры грибов A. fumigatus и Rhizopus spp., диагностирован микст-микоз, обусловленный A. fumigatus и R. arrhizus. В 17 контрольных образцах операционного материала и 20 БАЛ от больных с неподтвержденным лабораторно диагнозом микоза ДНК микромицетов не обнаруживали.
Таким образом, при исследовании клинического материала от 13 больных мукормикозом положительные результаты молекулярного исследования полностью совпадали с микологическими (микроскопия + посев) и/или с гистологическими находками грибов в патологическом материале больных. У 4 пациентов с мукормикозом (1-Т, 2-П, 3-Б, 5-К) было проанализировано наибольшее количество биосубстратов - био-птаты тканей /БАЛ/ парафиновые блоки. Микологические, гистологические и серологические методы дополняли друг друга в обнаружении возбудителя в клиническом материале, а молекулярно-биологические
Таблица 1
и БАЛ пациентов с мукормикозами
Пациенты Гематологический диагноз Микологический диагноз Клинический материал Галактоманнан Aspergillus sp. Микологическое исследование Молекулярно-биологи-ческое исследование
Прямая микроскопия Посев
1 -Т НХЛ Диссеминированный микст-микоз (аспергиллез + мукормикоз) Ткань печени - Широкий несептированный мицелий Отрицательный Rhizopus microsporus
2-П ОМЛ Мукормикоз легких и почки БАЛ Отрицательный Отриц. Rhizomucor SPP. Rhizomucor pusillus
3-Б НХЛ Микст-микоз (аспергиллез + мукормикоз) легкого БАЛ Положительный Широкие несептированные гифы + септированный мицелий, ветвящийся под углом 45°С Aspergillus fumigatus + Rhizopus spp. Aspergillus sp. + Rhizopus arrhizus
4-Ш ОМЛ Мукормикоз печени Ткань печени - Несептированный мицелий Отрицательный Llchtheimla corymbifera
5-К НХЛ Мукормикоз легких БАЛ Отрицательный Несептированный мицелий Отрицательный Llchtheimla corymbifera
Ткань легкого - Llchtheimla corvmbifera Llchtheimla corymbifera
6-М ОМЛ Мукормикоз легких БАЛ Отрицательный Широкий несептированный мицелий Rhizopus spp. Rhizopus arrhizus
7-П ОЛЛ Мукормикоз легких БАЛ Отрицательный Широкий несептированный мицелий Rhizopus spp. Rhizopus arrhizus
8-Ш ЛХ Микст-микоз (аспергиллез + мукормикоз) легкого БАЛ Положительный Широкий несептированный мицелий Rhizopus spp. Rhizopus arrhizus + Aspergillus sp.
Таблица 2.
Исследование парафиновых блоковстканями, инфицированных мукормицетами
Пациенты Гематологический диагноз Микологический диагноз Клинический материал Гистологическое исследование Молекулярно-биологическое исследование
1 -T НХЛ Диссеминированный микст-микоз (аспергиллез + мукормикоз) Ткань печени Широкий несептированный мицелий Rhizopus microsporus + Aspergillus spp.
2-П ОМЛ Мукормикоз легких и почки Ткань почки Мицелий мукоромицета Rhlzomucorpusillus
3-Б НХЛ Микст-микоз (аспергиллез + мукормикоз) легкого Ткань легкого Септированный мицелий, ветвящийся под острым углом Aspergillus sp. + Rhizopus arrhizus
4-Г ОЛЛ Мукормикоз кишечного тракта Ткань кишечника Ткань сальника Мицелий мукоромицета Мицелий мукоромицета Rhizomucor pusillus Rhlzomucorpusillus
5-K НХЛ Мукормикоз легких Ткань легкого Мицелий мукоромицета Llchtheimla corymbifera
6-Г ОЛЛ Мукормикоз легких Ткань легкого Мицелий мукоромицета Llchtheimla corymbifera
7-B ЛХ Мукормикоз толстой кишки Ткань толстой кишки Морфологические признаки грибковой инвазии прямой кишки Llchtheimla corymbifera
8-P ОЛЛ Диссеминированный мукормикоз Фрагменты некротизи-рованной и грануляционной ткани Структуры толстых септирующихся бранчующихся грибковых микроорганизмов Llchtheimla corymbifera
9-0 ОЛЛ Мукормикоз легких Ткань легкого Мицелий мукоромицета Llchtheimla corymbifera
исследования позволяли уточнить вид мукоромицета и выявить смешанную инфекцию, вызванную грибами рода Aspergillus и порядка Mycorales.
Далее представлены отдельные примеры использования мультиплексной тест-системы «Zygo-Asp-HRM» для исследования БАЛ, биопсийных образцов и тканей, заключенных в парафин, у некоторых больных с мукормикозом.
Пример 1. Применение тест-системы «Zygo-Asp-HRM» при анализе образцов из парафиновых блоков соперационным материалом пациента Г. с гематологическим заболеванием и мукормикозом желудочно-кишечного тракта, органов брюшной полости.
Пациент Г., 13 лет, с ОЛЛ находился в отделении реанимации многопрофильного стационара г. Москвы с 18.10.16 г. по поводу двусторонней полисегментарной пневмонии. Через 3 дня у больного диагностировали полную окклюзию наружной подвздошной вены, тромбоз общей подвздошной артерии, некроз терминального отдела подвздошной вены. Была проведена резекция терминального отдела подвздошной и восходящего отдела толстой кишки.
При гистологическом исследовании парафиновых блоков операционного материала тканей тонкой, толстой кишки и сальника обнаружены обширные разрастания редко септированных широких гиф мицелия, ветвящегося под прямым углом, по микроморфологии соответствующего мукоромицету.
Результаты молекулярного исследования клинического материала пациента Г. получены на основании анализа кривых плавления ПЦР-продуктов, выявленных при амплификации тотальной ДНК с праймерами, специфичными для Aspergillus spp. и грибами порядка Mucorales (Рис. 2).
Rtiizomucor pusillus Rhizooas
\J\ hmicrosporus
»7 V/ toihUnte
»I \ /J \ cotymbitera
r* \ /V
j \ Кишечник J I
ДщН .
75 f« Tt 79 79 № в1 82 93 Й4 80 в' Bfl
Тютврагур* пллвпвнипг град.
Рис. 2. Кривые плавления ПЦР-продуктов ДНК, выделенной из парафиновых блоков с тканями разных
органов (кишечник и сальник) больного Г., Aspergillus Брр. - ДНК культуры (положительный контроль), ОКО -отрицательный контрольный образец.
Как видно из рисунка, мы получили пики плавления ДНК-образцов пациента Г. в диапазоне 84-85 °С, который соответствует температуре плавления ДНК R. pusillus,при этом отсутствовали пики плавления ДНК в зоне 77,5-78,3 °С, характерной для Aspergillus spp. Интенсивность флуоресцентного сигнала (высота пика) у образцов с одинаковой концентрацией ДНК различалась: большая интенсивность зарегистрирована в тканях кишечника, чем в сальнике. Таким образом, только с помощью молекулярного анализа тканей кишечника и сальника с применением мультиплексной ПЦР-РВ с функцией высокого разрешения (HRM) был обнаружен и идентифицирован возбудитель мукормикоза желудочно-кишечного тракта - R. pusillus.
Пример 2. Применение тест-системы «Zygo-Asp-HRM» при исследовании БАЛ и биопсийного образца легкого пациента К. с гематологическим заболеванием и мукормикозом.
Пациент К., 57 лет, с НХЛ от февраля 2015 г. С 07.09.17 г. больному проведен курс высокодозной химиотерапии с трансплантацией аутологичных стволовых кроветворных клеток и реинфузией 13.09.17 г. На 9 день после ТСКК - подъем температуры тела выше 38 °С. На КТ от 04.10.17 г.: в 86 и 81,2 левого легкого - инфильтрат неоднородной структуры с воздушными полостями 36x28 мм. Пациенту выполнена фибро-бронхоскопия (05.10.17 г.).
Методом прямой микроскопии с калькофлюором белым в образце БАЛ был обнаружен несептирован-ный мицелий гриба, ветвящийся под прямым углом. Культура гриба получена не была (табл. 3).
Таблица 3
Результаты исследования БАЛ пациента К.
Люминесцентная микроскопия с калькофлюором белым Обнаружен несептированный мицелий гриба, ветвящийся под прямым углом
Посев БАЛ Культура гриба не выявлена
Тест на галактоманнан АзрещШиз БРР. Отрицательный
Молекулярное исследование с помощью «2удо-Азр- ьем» Кривая плавления ПЦР-продукта имеет пик в области 86-87 °С, характерный для ЦсМЬе1тю согутЬИега (Рис.3).
( ! 1 Uchthelmio corymbifera (контроль)
Aspergillus spp. (контроль! ПЦР-продукт БАЛ — 4
Пороговая V линия ОКО J У \ I
1 it
——- — ^ !
75 7S 77 76 79 80 81 82 В1 BI й 86 SJ 93 141
Рис. 3. Профили кривых плавления ПЦР-продукта ДНК, выделенной из БАЛ больного К., Aspergillus spp. и L. corymbifera - ДНК культур (положительные контроли), ОКО - отрицательный контрольный образец.
Галактоманнановый тест в БАЛ был отрицательный. При молекулярном исследовании методом ПЦР-РВ в клиническом материале удалось обнаружить ДНК L.corymbifera. Как видно из рисунка 3, мы получили пик плавления ПЦР-продукта из БАЛ пациента К. в диапазоне 86-87 °С, который соответствует температуре плавления ДНК L. corymbifera, при этом отсутствовали пики плавления ДНК в зоне 77,5-78,3 °С, характерной для Aspergillus spp. С 09.10.17 г. у пациента регистрировали прогрессирование пневмонии с появлением новых инфильтратов, и была выполнена нижняя лобэктомия с резекцией субсегмента С2а и краевой резекцией С4 левого легкого. Результаты лабораторного исследования биоптата легкого представлены в таблице 4.
Таблица 4
Результаты исследования биоптаталегкого пациента К.
Люминесцентная микроскопия с калькофлюором белым Обнаружен несептированный мицелий гриба, ветвящийся под прямым углом (Рис. 4)
Посев Получена культура мукоромицета ЦсМЬетю согутЬНега
Молекулярное исследование с помощью «гудо-Азр-ШМ» Кривая плавления ПЦР-продукта имеет пик в области 86-87 °С, характерный для ЦсМЬетю согутЬИега (Рис. 5)
Гистологическое исследование В нижней доле левого легкого полость распада, заполненная детритом, с многочисленными широкими малосептированными гифами, ветвящимися под прямым углом, характерными для мукоромицетов
При люминесцентной микроскопии биоптата легкого (Рис. 4) был отчетливо виден несептированный мицелий гриба с ветвлением под прямым углом, а при посеве на среду Сабуро выделена культура L. corymbifera. При гистологическом исследовании биоптата обнаруживали несептированный мицелий гриба с ветвлением под прямым углом, характерный для му-коромицетов.
питательные среды был отрицательным. Гистологическое исследование операционного материала позволило выявить широкие нити несептированного мицелия, сходного с мукоромицетами (Рис. 6).
Рис. 4.Люминесцентная микроскопия биоптата легкого пациента К. с калькофлюором белым Х400.
При проведении ПЦР с мультиплексной тест-системой«Zygo-Asp-HRM» были получены пики плавления ДНК, выделенной из биоптата и культуры гриба, в диапазоне 86-87 °С, которые совпадали с пиком плавления ДНК референс-культуры L. corymbifera (Рис. 5). Данные молекулярного анализа биологического материала были сопоставимы с показателями микробиологических и гистологических исследований.
Рис. 5.Профили кривых плавления ПЦР-продуктов ДНК, выделенной из биоптата и культуры, полученной при посеве биоптата легкого больного К., Aspergillus Брр. и L. corymbifera - ДНК культур (положительные контроли), ОКО - отрицательный контрольный образец.
По результатам лабораторных исследований больному была назначена антимикотическая терапия (ам-фолип, затем амфотерицин, затем каспофунгин, по-законазол). На фоне лечения отмечено улучшение самочувствия, положительная КТ-динамика, и пациент выписан из стационара.
Пример 3. Применение тест-системы «Zygo-Asp-HRM» при исследовании нативного аутопсийного материала и парафиновых блоков ткани печени от пациентки Т. с микст-микозом.
Пациентка Т., 35 лет, с НХЛ. В июне 2014 г. выполнена аутологичная трансплантация костного мозга. На 19 день после трансплантации появились боли в правом подреберье, лихорадка. Проведена компьютерная томография брюшной полости. Диагностирован дис-семинированный процесс во всех органах. На 23 день была констатирована смерть пациентки.
При микроскопическом исследовании аутопсийно-го материала печени у больной обнаружен несептиро-ванный мицелий, ветвящийся под углом 90°, посев на
U '"С "«»
Рис. б.Аутопсийный материал (печень) пациентки Т. Хорошо видны нити толстого несептированного мицелия, ветвящегося под прямым углом. А - PAs-реакция, х100. Б -окраска по Гомори-Грокотт, х100. Исследование выполнено
Артемьевой А.С., гистологическая лаборатория НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова.
При молекулярном исследовании материала печени обнаружена ДНК двух грибов - Aspergillus sp. и R. microsporus. Кривые плавления ПЦР-продуктов ДНК, полученной из ткани печени пациентки Т. (Рис. 7), имели 2 пика с различными точками плавления: в районе 78 °C, характерном для Aspergillus spp., и 85,5 °C -для R. microsporus.
1 Aspergillus lap / \ Пациент T. / .^Д-^Т^образць! ОКО j p^c fthiiöinuccf pusillus I Mucor raccmosui ä/j teopus mkrotyorus Liththeimia corymblfero
i n?trrn«»M » о и П № и м
Рис. 7. Кривые плавления ПЦР-продуктов ДНК, выделенной из ткани печени больной Т., Aspergillus spp.- ДНК культуры (положительный контроль), ОКО - отрицательный контрольный образец.
Наличие аспергиллов в ткани печени подтверждено секвенированием грибной ДНК, выделенной непосредственно из парафинового блока, и определен вид возбудителя - Aspergillus flavus.Y пациентки был диагностирован микст-микоз, обусловленный A. flavus и R. microsporus. Чувствительность мультиплексной тест-системы «Zygo-Asp-HRM» была выше, чем традиционных микологических методов.
Таким образом, при исследовании клинического материала от 13 больных мукормикозом тест-система «Zygo-Asp-HRM» отличалась большей чувствительностью, чем традиционные методы, что уже отмечали другие исследователи для молекулярных методов в целом [22]. Положительные результаты, полученные нами с помощью мультиплексной ПЦР, полностью совпадали с микологическими (микроскопия + посев) и с гистологическими находками грибов в патологическом материале больных. У 3 пациентов с мукормикозом (1-Т, 2-П, 3-Б) было проанализировано наибольшее количество биосубстратов: биоптаты тканей /БАЛ/ парафиновые блоки. Микологические, гистологические и серологические методы дополняли друг друга в обнаружении возбудителя в клиническом материале, а молекулярно-биологические исследования позволяли уточнить вид мукоромицета и выявить у пациентов смешанную инфекцию, вызванную Aspergillus spp. и грибами порядка Mucorales. Тест-система была эффективна при изучении разного биологического материа-
ла. При тестировании образцов нативных биоптатов и парафиновых блоков с тканями, пораженными муко-ромицетами, концентрация геномной ДНК, выделенной из парафиновых блоков, была в 10 раз ниже, чем из свежих тканей. Эти результаты сопоставимы с зарубежными данными, в которых аналитическая чувствительность, не зависимо от типа молекулярного метода, составляла от 56% до 80% при тестировании образцов из парафиновых блоков и от 97% до 100% - для образцов свежих тканей [13-16].
Исследование БАЛ для выявления ДНК возбудителей мукормикозов представляется перспективным при отрицательных посевах БАЛ. Чувствительность ПЦР-исследований БАЛ у таких пациентов выше, чем крови/плазмы. В 2014 г. Lengerova M. и соавт. использовали ПЦР с последующим анализом кривых плавления ПЦР-продуктов высокого разрешения (ПЦР/ HRM) для обнаружения мукоромицетов в БАЛ имму-нокомпрометированных пациентов. Методика показала высокую чувствительность (100%) и специфичность (93%) обнаружения ДНК Mucorales в образцах БАЛ [23]. Мы в своей работе проанализировали 6 образцов БАЛ от больных c подтвержденным мукормикозом, однако необходимо тестирование большего количества биоматериала. Наши исследования согласуются с Глобальными рекомендациями для диагностики и лечения мукормикоза, опубликованными недавно [24], в которых подчеркнута перспективность использования молекулярных методов в диагностике мукормикозов (сила рекомендации BIIu).
ВЫВОДЫ
1. Тест-система позволяет быстро и точно выявлять и идентифицировать мукоромицеты до вида и аспер-гиллы до рода в биоптатах, операционном материале, заключенном в парафин, и БАЛ больных с мукорми-козом.
2. Тест-система может быть полезной для выявления смешанной инфекции, обусловленной грибами рода Aspergillus и порядка Mucorales.
ЛИТЕРАТУРА
1. SkiadaA., PaganoL., GrollA., etal. European Confederation ofMedical Mycology Working Group on Zygomycosis. Zygomycosis in Europe analysis of 230 cases accrued by the registry of the European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Working Group on Zygomycosis between 2005 and 2007. Clin. Microbiol. Infect. 2011;17 (12):1859-1867. doi.org/10.1111/j.1469-0691.2010.03456.x
2. Petrikkos G., Skiada A., Lortholary O., et al. Epidemiology and clinical manifestations of mucormycosis. Clin. Infect. Dis. 2012; 54 (Suppl.1): 23-34. doi.org/10.1093/cid/cir866
3. Chamilos G., Lewis R.E., Kontoyiannis D.P. Delaying amphotericin B-based frontline therapy 1357 significantly increases mortality among patients with hematologic malignancy who have 1358 zygomycosis. Clin. Infect. Dis 2008; 47 (4): 503-9. doi: 10.1086/590004.
4. Binder U., Maurer E., Lass-Florl C. Mucormycosis - from the pathogens to the disease. Clin. Microbiol. Infect. 2014; 20: 60-66. doi.org/10.1111/1469-0691.12566
5. Klimko N., Khostelidi S., Shadrivova O., et al. Contrasts between mucormycosis and aspergillosis in oncohematological patients. Medical Mycology. 2019; 57 (52):138-144. doi.org/10.1093/mmy/myy116
6. Spellberg B., Ibrahim A.S., Chin-Hong P. V., et al. The deferasirox-ambisome therapy for 1399 mucormycosis (DEFEAT Mucor) study: a randomized, double-blinded, placebo-controlled 1400 trial. J. Antimicrob Chemother. 2012; 67(3): 715-22. doi: 10.1093/ jac/dkr375.
7. Salehi E., Hedayati M.T., Zoll J., et al. Discrimination of aspergillosis, mucormycosis, fusariosis, and scedosporiosis in formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens by use of multiple real-time quantitative PCR assays.J. Clin. Microbiol. 2016; 54 (11): 2798-2803. doi.org/10.1128/JCM.01185-16
8. Springer J., Lackner M., Ensinger C., et al. Clinical evaluation of a mucorales-specific real-time PCR assay in tissue and serum samples. J. Med. Microbiol. 2016; 65: 1414-1421. doi.org/10.1099/jmm.0.000375
9. Schwarz P., Bretagne S., Gantier J.C., et al. Molecular identification of zygomycetes from culture and experimentally infected tissues. J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 340-349. doi.org/10.1128/JCM.44.2.340-349.2006
10. Legrand M., Gits-Muselli M., Boutin L., et al. Detection of circulating mucorales DNA in critically ill burn patients: preliminary report of a screening strategy for early diagnosis and treatment. Clin. Infect. Dis. 2016; 63: 312-1317. doi.org/10.1093/cid/ciw563
11. Millon L., Larosa F., Lepiller Q., et al. Quantitative polymerase chain reaction detection of circulating DNA in serum for early diagnosis of mucormycosis in immunocompromised patients. Clin. Infect. Dis. 2013; 56: e95-e101. doi.org/10.1093/cid/cit094
12. Baldin C., Soliman S.S.M., Jeon H.H., et al. PCR-based approach targeting mucorales-specific gene family for diagnosis of mucormycosis. J. Clin. Microbiol. 2018; 56 (10): e00746-18. doi: 10.1128/JCM.00746-18
13. Schwarz P., Bretagne S., Gantier J.C., et al. Molecular identification of zygomycetes from culture and experimentally infected tissues. J. Clin. Microbiol.2006; 44: 340-349. doi.org/10.1128/JCM.44.2.340-349.2006
14. Bernal-MartmezL., Buitrago M.J., Castelli M.V., et al. Development of a single tube multiplex real-time PCR to detect the most clinically relevant mucormycetes species.Clin.Microbiol. Infect. 2013;19 (1): E1-E7. doi.org/10.1111/j.1469-0691.2012.03976.x
15. Buitrago M.J., Aguado J.M., Ballen A., et al. Efficacy of DNA amplification in tissue biopsy samples to improve the detection of invasive fungal disease. Clin. Microbiol. Infect. 2013; 19: 271-277. doi.org/10.1111/1469-0691.12110
16. Lau A., Chen S., Sorrell T., et al. Development and clinical application of a panfungal PCR assay to detect and identify fungal DNA in tissue specimens. J. Clin. Microbiol. 2007; 45: 380-385. doi.org/10.1128/JCM.01862-06
17. Hrncirova K., Lengerova M., Kocmanova I., et al. Rapid detection and identification of mucormycetes from culture and tissue samples by use of high-resolution melt analysis. J. Clin. Microbiol.2010; 48: 3392-3394. doi.org/10.1128/JCM.01109-10
18. DePauw B., Walsh T.J., Donnelly J.P., et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases MycosesStudy Group (EORTC/MSG) Consensus Group. Clinical Infectious Diseases. 2008; 46 (12): 18131821. doi.org/10.1086/588660
19. UllmannA.J., Aguado J.M., Arikan-Akdagli S., et al. Diagnosis and management of Aspergillus diseases: executive summary of the 2017 ESCMID-ECMM-ERS guideline. Clinical Microbiology and Infection. 2018; 24 (Suppl 1):e1-e38. doi: 10.1016/j. cmi.2018.01.002.
20. Interpretive Criteria for Identification of Bacteria and Fungi by Targeted DNA Sequencing, 2nd Edition. CLSI document MM18. Clinical and Laboratory Standards Institute, 2018: 152 p. Order Code PDF: MM18Ed2E. ISBN Number: 978-1-68440-013-3
21. BuelowD.R., GuZ., Walsh T.J., HaydenR.T. Evaluation of multiplexed PCR and liquid-phase array for identification of respiratory fungal pathogens. Med. Mycol. 2012; 50 (7): 775-80. doi.org/10.3109/13693786.2012.666681
22. Dannaoui E., Schwarz P., Slany M., et al. Molecular detection and identification of zygomycetes species from paraffin-embedded tissues in a murine model of disseminated zygomycosis: A collaborative European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Fungal Infection Study Group (EFISG) evaluation. J. Clin. Microbiol. 2010; 48 (6): 2043-2046. doi: 10.1128/JCM.02319-09
23. Lengerova M., Racil Z., Hrncirova K., et al. Rapid detection and identification of mucormycetes in bronchoalveolar lavage samples from immunocompromised patients with pulmonary infiltrates by use of high-resolution melt analysis. J. Clin. Microbiol. 2014; 52: 2824-2828. doi.org/10.1128/JCM.00637-14
24. Cornely O.A., Alastruey-Izquierdo A., Arenz D., et al. Global guideline for the diagnosis and management of mucormycosis: an initiative of the European Confederation of Medical Mycology in cooperation with the Mycoses Study Group Education and Research Consortium. Lancet. Infect. Dis. 2019; 5. doi.org/10.1097/01.HS9.0000563416.43453.d2.
Поступила в редакцию журнала 21.11.19
Рецензент: А.Е. Тараскина
