Научная статья на тему 'Особенности взаимодействия Cryptococcus neoformans разной вирулентности и альвеолярных макрофагов'

Особенности взаимодействия Cryptococcus neoformans разной вирулентности и альвеолярных макрофагов Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
44
8
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
АЛЬВЕОЛЯРНЫЙ МАКРОФАГ / ВИРУЛЕНТНОСТЬ / ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ / ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ КРИПТОКОККОЗ / CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS / ALVEOLAR MACROPHAGES / EXPERIMENTAL CRYPTOCOCCOSIS / INNATE IMMUNITY / VIRULENCE

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Васильева Н. В., Степанова Амалия Аркадьевна, Филиппова Л. В., Босак И. А., Синицкая И. А.

В статье представлены данные светооптических исследований особенностей взаимодействия между альвеолярными макрофагами и клетками шести штаммов C. neoformans (РКПГ-881; РКПГ-1165, РКПГ-1178, РКПГ-1090, РКПГ-1095, РКПГ-1106) разной вирулентности при экспериментальном криптококкозе. Выявили, что альвеолярные макрофаги мышей, инфицированных штаммами C. neoformans слабой вирулентности, поглощали в два раза более крупные дрожжевые клетки по сравнению с сильновирулентными.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Васильева Н. В., Степанова Амалия Аркадьевна, Филиппова Л. В., Босак И. А., Синицкая И. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

PECULIARITIES OF CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS OF DIFFERENT VIRULENCE INTERACTION AND MURINE ALVEOLAR MACROPHAGES

The light microscopic investigations of peculiarity interactions between murine lung macrophages and the cells of three poorly (RCPF-881; RCPF-1165, RCPF-1178) and three strongly (RCPF-1090, RCPF-1095, RCPF-1106) virulent strains of C. neoformans after seven days of beginning of experiments have been presented in this article. It was revealed that macrophages of the mice, infected with cultures of poorly virulent strains phagocytized in twice larger yeast fungal cells in comparison with similar the mice infected with cultures strongly virulent once.

Текст научной работы на тему «Особенности взаимодействия Cryptococcus neoformans разной вирулентности и альвеолярных макрофагов»

УДК 616.992

ОСОБЕННОСТИ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

CRYPTOCOCCUS

NEOFORMANS РАЗНОЙ

ВИРУЛЕНТНОСТИ

И АЛЬВЕОЛЯРНЫХ

МАКРОФАГОВ

Васильева Н.В. (директор НИИ),

Степанова A.A. (вед.н.сотр.)*,

Филиппова Я.В. (научный сотрудник),

Босак И.А. (миколог), Синицкая И.А. (ст.н.сотр.), Чилина Г.А. (зав. лаб.)

НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия

© Коллектив авторов, 2011

В статье представлены данные светооптических исследований особенностей взаимодействия между альвеолярными макрофагами и клетками шести штаммов C. neoformans (РКПГ-881; РКПГ-1165, РКПГ-1178, РКПГ-1090, РКПГ-1095, РКПГ-1106) разной вирулентности при экспериментальном криптококкозе.

Выявили, что альвеолярные макрофаги мышей, инфицированных штаммами C. neoformans слабой вирулентности, поглощали в два раза более крупные дрожжевые клетки по сравнению с сильновирулентными.

Ключевые слова: альвеолярный макрофаг, вирулентность, врожденный иммунитет, Cryptococcus neoformans, экспериментальный криптококкоз

PECULIARITIES OF CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS OF DIFFERENT VIRULENCE INTERACTION AND MURINE ALVEOLAR MACROPHAGES

Vasilyeva N.V. (director of Institute), Stepanova A.A. (leading researcher), Filippova L.V. (scientific researcher), Bosac I.A. (laboratory mycologist), Sinitskaya I.A. (senior researcher), Chilina G.A., (head of laboratory)

Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after 1.1. Mechnikov, St.Petersburg, Russia

© Collective of authors, 2011

The light microscopic investigations of peculiarity interactions between murine lung macrophages and the cells of three poorly (RCPF-

* Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна

Тел.: (812) 303-51-40

881; RCPF-1165, RCPF-1178) and three strongly (RCPF-1090, RCPF-1095, RCPF-1106) virulent strains ofC. neoformans after seven days of beginning of experiments have been presented in this article.

It was revealed that macrophages of the mice, infected with cultures of poorly virulent strains phagocytized in twice larger yeast fungal cells in comparison with similar the mice infected with cultures strongly virulent once.

Key words: alveolar macrophages, Cryptococcus neoformans, experimental cryptococcosis, innate immunity, virulence

ВВЕДЕНИЕ

Макрофагам отводят ведущую роль в патогенезе криптококкоза [1]. Однако клеточные аспекты взаимоотношений криптококк -макрофаг при экспериментальном криптококкозе с использованием штаммов С. neoformans разной вирулентности изучены недостаточно, что и явилось основной целью настоящей работы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использовали культуры шести штаммов С. neoformans (РКПГ-881; РКПГ-1165, РКПГ-1178, РКПГ-1090, РКПГ-1095, РКПГ-1106) из Российской коллекции патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И.Мечникова. Все штаммы были выделены от больных криптококкозом.

Для определения степени вирулентности С. neoformans животным вводили по 0,5 мл взвеси патогена (с концентрацией 107, 106, 10s, 104 и 103 клеток криптококка). Каждую дозу испытывали на 10 мышах. В качестве количественной характеристики была принята величина LD 50, которую определяли на 28 сутки методом «пробитов» [2].

Модель экспериментального криптококкоза воспроизводили на белых беспородных мышах-самцах массой тела 18-20 г, которых инфицировали внутривенно (доза - 5-10s кл/мышь) клетками 3-х дневных культур С. neoformans, выращенных при 37 °С на агаре Сабуро (pH 5,7). Через 7 дней после начала эксперимента кусочки легких мышей фиксировали глута-ральдегидом-осмием и заливали в смесь эпоксидных смол эпон-аралдит по методике, описанной нами ранее [2, 3].

Диаметр зрелых клеток культур и толщину их полисахаридной капсулы изучали при микроскопии препаратов с применением туши с помощью светового микроскопа Leica DM 4000, используя программное обеспечение Leica IM 1000, Adobe Photoshop 7, Excel и персональный компьютер на базе процессора Intel. Подсчет числа фагоцитированных альвеолярными макрофагами клеток С. neoformans, их диаметр и толщину капсулы проводили на полутонких эпоксидных срезах толщиной 3-5 мкм, окрашенных толу-идиновым синим. Полученные данные обрабатывали статистически параметрическим методом Стьюден-та (t) с определением средней арифметической величины (М) и ошибки средней (ш). Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Определение средних значений диаметра клеток гриба и

толщины капсулы in vivo и in vitro проводили для 50 клеток каждого штамма гриба, тогда как подсчет среднего числа клеток гриба в альвеолярных макрофагах - в 100 фагоцитах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Через 7 дней после начала эксперимента в ткани легких мышей отмечали одиночные клетки гриба (Рис. 1а), скопления из нескольких клеток (Рис. 16), а также довольно крупные пустотные образования

- так называемые «цисты» (Рис. 1в). При просмотре полутонких эпоксидных срезов в световом микроскопе (хЮОО) четко отмечали, что клетки С. neoformans в «цистах» различались между собой по диаметру (Рис. 1в,г). Содержимое интактных клеток грибов в «цистах», а также находящихся в содержимом макрофагов на разных стадиях фагоцитоза, после окрашивания ткани легких мышей толуидиновым синим, становились темно-синими (Рис. 1в,г), тогда как содержимое отмерших и отмирающих клеток -бесцветным (Рис. 1а,г,н). Часто выявляли почкующиеся дрожжевые клетки грибов внутри «цист».

Альвеолярные макрофаги мышей, инфицированных культурами штаммов С. neoformans разной вирулентности, достоверно не различались между собой по числу фагоцитированных клеток гриба (табл. 1).

Таблица 1

Фагоцитарная активность альвеолярных макрофагов при экспериментальном криптококкозе (через 7 дней

после начала эксперимента)

Штаммы С. neoformans (РКПГ) Фагоцитарное число Пределы варьирования числа клеток С. neoformans внутри макрофага

Слабовирулентные штаммы

881 3,09±0,15 1-6

1165 3,26±0,14 1-6

1178 3,55±0,14 1-6

Сильновирулентные штаммы

1090 3,57±0,16 1-6

1095 3,19±0,16 1-8

1106 3,03±0,14 1-7

Как видно из таблицы 1, число поглощенных макрофагами клеток гриба варьировало от 1 до 8. Отметим, что альвеолярные макрофаги мышей, инфицированные слабовирулентными штаммами криптококка, фагоцитировали в два раза более крупные дрожжевые клетки, имеющие, соответственно, вдвое более толстые капсулы по сравнению с таковыми мышей, инфицированных культурами сильновирулентных штаммов (табл. 2).

Таблица 2

Средние значения диаметра клеток и толщины капсулы С. пеоШтапь разной вирулентности, поглощенных альвеолярными макрофагами (через 7 дней после начала эксперимента)

Штаммы Пределы варьирова- Диаметр клеток гриба, М±т, мкм Пределы варьирования Толщина

С. neofor- ния диаметра толщины капсулы

mans клеток С капсулы клеток С. neoformans,

(РКПГ) neoformans, С. neoformans, M±m, мкм

мкм мкм

Слабовирулентные штаммы

881 7,14-35,7 19,04±1,12 0,36-17,85 7,58±0,64

1165 7,14-36,65 15,98±1,11 1,79-21,66 6,70± 0,77

1178 7,85-57,12 20,23±1,33 1,79-39,27 8,62± 0,90

Сильновирулентные штаммы

1090 3,96-13,76 8,20±0,42 0,17-8,60 3,03±0,31

1095 3,96-15,48 7,85±0,39 0,52- 7,40 2,36±0,28

1106 3,96-15,31 9,50±0,50 0,89-9,29 4,71 ±0,37

По данным светооптических исследований, в тканях легких мышей вблизи одиночных клеток гриба (Рис. 1а,б) и скоплений из небольшого их числа (Рис. 16) макрофаги отсутствовали. Последние можно было наблюдать по периферии «цист» и на разных уровнях в их содержимом (Рис. 1в). На рисунке 1и стрелкой показана адгезия гриба к поверхности макрофага, тогда на рисунках 1з,л,н - более поздние стадии фагоцитоза. В парадермальных срезах альвеолярных макрофагов, локализующихся вблизи и внутри «цист», обнаружили, что один макрофаг может одновременно фагоцитировать до трех одиночных дрожжевых клеток (Рис. 1г). Редко наблюдали почкующиеся клетки гриба, локализующиеся внутри макрофага (Рис. 1ж).

При анализе средних значений толщины клеточной стенки, диаметра зрелых дрожжевых клеток гриба и толщины полисахаридной капсулы (табл. 3), характерных для клеток культур изученных штаммов in vitro и in vivo, выявили значительное увеличение этих показателей у тканевых форм гриба. Так, в 1,52 раза возросла толщина клеточной стенки у клеток гриба всех изученных в настоящей работе слабовирулентных штаммов и одного - сильновирулентного (РКПГ-1106).

Таблица 3

Средние значения диаметра зрелых клеток С. neoformans, толщины их капсулы и клеточной стенки у изученных штаммов in vitro и in vivo

Штаммы С. neo- Диаметр клеток in Толщина капсулы Толщина клеточной Диаметр клеток in Толщина капсу- Толщина клеточной

formans vitro, in vitro, стенки in лы in стенки in

(РКПГ) мкм мкм vitro, мкм VIVO, мкм vivo,мкм vivo, мкм

Слабовирулентные штаммы

881 12,05± 0,25 4,95± 0,30 0,16± 0,0035 15,89± 0,17 8,55± 0,16 0,3 0± 0,0052

1165 10,00± 0,54 3,25± 0,43 0,12± 0,0020 55,31± 0,64 4,45± 0,31 0,24± 0,0038

1178 10,04± 0,62 2,40± 0,35 0,23± 0,0031 45,3 7± 0,82 3,42± 0,14 0,45± 0,0027

Сильновирулентные штаммы

1090 9,14± 0,12 2,21 ± 0,13 0,19± 0,0028 37,58± 0,77 19,10± 0,65 0,21± 0,0029

1095 9,53± 0,36 1,72± 0,54 0,22± 0,0025 29,18± 0,33 4,9 2± 0,25 0,22± 0,0043

1106 10,90± 0,20 3,77± 0,19 0,29± 0,0018 66,54± 2,08 4,40± 0,27 0,40± 0,0047

Лишь у клеток двух сильновирулентных штаммов (РКПГ-1090 и РКПГ-1095) значения толщины клеточной стенки оставались практически без изменений.

Средние значения диаметра зрелых клеток гриба практически не изменялись у слабовирулентного штамма РКПГ-881, но в 4-5 раз возрастали у штамма аналогичной вирулентности - РКПГ-1165 и РКПГ-1178. Для клеток всех сильновирулентных штаммов С. neoformans отмечали увеличение средних значений их диаметра, однако показатели варьировали от штамма к штамму (в 3 раза - у клеток штамма РКПГ-1095, в 6,1 и 4,1 соответственно - у штаммов РКПГ-1106 и РКПГ-1090).

В группе слабовирулентных штаммов толщина полисахаридной капсулы клетки гриба увеличивалась незначительно, за исключением штамма РКПГ-881, у клеток которого эти значения возросли в 1,7 раза. Анализируемый показатель у клеток сильновирулентного штамма РКПГ-1090 возрастал в 8,6 раз; тогда как у РКПГ-1095 и РКПГ-1106 соответственно

- в 2,8 и 1,2 раза.

В ряде работ, на светооптическом уровне in vitro - на примере макрофагов человека и in vivo - на примере макрофагов легких мышей [4-6], было продемонстрировано, что фагоцитированные макрофагами дрожжевые клетки могут активно делиться и расти, что, в конечном итоге, может привести к лизису содержимого макрофага. Tucker S.C. и Casa-devall А. [5] считают, что репликация С. neoformans внутри макрофагов может сопровождаться синтезом ферментов, включая протеиназы и фосфолипазы, которые разрушают мембрану фагосом. В полученном материале мы также часто наблюдали фагосомы, содержащие от 2 до 5 дрожжевых клеток (Рис. 1м).

Во всех изученных вариантах эксперимента, в содержимом «цист» мы наблюдали контакт между двумя (Рис. 1з), тремя (Рис. 1и) и даже четырьмя макрофагами (Рис. 1к), в содержимом которых присутствовали клетки гриба. При этом контактирующие макрофаги могли фагоцитировать дрожжевые клетки (Рис. 1з,и, стрелки). Ранее был описан феномен так называемой «латеральной передачи» дрожжевых клеток С. neoformans [7, 8] от инфицированных к не-инфицированным грибами макрофагам. Однако эти данные были зарегистрированы в экспериментах in vitro. Как считают Alvarez М. и Casadevall А. [7], это довольно редкое явление представляет собой очень важную стратегию патогена, позволяющую клеткам гриба противостоять действию антимикотиков. Подобную картину контакта макрофагов, содержащих клетки криптококка и без них, мы наблюдали в полученном материале (Рис. 1о), однако встречались они крайне редко.

Обнаруженные в ткани легкого мышей, инфицированных культурами сильно-вирулентного штамма РКПГ-1106, так называемые «гигантские» клетки гриба ранее отмечали в работах другие авторы как in vitro [2], так и in vivo [9]. Отметим, что ранее для штамма РКПГ-1090 в условиях культуры было также

выявлено формирование таких клеток [2] при рецидиве криптококкоза у ВИЧ-инфицированного пациента на фоне лечения флуконазолом. Cruickshank J.G. с соавторами (1973) описали их в культурах изоля-тов, полученных из плевральной жидкости пациентов, причем их диаметр доходил до 80 мкм. Anandi V. с соавторами (1991) обнаружили крупные клетки у дрожжевых форм гриба в культурах, изолированных от ВИЧ-инфицированных больных. Крупные клетки отличались наличием более толстых клеточных стенок и полисахаридных капсул. Аналогичные формы были выявлены в культурах некоторых штаммов криптококка, а также непосредственно в тканях легких мышей [9], где даже через 24 часа после инфицирования они не подвергались фагоцитозу. Описываемые клетки по размерам были крупнее макрофагов, а их диаметр доходил до 28 мкм, что, согласно мнению авторов, не позволяло последним поглощать их. «Гигантские» клетки гриба были найдены также у изо-лятов, выделенных из легких и спинномозговой жидкости человека. В исследованиях Zaragoza О. с соавторами [10] на примере ряда штаммов C. neoformans было показано, что крупные клетки отсутствовали в культурах гриба, однако появлялись после инфицирования ими легких мышей, где их диаметр (включая толщину полисахаридной капсулы) мог варьировать от 40 до 60 мкм и, в среднем, составлял 30 мкм. Как считают авторы, присутствие гигантских дрожжевых клеток криптококка в ткани легкого представляет собой серьезную проблему для иммунной системы хозяина, поскольку альвеолярные макрофаги не способны их поглощать. В связи с вышеизложенным, интересными представляются исследования Blackstock R. с соавт. (1997, 1999), согласно которым при инфицировании мышей культурами C. neoformans, имеющими клетки с тонкими капсулами, толщина последних остается без изменений в ткани легких; при этом они быстро и легко удалялись из ткани легких, не вызывая развития заболевания.

При сравнении средних значений диаметра клеток C. neoformans, поглощенных альвеолярными макрофагами и локализующихся в тканях легких мышей (см. табл. 2 и 3), очевидно, что для всех изученных штаммов, за исключением штамма РКПГ-881, в легких мышей клетки гриба были в несколько раз (в 3,5 раза - для штамма РКПГ-1165, в 2,2 раза- для штамма РКПГ-1178, в 4,6 раза - для штамма РКПГ-1090, в 3,7 раза - для штамма РКПГ-1095 и в 7 раз - для штамма РКПГ-1106) крупнее того «ассортимента», который был выявлен внутри макрофагов. Пределы средних значений фагоцитированных клеток изученных штаммов гриба варьировали от 3,96 до 7,85 мкм, что значительно больше средних значений диаметра клеток гриба, составляющих «цисты».

В результате проведенных исследований показано, что при экспериментальном криптококкозе альвеолярные макрофаги мышей, инфицированных штаммами C. neoformans слабой и сильной вирулентности, не различались между собой по количеству

Э I» [ Щ Ц - г пьн . 1И о р 11

Рис. 1. а - одиночная клетка гриба в ткани легкого мыши, инфицированной культурой сильновирулентного штамма РКПГ -1090; б - скопление из небольшого числа клеток криптококка в ткани легкого мыши инфицированной культурой слабо вирулентного штамма РКПГ-881; в - общий вид цисты в ткани легкого мыши, инфицированной культурой сильно вирулентного штамма РКПГ-1095; г - фрагмент цисты с клетками гриба (штамм РКПГ-1095) и макрофагами; д-о - особенности морфологии макрофагов в ткани легких инфицированных мышей (д,е - РКПГ-1178; ж,з - РКПГ-1106;

и,к - РКПГ-1165; л,м - РКПГ-1090; н,о - РКПГ-881).

Условные обозначения: ВМ - выросты макрофага; ИКГ - интактная клетка гриба; КГ - клетка гриба; Мф - макрофаг; ОКГ -отмершая клетка гриба. Цифрами обозначены макрофаги. |в - стрелками показаны макрофаги; \ г - стрелками показаны клетки гриба на начальных стадиях фагоцитоза, |ж - стрелкой показана дочерняя почка; |з,и,м,н,о - стрелками показаны

клетки гриба. Ув.: а,б,г,д-к,м,о - х1000; в - х700; л - х 1200; н -х900.

поглощенных криптококков. В то же время, альве- раза более крупные дрожжевые клетки гриба, по

олярные макрофаги, инфицированные культурами сравнению с сильновирулентными,

слабовирулентных штаммов, фагоцитировали в два

ЛИТЕРАТУРА

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1. Guerrero A., Jain N., WangX., Fries B.C. Cryptococcus neoformans variants generated by phenotypic switching differ in virulence through effects on macrophage activation // Infect, and Immun. - 2010. - Vol. 78, №3. - P. 1049-1057.

2. Васильева H.B. Факторы патогенности Cryptococcus neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза: Дисс... на соиск. уч. ст. д.б.н., СПб., 2005. - 340 с.

3. Васильева Н.В., Степанова А.А., Синицкая И.А. Особенности морфогенеза клеток С. neoformans в зависимости от их вирулентности // Проблемы медицинской микологии. - 2007. - Т. 9, №2. - С. 23-30.

4. Feldmesser М., Kress Y., CasadevallA. Intracellular crystal formation as a mechanism of cytotoxicity in murine pulmonary Cryptococcus neoformans infection // Infect. Immun. - 2001a. - Vol. 69, №4. - P. 2123-2121.

5. Tucker S.C., Casadevall A. Replication of Cryptococcus neoformans in macrophages is accompanied by phagosomal per-meabilization and accumulation of vesicles containing polysaccharide in the cytoplasm // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2002. - Vol. 99, №5. - P. 3165-3170.

6. Harrison T.S., Levitz S.M. Cryptococcus neoformans and macrophages. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. - 2002.

7. Alvares М., Casadeval A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of marine macrophages // BMC Immunology. - 2007. - 8:16doi:10.1186/1471-2172-8-16.

8. Ma H., Croudace J.E., Lammas D.A., May R.C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast // BMC Immunol. - 2007. - Vol. 8. - 15 p.

9. Feldmesser М., Tucker S., CasadevallA. Intracellular parasitism of macrophages by Cryptococcus neoformans // Trends Microbiol. - 2001b. - Vol. 9. - P.273-278.

10. Zaragoza O., Roci 'o Garci 'a-Rodas R., Nosanchuk J.D., et al. Fungal cell gigantism during mammalian infection // Plos. pathogen (Freely Online), 2010. - Vol. 6, Issue 6. - 18 p.

Поступила в редакцию журнала 29.12.2011

Рецензент: Фролова Е.В.

%.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.