CC BY
25УДК 616.992
ПРОДУКЦИЯ
цитокинов
МАКРОФАГАМИ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ СО ШТАММАМИ CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS РАЗНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ IN VITRO
Филиппова Л.В. (науч.сотр.)*, 'Фролова Е.В. (зав. лаб.), 1Учеваткина А.Е. (ст. науч. сотр.), Васильева Н.В. (директор), 2Киселева Е.П. (вед. науч. сотр.)
'НИИ медицинской микологии им, П.Н.Кашкина ГОУ ДПО СПб МАПО; 2НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2011
Изучали влияние 12 штаммов Cryptococcus neoformans раз-ной вирулентности на способность перитонеальных макрофагов мышей к продукции широкого спектра цитокинов (IL-lfi, IL-6, IL -10, IL -12р70, IL -13, IL -17, IL -23, TNF-a и TGF-fi). Установили, что все штаммы С. neoformans, вне зависимости от степени вирулентности, не стимулировали продукцию провоспалительных цитокинов 1L-12 р70, IL-lfi, TNF-a макрофагами. Сильновирулентные штаммы С. neoformans, по сравнению со слабовирулентными, достоверно выше индуцировали выработку IL-13, IL-10 и IL -17. Предварительная стимуляция макрофагов липополиса-харидом (ЛПС) и последующая инкубация с сильновирулентными штаммами С. neoformans приводили к разнонаправленным эффектам: отмечали существенное снижение продукции 1L-13 и усиление выработки IL -10 и 1L -17. Обработка макрофагов ла-минарином подавляла способность сильновирулентных штаммов С. neoformans к индукции IL-13 макрофагами. Таким образом, можно предположить, что при взаимодействии со штаммами С. neoformans, макрофаги приобретают признаки альтернативно активированных макрофагов: отсутствует продукция провоспалительных цитокинов 1L-I2p70, TNF-a и оксида азота, имеют место умеренная выработка IL-10 и повышенный синтез IL-13, что, вероятно, способствует персистенции грибов внутри макрофагов.
Ключевые слова: вирулентность, Cryptococcus neoformans, макрофаги, цитокины
CYTOKINE PRODUCTION BY MACROPHAGES IN THE INTERACTION WITH DIFFERENT VIRULENCE CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS STRAINS IN VITRO
Filippova L.V. (scientific researcher), 'Uchevatkina A.E. (senior scientific researcher), ’Frolova E.V. (head of the laboratory), ’Vasiljeva N.V. (director), 2Kiseleva E.P. (leading scientific researcher)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, SEI APE SPb MAPES; Research Institute of Experimental Medicine, Saint Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2011
The influence of 12 Cryptococcus neoformans strains of different virulence on the ability of mice peritoneal macrophages to a wide range of cytokines production (IL-lfi, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-23, TNF-a and TGF-fi) has been studied. It was established that all C. neoformans strains, regardless of virulence degree, did not stimulate production of proinflammatory cytokines IL-12p70, IL-lfi, TNF-a by macrophages. High virulent C. neoformans strains, as compared with low virulent strains, significantly higher induced the production of IL-13, IL-10 and IL-17. Pre-stimulation of macrophages by lipopoly saccharide (LPS) and subsequent incubation with high virulent C. neoformans strains resulted to different effects: there was a significant reduction of IL-13 production and of IL-10 and IL-17 increased production. Treatment of macrophages by laminarin inhibited the ability of high virulent C. neoformans strains to induce IL-13 by macrophages. Thus, we can assume that in interaction with C. neoformans strains the macrophages acquire the attributes of alternative activated macrophages: without production of proinflammatory cytokines IL-12p70, TNF-a and nitric oxide, and with the moderate production of IL-10 and enhance-weighted synthesis of IL-13, which probably contributes the fungal persistence inside macrophages.
Key words: Cryptococcus neoformans, cytokines, macrophages, virulence
* Контактное лицо: Филиппова Лариса Вячеславовна, Тел.: (812) 303-51-40
ВВЕДЕНИЕ
Сгу1Лососсш пео/огтат - оппортунистический патоген, являющийся одной из возможных причин развития криптококкоза у лиц с иммунодефицит-ными состояниями, особенно - у больных с синдромом приобретенного иммунодефицита при ВИЧ-инфекции. Преимущественно заболевание возникает после аспирации клеток патогена в легкие, в результате чего у иммунокомпетентных лиц возможно развитие бессимптомной бронхопневмонии, а у им-мунокомпрометированных больных С. пео/огтат диссеминирует из легких, чаще всего приводя к развитию тяжелого менингоэнцефалита. Без применения антифунгальной терапии эта форма заболевания завершается 100% летальностью, но даже при своевременно назначенном лечении погибает от 10% до 25% больных [1]. Клиренс грибов из легких во многом зависит от способности альвеолярных макрофагов разрушать клетки дрожжей, тем самым предотвращая их распространение. Макрофаги поглощают криптококки и уничтожают их за счет активации различных факторов микробоцидности: кислородза-висимых - за счет образования токсичных форм кислорода и выработки оксида азота и кислороднезави-симых - в результате действия протеиназ и катионных белков [2]. При фагоцитозе грибов макрофаги активируются и продуцируют различные цитокины, определяющие течение инфекционного процесса. Полагают, что 1Ь-12 и ТКР-а усиливают активность Т-хелперов 1-го типа (ТЫ), ответственных за повышение активности макрофагов. Такие цитокины как 11,-4 и II,-1.3 подавляют развитие адаптивного клеточного иммунного ответа, приводящего к неблагоприятному исходу криптококковой инфекции [3]. В соответствии с современными данными, эти цитокины также оказывают регулирующее влияние на индукцию макрофагов с различными фенотипами. Так, например, под влиянием 1Р1чГ-у и ТЫР-а индуцируются классически активированные макрофаги, обладающие высокой микробоцидной активностью и являющиеся центральными клетками врожденного иммунного ответа. В то же время альтернативно активированные макрофаги активируются при воздействии 11,-4 и IТ,-13, и уничтожение патогенов не является их основной функцией [4].
Известно, что возможность инвазии тканей С. пео/огтат и характер течения криптококковой инфекции определяются не только степенью иммунодефицита макроорганизма, но и вирулентностью штамма [5]. Это обусловлено тем, что с течением времени микроорганизмы выработали ряд механизмов, позволяющих им влиять на характер развития адаптивного иммунного ответа макроорганизма. Однако данные о влиянии степени вирулентности С. пео/огтат на спектр продуцируемых макрофагами цитокинов достаточно противоречивы.
Цель работы - оценить спектр цитокинов, вырабатываемых перитонеальными макрофагами мышей
in vitro при взаимодействии со штаммами С. neofor-mans разной вирулентности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования были 12 штаммов криптококков, полученные из Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ) НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина: Cryptococcus neo/ormans РКПГ №№ 1106, 1178, 1165, 1090, 1216, 1262, 1272, 1257, 1271, 1276, 1175, 1164. Все штаммы криптококков представлены клиническими изолятами, выделенными от больных сотрудниками лаборатории микологического мониторинга и биологии грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО Росздрава. Клетки С, neo/ormans, после выращивания в течение 72 часов на скошенном агаре Сабуро с 4% глюкозой при 37 °С, были отмыты в стерильном физиологическом растворе и доведены до концентрации 1 • 106 кл/мл в среде RPMI-1640 («РАА», Австрия). Для оценки жизнеспособности грибов использовали окраску трипановым синим: мертвые (нежизнеспособные) клетки окрашивались, живые - не поглощали красителя. Жизнеспособность грибов, использованных для эксперимента была равна 98%.
Макрофаги получали из перитонеальной полости мышей - самцов линии Balb/c, массой 18-20 г, в возрасте 8-12 недель. Концентрацию клеток доводили до 1-106 кл/мл в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и ген-тамицина. Макрофаги инкубировали в 24-луночных планшетах (Orange Scientific, Бельгия) 18 часов при 37 “ в С02-инкубаторе с 5% содержанием оксида углерода.
В эксперименте использовали интактные макрофаги и макрофаги, обработанные липополисахари-дом (ЛПС) в дозе 1 мкг/мл (£. coli 055:В5, Sigma) или ламинарином в дозе 1 мг/мл (Sigma). Ламинарин имеет сходную химическую структуру с полисахаридами грибов и представляет собой р(1,3)-гликан с р( 1 -6)-связями - полисахарид, обнаруженный в бурых водорослях Laminaria digitata. Культуру С. neo/ormans добавляли к макрофагам в соотношении 10:1. Продукцию цитокинов макрофагами в супернатанте исследовали через 24 часа после совместной инкубации с клетками грибов. Жизнеспособность макрофагов после культивирования составляла 95%. Оценку IL-lp, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17, IL-23, TNF-a и TGF-p проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов ELISA, R&D Systems.
Данные обрабатывали статистически при помощи пакета прикладных программ STATISTICA (версия 6.0) для Windows с использованием модуля «Анализ выживаемости», параметрического метода Стьюдента (t) с определением средней арифметической величины (М) и ошибки средней (т), корреляционного анализа (г).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как было показано ранее, при внутривенном инфицировании мышей разными штаммами С. пео/ог-тат сроки гибели экспериментальных животных варьировали в зависимости от вирулентности штаммов. Сильновирулентные штаммы С. пео/огтапя (п=5) вызывали гибель 50% животных на 8-16 день, а слабовирулентные (п=7) - на 27-65 день после заражения [6].
При оценке спектра вырабатываемых макрофагами цитокинов выявили, что изученные штаммы С. пео/огтат разной вирулентности не индуцировали макрофаги к выработке провоспалительных цитокинов 11,-12, 11,-1, Т№-а и регуляторных цитокинов - ТСт1-р, II,-2.3, то есть не было различий в уровнях цитокинов между интактными макрофагами и макрофагами, взаимодействующими с грибами (Рис.1).
пг/мл
* * j *
III Іі»гіу1 ill
IL-12 IL-tp TNF-a TCF-p IL-23 IL-fl IL-13 IL-10 IL-17
f3 контроль п слабовирулентные штаммы ■ сильновирулентныв штаммы
Рис. 1. Продукция цитокинов макрофагами при взаимодействии с С. neoformans разной вирулентности (р<0,05;
* - контроль, ** - между штаммами)
При этом все штаммы С. neoformans были способны активировать макрофаги к выработке IL-6. Примечательно, что сильновирулентные штаммы достоверно выше, по сравнению со слабовирулентными, индуцировали продукцию IL-13, IL-10 и IL-17 (Рис. 1). Мы установили корреляционную зависимость между вирулентностью грибов и их способностью к индукции II.-13, IL-10, IL-17 (IL-13, г = 0,63; IL-10, г = 0,62; IL-17 г =0,82; р<0,05). В связи с этим, дальнейшие исследования были сосредоточены на изучении особенностей продукции именно этих цитокинов при взаимодействии криптококков с макрофагами.
В соответствии с современными представлениями, особенности активации защитных врожденных механизмов эффекторных клеток зависят от строения лигандов патогена. Распознавание патогенов обусловлено экспрессией паттерн-распознающих рецепторов (pattern recognition receptors, PRRs) на эффекторных клетках хозяина, которые связывают представленные на патогене соответствующие консервативные молекулярные структуры (pathogen-associated molecular pattern, PAMPs). Основными паттерн-распознающими рецепторами являются Толл-подобные рецепторы (TLR) и дектин-1. Но
единого мнения об их роли в активации синтеза различных цитокинов до настоящего времени нет. Известно, что ЛПС взаимодействует с Т1,К4 и является стимулятором макрофагов для продукции широкого спектра цитокинов. В ходе эксперимента было выявлено, что сильновирулентные штаммы грибов достоверно повышали продукцию 11,-10 и 11,-17 макрофагами, предварительно стимулированными ЛПС (по сравнению с контролем - концентрацией, продуцируемой макрофагами, стимулированным только ЛПС) (Рис.2). Ламинарии (р-гликан) при взаимодействии с макрофагами блокирует рецептор дектин-1 и приводит к снижению их фагоцитарной активности [7]. Нами установлено, что все штаммы грибов, несмотря на блокаду дектина-1, стимулировали макрофаги к продукции 11,-10 (Рис. 2).
пг/мл
мф мфлпс+С. п мфлам+С.п
ВЭ контроль □ слабовирулентные штаммы ■ сильновирулентные штаммы
Рис. 2 Влияние С. пео(огтат разной вирулентности на продукцию 11-10 интактными макрофагами, культивированными с липополисахаридом или ламинарином (р<0,05; * - контроль; ** - между штаммами)
Примечателен факт, что сильновирулентные штаммы в 6 раз сильнее, по сравнению с контрольными значениями, стимулируют продукцию 11,1.3 и только в 2 раза - 11,-10 и 11,-17. Установлено, что сильновирулентные штаммы снижали выработку II,-13 макрофагами после инкубации с ЛПС и ламинарином, Это можно объяснить эффектом экранирования рецепторов, распознающих структуры капсулы и клеточной стенки гриба (Рис. 3).
пг/мл
мф + С.п. мфлпс + С.п. мф лам + С.а
^контроль П слабо вирулентные штаммы ■ сильновирулентные штаммы
Рис. 3, Продукция 11.-13: влияние липополисахарида и лами-нарина (р<0,05; * - контроль, ** - между группами)
В ряде исследований оценена роль цитокинов в борьбе с криптококковой инфекцией. Известно, что способность инфекционных агентов активировать
макрофаги к продукции 1Ь-12 играет ключевую роль в индукции иммунного ответа по ГЬ1 - типу, а баланс между ТЫ и 1Ъ2 имеет решающее значение для исхода заболевания [3]. Однако в последнее время появились данные о том, что макрофаги обладают выраженной пластичностью, что позволяет им реагировать на различные медиаторы и изменять свой фенотип, в результате чего они приобретают различные эффекторные свойства. Способность внутриклеточных патогенов активировать макрофаги к продукции II,-12 и ТМ-'-а приводит к выработке интерферона-у (П-'КГ-у) ТЫ. П-'К-у и 'ГМР'-а являются основными ци-токинами, активирующими факторы микробоцид-ности макрофагов, приводящими к уничтожению внутриклеточных патогенов. Такие макрофаги считаются классически активированными и являются центральными клетками врожденного иммунного ответа. Классически активированные макрофаги продуцируют высокие уровни 11,-12, ТМ-'-и, оксида азота и низкие уровни 11,-10. Кроме того, выделяют альтернативно активированные макрофаги, появляющиеся в организме под влиянием цитокинов ТЬ2 типа, а именно 11,-4 и II,-1.3. Их отличием является то, что они в меньшей степени продуцируют про-воспалительные цитокины и реактивные промежуточные метаболиты азота, но характеризуются повышенной активностью аргиназы-1, умеренной продукцией II,-10, экспрессией П,-4К, маннозного рецептора (С 1)206) и протеина семейства хитиназы (УМ1). Установлено, что аргиназа-1 успешно конкурирует с КЮ-синтазой за аргинин, субстрат который необходим для продукции реактивных промежуточных метаболитов азота [4]. Таким образом, основной функцией альтернативно активированных макрофагов, в отличие от классически активированных макрофагов, является не микробоцидная активность, а участие в репарации тканей за счет продукции коллагена. Таким образом, было необходимо оценить способность криптококков индуцировать макрофаги к продукции различных цитокинов, которые могут влиять как на особенности экспрессии их фенотипа, так и на дальнейшее формирование адаптивного иммунного ответа.
Нами было установлено, что все штаммы криптококков, вне зависимости от их вирулентности, не стимулировали макрофаги к выработке провоспа-лительных цитокинов 11,12, 11,-1 (5 и ТЫР-и. Также они не влияли на способность макрофагов, предварительно стимулированных ЛПС или обработанных ламинарином, к продукции названных медиаторов иммунного ответа. Эти данные не вполне совпадают с результатами, полученными друг ими исследователями. Так, было показано, что слабовирулентные, генетически модифицированные, акапсулярные мутанты криптококков стимулируют фагоциты к продукции провоспалительных цитокинов [8]. Эти различия можно объяснить тем, что все штаммы, используемые в нашей работе, являлись клиническими изо-лятами и, обладая разной степенью вирулентности,
вызывали развитие тяжелого менингоэнцефалита или диссеминированного криптококкоза. Таким образом, отсутствие способности криптококков индуцировать продукцию провоспалительных цитокинов IL-12 и TNF-a препятствует развитию эффективного клеточного иммунного ответа.
В экспериментальных исследованиях, проведенных Wozniak K.L. и др., было установлено, что индукция большого числа альтернативно активированных макрофагов, после заражения генетически модифицированных по IFN-y мышей С. neoformans, может быть связана с высокой летальностью от криптококкоза [9]. Другими авторами была изучена роль IL-4 в чувствительности к заражению криптококками [10]. Значение противовоспалительных цитокинов IL-13 и IL-10 в патогенезе инфекции С. neoformans, в основном, изучалось т vivo. Значительно меньшее количество работ посвящено исследованию связи степени вирулентности грибов со способностью макрофагов к продукции данных цитокинов in vitro.
В нашем исследовании установлено, что сильновирулентные штаммы активнее стимулировали фагоциты к продукции IL-13 и IL-10 как по сравнению с интактными макрофагами, так и по сравнению с влиянием на макрофаги слабовирулентных штаммов грибов. Предварительная инкубация макрофагов с ЛПС или обработка их ламинарином и последующее добавление сильновирулентных штаммов криптококков приводили к разнонаправленным эффектам: существенное снижение продукции IL-13, вероятно, за счет экранирования TLR4 и дектина-1 и усиление продукции IL-10, возможно, опосредованное связыванием с TLR2. Сопоставляя эти данные с результатами, полученными другими авторами in vivo, можно предположить, что при взаимодействии всех штаммов криптококков с макрофагами они приобретают признаки альтернативно активированных макрофагов: отсутствует продукция провоспалительных цитокинов IL-12, TNF-a и оксида азота, имеет место умеренная выработка II.-К) и повышенный синтез IL-13. Причем синтез IL-13 и II,-10, вероятнее всего, обусловлен сигналами, поступающими от различных рецепторов макрофагов.
В последние годы появились данные о значении Thl7 типа ответа в развитии криптококковой инфекции. Известно, что IL-17 является провоспалитель-ным цитокином, который продуцирует отдельная субпопуляция CD4+ Т-хелперов, названная Thl7 [11]. Значительно меньше известно о способности макрофагов к продукции IL-17 и о его роли в течении инфекционных процессов. Исследованиями, проведенными in vitro, было показано, что добавление IL-17 к культуре клеток способствовало снижению пролиферации дрожжей в макрофагах по сравнению с обработкой их IL-4 и IL-13. Da Silva с соавт. обнаружили, что хитин и другие компоненты клеточной стенки грибов стимулируют макрофаги к продукции IL-17 за счет активации TLR2 и MyD88 [12]. В наших исследованиях установлено, что совместная инкуба-
ция сильновирулентных штаммов грибов с макрофа- ми, не индуцируя дальнейшего развития иммунного
гами, активированными ЛПС, усиливала продукцию ответа по ТЬ17-типу.
11,-17, вероятно, за счет связывания компонентов Таким образом, сильновирулентные штаммы
капсулы и стенки грибов с Т1,К2. Эти результаты С. пео/огтаж при взаимодействии с перитонеаль-
очевидны при синергичной индукции 11,-10 и 11,-17 ными макрофагами индуцировали особый спектр
криптококками, отличной от индукции 1Ь-13. Полу- цитокинов, причем степень вирулентности грибов
ченные данные согласуются с исследованиями, в ко- находилась в прямой зависимости от интенсивности
торых подтверждено, что 11,-17 не участвует в индук- их продукции.
ции классически активированных макрофагов и не влияет на баланс других цитокинов [10].
ВЫВОДЫ
Считают, что такие цитокины, как TGF-p, IL-6 1. Штаммы С. neoformans, независимо от их виру-
или IL-21 необходимы для индукции Thl7 из наи- лентности, не стимулировали макрофаги к продук-
вных CD4+ Т-клеток мышей, a IL-23 поддерживает ции провоспалительных цитокинов.
их пролиферацию [11]. Нами установлено, что все 2. Сильновирулентные штаммы С. neoformans, по
исследованные штаммы криптококков не стимули- сравнению со слабовирулентными, достоверно выше
ровали синтез цитокинов, необходимых для индук- индуцировали продукцию IL-13, IL-10 и IL-17.
ции Thl7, таких как IL-23 и TGI - (1 Следовательно, 3. Липополисахарид и ламинарии подавляли
можно предположить, что макрофаги способны вы- способность сильновирулентных штаммов С. neofor-
рабатывать IL-17 в ответ на взаимодействие с гриба- mans к индукции 1L-13 макрофагами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Li S.S., Mody С.Н. CryptoCoccus // Рюс. Am. Thorac. Sod. - 2010. - Vol. 7, №3. - P.186-196.
2. Netea М., Van DerMeerJ, KullbergB. Recognition of fungal pathogen by Toll-like receptors//Immunology of fungal infection. - Springer, 2007. - P.259-272.
3. Koguchi Y, Kawakami K. Cryptococcal infection and Thl-Th2 cytokine balance// Int. Rev. Immunol. - 2002. - Vol.21. -P.423-438.
4. MosserD. М., ZhangX. Activation of Murine Macrophages // Curr. Protoc. Immunol. - 2008. - Chapter 14:Unit 14.2,
5. Васильева H.B. Факторы патогенности CryptoeOeeus neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза: ДиСе„. докт. биол. наук. - СПб., 2005.
6. Филиппова А.В., Учеваткина A.E., Фролова Е.В., Васильева Н.В., Киселева Е.П. Особенности взаимодействия макрофагов с разными по вирулентности штаммами Cryptococcus neoformans II Проблемы медицинской микологии. - 2010. - Т.12, №1. - С.38-41.
7. Dennehy К.М., Willment J.A., Williams D.L., Brown G.D. Reciprocal regulation of IL-23 and IL-12 following co-activation of Dectin-1 and TLR signaling pathways// Eur. J. Immunol. - 2009. - Vol. 39, №5. - P.1379-1386.
8. Lupo P., Chang Y. C, Kelsall B. L, Farber J. M. et all. The Presence of Capsule in CryptoeOeeus neoformans Influences theGene Expression Profile in Dendritic Cells during Interaction with the Fungus // Infect, and Immun. -2008. - Vol. 76. - P.1581-1589.
9. Wozniak K.L., Ravi S., Macias S., YoungM.L. Insights into the Mechanisms of Protective Immunity against Cryptococcus neoformans Infection Using a Mouse Model of Pulmonary Cryptococcosis // PLoS One. - 2009. - Vol 4. - e6854.
10. Hardison S.E., WozniakK.L., Kolls J.K., Wormley FL Jr. Interleukin-17 is not required for classical macrophage activation in a pulmonary mouse model of Cryptococcus neoformans infection //Infect. Immun. - 2010 - Vol.78, №12. - P.5341-5351.
11. Korn Т., Bettelli E., Oukka М., Kuchroo V. K. IL-17 and Thl7 cells II Annu Rev. Immunol. - 2009. - Vol. 27. - P.485-517.
12. Da Silva C. A., HartlD., Liu W., Lee C. G., Elias J. A. TLR-2 and IL-17A in chitin-induced macrophage activation and acute inflammation // J. Immunol. 2008. - Vol.181. - P.4279-4286.
Поступила в редакцию журнала 14.09.2011
Рецензент: А.В. Соболев
