CC BY
11УДК 616. 992
ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ И КАПСУЛЫ ЗРЕЛЫХ КЛЕТОК СЛАБО И СИЛЬНОВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS VAR. NEOFORMANS В ХОДЕ IN VITRO^IN VIVO ТРАНСФОРМАЦИИ
Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой), Степанова А.А. (зав. лаб.)*
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2018
На примере зрелых дрожжевых клеток 14 штаммов C. neoformans, выращенных in vitro, и 13 штаммов, размножившихся in vivo (в легких и мозге мышей в ходе моделирования экспериментального криптококкоза), приведены данные по строению клеточной стенки и полисахаридной капсулы. Показано, что зрелые дрожжевые клетки гриба in vitro и in vivo различались между собой по толщине и строению полисахаридной капсулы, однако эти признаки не были связаны со степенью их вирулентности. Ультраструктура полиса-харидной капсулы зрелых клеток у разных штаммов C. neoformans подвергалась изменениям при смене условий in vitro^in vivo. Выявлено для зрелых дрожжевых клеток 14 штаммов in vitro 4 типа тонкого строения капсулы и для 13 штаммов in vivo (в легких и мозге мышей) также 4 типа, но принципиально другого строения.
Ключевые слова: Cryptococcus neoformans, in vitro, in vivo, легкие и мозг мышей, полисахаридная капсула, ультраструктура, экспериментальный криптококкоз
ELECTRONMICROSCOPIC INVESTIGATION OF THE CELL WALL AND CAPSULES IN MATURE CELLS OF POORLY AND STRONGLY VIRULENT STRAINS OF CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS VAR. NEOFORMANS DURING IN VITRO^IN VIVO TRANSFORMATION
Vasilyeva N.V. (director of institute, head of the department), Stepanova A.A. (head of the laboratory)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of NorthWestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2018
Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна, e-mail: amaliya.stepanova@szgmu.ru
On the example the mature yeast cells of 14 C. neoformans strains growing in vitro и 13 strains reproduced in vivo in mouse lung and brain during modeling of experimental cryptococcosis the data according the transformation of cell walls and capsular polysaccharide ultrastructure were carry out. It was revealed that the mature fungal yeast cells in vitro and in vivo differ with cell wall thickness and capsular polysaccharide structure, however, this could signs not be interrelated with the degree of their virulence. The capsular polysaccharide ultrastructure of the mature cells strains of C. neoformans undergoes the changes during in vitro^in vivo transformation. It was revealed 4 types of a fine structure of the mature yeast cells capsules for 14 strains and for 13 strains in vivo (in lung and a brain of mice) also 4 types, but completely other structure.
Key words: capsular polysaccharide, Cryptococcus neoformans, experimental cryptococcosis, in vitro, in vivo, mouse lung and brain, ultrastructure
ВВЕДЕНИЕ
Капсулообразование - видовой признак С. neoformans. Полисахаридная капсула также выполняет функцию физического барьера, препятствующего фагоцитозу, оказывает многоплановое влияние на иммунную систему хозяина [1].
Особенности ультраструктуры полисахаридной капсулы дрожжевых клеток С. neoformans описаны в небольшом числе работ [2-4], главным образом, на примере культур гриба, выращенных in vitro. Однако до сих пор малоизученными оставались характер изменений ультраструктуры клеточной стенки и поли-сахаридной капсулы у зрелых клеток криптококка, в частности, у штаммов разной вирулентности в условиях in vitro и in vivo, что и стало задачей настоящего исследования.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследовали штаммы из Российской коллекции патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СЗГМУ им. И.И. Мечникова. С помощью методов трансмиссионной электронной микроскопии изучали особенности строения стенок и капсул зрелых клеток 14 штаммов разной вирулентности (РКПГУ-719, 1063, 1067, 1085, 1088, 1091, 1093, 1095, 1113, 1166, 1176, 1178, 1180 и 1175) C. neoformans, выращенных in vitro на среде Сабуро, и 13 штаммов разной вирулентности (РКПГУ-881, 1067, 1090, 1093, 1095, 1096, 1105, 1106, 1165, 1176, 1178, 1180 и 1181) - в тканях легких и мозга через семь суток после внутривенного введения мышам культур этих штаммов. У семи штаммов (РКПГУ-852, 853, 1085, 1088, 1089, 1113 и 1164) эти цитологические характеристики изучали только в тканях мозга мышей, поскольку в легких в это время мы их не обнаруживали. Культуры гриба выращивали 72 часа при 37 °С на агаре Сабуро (рН 5,7).
Материал фиксировали и обрабатывали по методике, описанной нами ранее [5].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Ультраструктура стенки и полисахаридной капсулы зрелых дрожжевых клеток у штаммов С. neoformans разной вирулентности, выращенных in vitro. В составе стенки зрелой дрожжевой клетки гриба имеется рубчик, образовавшийся после отделения почки от материнской клетки. Снаружи клеточная стенка покрыта хорошо развитым слоем полисахарид-ной капсулы (Рис. 1, 2).
На основании анализа средних значений толщины клеточной стенки зрелых клеток C. neoformans
выделены три группы штаммов: с толстыми (в пределах от 0,40 до 0,43 мкм), средней толщины (от 0,21 до 0,23 мкм) и тонкими (от 0,10 до 0,18 мкм) стенками. Для зрелых клеток исследованных штаммов были характерны однослойные темные клеточные стенки, состоящие из высококонтрастных микрофибрилл (Рис. 1). Мы не обнаружили статистически значимых различий в толщине стенок зрелых клеток гриба в зависимости от степени вирулентности штаммов, выращенных in vitro. Клетки сильно-, средне- и слабовирулентных штаммов могли иметь как толстые, так и средней толщины и тонкие стенки.
С целью выявления общего и наиболее типичного плана строения капсулы мы изучали ее строение на всех стадиях развития клетки С. neoformans. Установлено, что для зрелых клеток исследованных штаммов гриба, выращенных in vitro, характерно наличие 4-х основных типов строения капсулы.
Так, зрелые клетки культур штаммов РКПГУ-1067 и 1113 имели наиболее просто устроенный 1-ый тип строения полисахаридной капсулы (Рис. 1 а, б). В составе капсулы этого типа различимы три слоя: первый, непосредственно прилегающий к клеточной стенке, -тонкий, светлый и тонко-гранулярный; второй - также тонкий, темный, состоящий из беспорядочно ориентированных светлых и темных микрофибрилл. Третий слой в составе капсулы 1-го типа светлый, аморфный.
Второй тип строения полисахаридной кап-сулы был описан для зрелых клеток штаммов РКПГУ-719, 1063, 1091, 1095 и 1180 (Рис. 1 в, г). Первый ее слой
- тонкий, светлый, умеренной плотности, грануляр-но-фибриллярный, с мелкими темными глыбками неправильной формы в верхней половине, плотность расположения которых возрастала в центробежном направлении. Второй слой - более плотный, имел грубо-фибриллярное строение; внутри него и на поверхности встречались мелкие и более крупные электронно-плотные глыбки разной формы и размеров, а также мелкие светлые включения, в основном, сконцентрированные в нижней его части. Третий слой у капсулы этого типа, как и в таковой 1-го типа, был светлым и аморфным.
Третий тип строения капсулы был выявлен для зрелых клеток штаммов РКПГУ-1088, 1093 и 1176 (Рис. 1 д, е). Первый ее слой в 2 раза толще, чем в капсулах первых 2-х типов, электронно-светлый, с редкими, едва различимыми микрофибриллами. Отличительной особенностью строения полисахаридной капсулы третьего типа было то, что 2-ой (на схеме 2) слой был в 2-3 раза тоньше, чем аналогичный у капсулы 2-го типа, имел умеренную электронную плотность и гомогенную текстуру. В его верхнем слое наблюдали более крупные электронно-плотные глыбки различной морфологии. Третий (на схеме 3) слой у капсулы этого типа по электронной плотности и особенностям строения сходен с таковым капсул 1-го и 2-го типов тонкого строения.
Четвертый тип строения капсулы был характерен для зрелых клеток штаммов РКПГУ-1085, 1166, 1175 и 1178 (Рис. 1 ж, з). Первый (на схеме 1) слой капсулы
- чрезвычайно тонкий, светлый, 2-ой (на схеме 1а) -толстый, также светлый, фестончатой формы, пронизанный многочисленными радиально ориентированными микрофибриллами. Снаружи он покрыт 3-им
(на схеме 2) плотным грубо-гранулярным слоем, имеющим также неровный внешний контур. Последний, 4-ый (на схеме 3) слой капсулы у зрелых клеток этих штаммов имел строение, сходное с капсулами первых трех типов.
Ультраструктура клеточной стенки и полисахаридной капсулы зрелых дрожжевых клеток штаммов С. neoformans разной вирулентности in vivo. В
ходе экспериментального моделирования криптокок-коза, через 7 суток после внутривенного введения патогенов мышам, клетки 11-ти штаммов (РКПГУ-881, 1067, 1090, 1093, 1095, 1096, 1106, 1176, 1178, 1180 и 1181) гриба наблюдали в тканях легких и мозга. Клетки 7-ми штаммов (РКПГУ-852, 853, 1085, 1088, 1089, 1113 и 1164) выявляли в тканях мозга, а в легких они отсутствовали. Клетки культур гриба 4-х штаммов (РКПГУ-719, 856, 1091 и 1171) в тканях легких и мозга инфицированных мышей не обнаружили.
В группе сильновирулентных штаммов клетки 7-ми штаммов (РКПГУ-1090, 1093, 1095, 1096, 1106, 1180, 1181) наблюдали в тканях легких и мозга, тогда как остальных 4-х (РКПГУ-1085, 1088,1089,1113) - только в тканях мозга. Клетки 2-х из средневирулентных штаммов (РКПГУ - 1067 и 1176) отмечали в тканях легких и мозга, 2-х (РКПГУ- 852, 1164) - только мозга и 1-го (РКПГУ-1091) - не были выявлены в этих органах. Клетки слабовирулентных штаммов (РКПГУ-881 и 1178) определяли в тканях легких и мозга, РКПГУ-853 - только в тканях мозга, а РКПГУ-719, 856 и 1171 - в анализируемых органах не найдены.
Иными словами, мы не обнаружили взаимосвязи между встречаемостью клеток гриба в том или ином типе органа мышей и степенью вирулентности штаммов. При сравнении толщины стенки зрелых клеток гриба установлено, что она была разной в зависимости от типа органа мышей. Так, в тканях легких зрелые клетки гриба имели значительно более толстые стенки, чем в тканях мозга. Наиболее сильно (в 4,6 раза) эти различия были очевидны для зрелых клеток сильновирулентного штамма РКПГУ-1093, а наиболее слабо (1,3 раза) - для таковых слабовирулентного -РКПГУ-1178. По толщине стенки клеток, инфицирующих ткани легких, анализируемые штаммы разделили на три группы. В первую группу включили только один штамм - РКПГУ-1093, клетки которого характеризовались наличием самых толстых клеточных стенок (0,60 мкм). Вторую группу составили шесть штаммов (РКПГУ-1067, 1096, 1106, 1176, 1180 и 1181), зрелые клетки которых имели стенки, толщина которых варьировала в пределах 0,30-0,46 мкм (разница - 0,16). В третью группу вошли 4 штамма (РКПГУ-881, 1090, 1095 и 1178), у клеток которых толщина стенок находилась в пределах от 0,12 до 0, 24 мкм (разница - 0,1).
При анализе взаимосвязи толщины стенки зрелых клеток и степени вирулентности штаммов показано, что в группе сильновирулентных штаммов толщина клеточной стенки колебалась в пределах от 0,10 до 0,18 мкм (разница - 0,08), средневирулентных - 0,10-0,14 (разница - 0,04), а слабовирулентных - 0,09-0,12 мкм (разница - 0,03). В группе сильновирулентных штаммов пределы варьирования значений толщины клеточной стенки были самыми высокими, слабовирулентных - самыми низкими. Группа средневирулентных штаммов по этому показателю занимала промежуточ-
Рис. 1. Ультраструктура клеточных стенок и капсулы первого (а, б - шт. 1067, 1113), второго (в, г - шт. 719, 1063, 1091, 1095, 1180), третьего (д, е - шт. 1088, 1093, 1176) и четвертого (ж, з - шт. 1085,1166,1175,1178) типов у зрелых клеток C. neoformans, выращенных in vitro. а, в, д, ж - схемы; б, г, е, з - электронограммы (ув.: х 60000). Условные обозначения здесь и на Рис. 2: I -клеточная стенка, II- капсула. Мф - микрофибриллы первого порядка, ЭГ - электронно-плотная глыбка. Стрелкой показана
микрофибрилла первого порядка.
Рис. 2. Ультраструктура клеточных стенок и четыре типа строения капсулы зрелых клеток С. neoformans в тканях легких и мозга мышей через семь суток после начала эксперимента: а, б - 5-ый тип (шт. 1095, 1178); в, г - 6-ой тип (шт. 852, 1088, 1089, 1096, 1106, 1113, 1176); д-з -7-ой тип (шт. 881, 1067, 1090); и, к - 8-ой тип (шт. 853, 1093, 1085, 1164, 1180, 1181). а, в, д, ж, и - схемы; б, г, е, з, к - электронограммы (ув.: б, к - х10000, г - х37000; е, з - х12000). Стрелками показаны
микрофибриллы второго порядка.
ное положение.
По особенностям тонкого строения клеточных стенок исследованные штаммы, культуры которых вызывали поражение тканей легких и/или мозга мышей, разделили на три группы: с однослойными, темными, гомогенными (РКПГУ- 881, 1067, 1088, 1089, 1090, 1093, 1095, 1113, 1164, 1176 и 1180); с однослойными, умеренной электронной плотности, со слаборазличимыми микрофибриллами (РКПГУ-853, 1085, 1096, 1178 и 1181) и многослойными, умеренной электронной плотности, с хорошо различимыми микрофибриллами, перемежающимися со светлыми ламеллами (РКПГУ-852, 1090 и 1106). Отметим, что особенности ультраструктуры клеточных стенок дрожжевых клеток криптокок-ка были идентичны при инфицировании ими тканей легких и мозга мышей.
У зрелых клеток гриба, локализующихся в тканях мышей, через семь дней после начала эксперимента выявили 4 типа (5-ый, 6-ой, 7-ой, 8-ой, Рис. 2) тонкого строения полисахаридной капсулы. По нашим наблюдениям, тип строения полисахаридной капсулы зрелых клеток гриба был идентичен для зрелых клеток гриба одного штамма вне зависимости от того, какой тип органа (легкие или мозг) он поражал.
У двух штаммов (РКПГУ-1095 - сильная вирулентность и 1178 - слабая вирулентность), клетки которых имели 5-ый тип строения капсулы, в составе по-лисахаридной капсулы были четко различимы 3 слоя (Рис. 2 а, б). В светлом матриксе первого слоя выявляли четкую сеть из радиально ориентирующихся темных микрофибрилл. Верхняя граница слоя имела слабоволнистый контур, а нижняя - повторяла контур клеточной стенки. В стенках клеток всех 4-х штаммов толщина первого слоя полисахаридной капсулы была выше в клетках гриба, локализованных в тканях легких, нежели мозга. Зрелые клетки штамма РКПГУ-1178 занимали промежуточное положение по толщине первого слоя их стенок. Второй слой полисахаридной капсулы был гомогенный и темный. Нижняя граница этого слоя повторяла наружный контур первого слоя, а верхний - также имел слегка волнистые очертания. Толщина второго слоя была больше у клеток гриба, расположенных в тканях легких, чем мозга. В тканях легких она была наибольшей (0,69 мкм) у стенок клеток штамма РКПГУ-1095 и наименьшей (0,16 мкм) - у РКПГУ-1178. Соответственно, у клеток криптококка, расположенных в тканях мозга, толщина второго слоя стенок была наибольшей (0,56 мкм) у клеток штамма 1095, а наименьшей (0,12 мкм) - у штамма 1178. Отметим, что значения и пределы варьирования толщины стенки были выше у таковых, поражающих ткани легких (0,12-0,35 мкм), нежели мозга (0,09-0,11 мкм). У 3-х из 4-х штаммов этой группы была очевидна следующая тенденция: толщина 1-го слоя полисахаридной капсулы находилась в прямой зависимости от толщины второго слоя. Исключение составляли только по-лисахаридные капсулы клеток штамма РКПГУ-1095, в которых толщина 2-го слоя превышала таковую 1-го слоя в 3 раза у зрелых клеток гриба, инфицирующих ткани легких, и в 4,6 раза - мозга. В светлом матриксе третьего, завершающего слоя капсулы наблюдали умеренно развитую сеть микрофибрилл первого порядка, имеющих в нижней трети крупно-ячеистую морфологию и радиальную - в остальной части. Такие микро-
фибриллы имели довольно большую протяженность - пронизывали всю толщу последнего слоя капсулы. От наружной поверхности второго слоя отходили толстые конусообразные выросты второго слоя - микрофибриллы второго порядка (Рис. 2 а, стрелка), число которых варьировало от 3-х до 7-ми в пересчете на медианный срез дрожжевой клетки. Очевидно, что за зоной локализации микрофибрилл первого и второго порядка завершаются и границы собственно капсул зрелых клеток С. neoformans.
6-ой тип строения полисахаридной капсулы был характерен для зрелых клеток 7-ми штаммов C. neoformans с разной вирулентностью (РКПГУ- 1106, 1113, 1088, 1089 и 1096 - сильной, РКПГУ-852 и 1176 -средней вирулентности). В строении полисахаридной капсулы зрелых клеток этих штаммов различали два слоя (Рис. 2 в, г). Первый слой - светлый, содержащий умеренно развитую сеть радиально ориентирующихся микрофибрилл. На примере полисахаридной капсулы клеток культур 3-х штаммов (РКПГУ-1096, 1106, 1176) этой группы (клетки остальных 4-х выявляли только в тканях мозга), очевидно, что толщина 1-го слоя несколько выше в капсулах клеток, инфицирующих ткани легких, нежели мозга. В тканях легких этот слой имел наибольшую толщину (0,25 мкм) в капсулах зрелых клеток гриба штамма РКПГУ-1176, а наименьшую (0,15 мкм) - РКПГУ-1096. В тканях мозга первый слой капсулы имел наибольшую толщину у зрелых дрожжевых клеток штамма РКПГУ-1176, а наименьшую - у РКПГУ-1113. Второй слой в составе капсулы отсутствовал. В светлом матриксе третьего слоя капсулы отмечали хорошо развитую сеть слабоизвилистых коротких микрофибрилл, которые в ее нижней половине были расположены наиболее плотно. Микрофибриллы полисахаридной капсулы формировали мелкоячеистый рисунок. В целом наибольшая плотность расположения микрофибрилл была типична для капсул клеток гриба штаммов РКПГУ-852, 1096 и 1113, тогда как средняя - для штаммов РКПГУ-1088 и 1106, а слабая - для РКПГУ-1089 и 1166. Отметим, что плотность расположения микрофибрилл и формируемый ими рисунок в полисахаридной капсуле клеток гриба одного штамма находился вне зависимости от органа (легкие, мозг), которые они инфицировали.
7-ой тип строения полисахаридной капсулы отмечали для зрелых клеток штаммов различной вирулентности (РКПГУ-881 - слабая, 1067 - средняя, 1090 - сильная). В составе полисахаридной капсулы их клеток первый и второй слои отсутствовали (Рис. 2 д-з). Четвертый слой был составлен из темных, густо расположенных, коротких и сильноизвилистых микрофибрилл первого порядка, непосредственно прикрепленных к клеточной стенке. Плотность расположения таких микрофибрилл снижалась по мере удаления от клеточной стенки. Специфической морфологической особенностью строения полисаха-ридной капсулы этого типа являлось то, что мелкие микрофибриллы в верхней половине (РКПГУ-881) и трети ее (РКПГУ-1067, 1090) перемежались с более толстыми микрофибриллами 2-го порядка. Последние имели строго радиальную ориентацию в полисаха-ридных капсулах зрелых клеток криптококка штамма РКПГУ-881(Рис. 2 д, е) и форму полудуг у аналогичных штаммов РКПГУ-1067 и 1090 (Рис. 2 ж, з). Присутствие
крупных фибрилл в форме полудуг в полисахаридных капсулах клеток двух последних штаммов придавало им своеобразный «фестончатый вид».
8-ой тип строения полисахаридной капсулы был выявлен у зрелых клеток 6-ти штаммов разной вирулентности (РКПГУ-1085,1093,1180 и 1181 - сильная, 1164 - средняя и 853 - слабая вирулентность). Особенностью строения капсулы этого типа было отсутствие первого и второго слоев (Рис. 2 и, к). Третий слой капсулы включал в себя хорошо развитые микрофибриллы, плотность расположения которых уменьшалась по мере удаления от клеточной стенки. Тем не менее, в целом, плотность расположения микрофибрилл этого слоя была наибольшей в капсулах зрелых клеток штаммов РКПГУ-1093, 1180, средней плотности -РКПГУ-853, 1181 и наименьшей - РКПГУ-1085, 1164.
Для понимания того, каким образом изменяется строение полисахаридной капсулы в ходе инфицирования культурами гриба разных штаммов, по сравнению с таковой in vitro, мы составили сводную таблицу, из которой очевидно, что 1-ый тип строения капсулы зрелых клеток гриба, характерный для штамма РКПГУ-1067, выращенного в культуре, через семь дней после инфицирования крови мышей в тканях легких и мозга клеток штамма 1067 изменялся на 7-ой, а 1113 -на 6-ой тип.
Таблица
Типы строения полисахаридной капсулы зрелых дрожжевых клеток C. neoformans in vitro и в тканях легких и мозга при экспериментальном моделировании криптококкоза
через семь суток после начала эксперимента
Номер штамма In vitro 7 суток после инфицирования
(РКПГУ) Мозг Легкие
1067 1 7 7
1113 1 6 6
719 2
1063 2
1091 2
1095 2 5 5
1180 2 8 8
1093 3 8 8
1088 3 6 6
1176 3 6 6
1085 4 8 8
1178 4 5 5
1166 4
1175 4
852 6 6
1089 6 6
1096 6 6
1106 6 6
881 7 7
1090 7 7
853 8 8
1164 8 8
1181 8 8
Характерный для полисахаридной капсулы зрелых клеток культур гриба 3-х штаммов 1095 и 1180 второй тип строения в условиях эксперимента через 7 дней после инфицирования крови мышей в тканях легких и мозга у клеток первого штамма изменялся на 5-ый тип, у второго - на 8-ой тип. Типичный для полисахаридных капсул зрелых клеток C. neoformans штаммов
РКПГУ-1093, 1088 и 1176 3-ий тип строения в условиях эксперимента изменялся на 8-ой (РКПГУ-1093) и 6-ой (РКПГУ-1088,1176). Капсулы 4-го типа строения зрелых клеток штаммов РКПГУ-1085 и 1178 через семь дней после инфицирования их культурами крови мышей менялись на 8-ой (РКПГУ-1085) и 5-ый (РКПГУ-1178) типы в тканях легких и мозга. В эти же сроки после начала инфекции клетки C. neoformans штаммов РКПГУ-852, 1089, 1096 и 1106 в тканях легких и мозга формировали капсулы 6-го типа, тогда как штаммов РКПГУ-881,1090 и 853, 1164,1181, соответственно, 7-го и 8-го типов.
Способность С. moformans формировать капсулы представляет собой генетически закрепленный признак. Под электронным микроскопом просвечивающего типа капсулу легко идентифицировать ввиду ее значительной толщины, низкой электронной плотности и часто наличия хорошо развитой системы микрофибрилл. При изучении препаратов для целей электронной микроскопии показано, что сохранность капсулы лучше у клеток, локализующихся в легких, чем в суспензии, взятой из культур, выращенных in vitro [6]. Структура полисахаридной капсулы дрожжевых клеток криптококка намного лучше сохраняется при использовании обычных методов химической фиксации [7], а не замещения-замораживания, дающего лучшие результаты при изучении их содержимого [8].
Капсулы зрелых клеток изученных штаммов С. moformans, выращенных in vitro, можно разделить по строению на 4 типа, различающихся по количеству слоев, их толщине и особенностям морфологии. Тем не менее, и эти 4 формы не были неизменными - возможны отклонения в ультраструктуре капсулы и даже уменьшение числа слоев в них, о чем свидетельствуют проведенные нами исследования их архитектоники in vivo в тканях мозга и легких мышей. В последнем случае нам удалось также выявить 4 типа строения поли-сахаридной капсулы, однако совершенно другой ультраструктуры. Показано, что in vivo в полисахаридных капсулах зрелых клеток гриба может формироваться более или менее густая сеть их макро- и микрофибрилл, возрастать или уменьшаться их электронная плотность, изменяться число слоев и их толщина. Обращает на себя внимание полиморфизм и подвижность слоев в капсульном полисахариде у криптококка при отсутствии какой-либо строгой зависимости от вирулентности штаммов. Тип строения полисахарид-ной капсулы зрелых клеток гриба был идентичен для особей одного штамма вне зависимости от типа поражаемого органа (легкие или мозг мышей). Главное, обнаруженное нами при изучении ультраструктуры полисахаридной капсулы С. moformans, то, что инвазия ткани легких и мозга мышей криптококками сопровождалась изменением в структуре их полисахаридной капсулы, в сравнении с клетками, полученными in vitro. Эти изменения вариабельности толщины и строения уже имеющихся слоев в капсуле, появление новых или исчезновение некоторых из ранее присутствовавших в условиях культуры служат подтверждением своеобразия тканевых форм, пластичности их ультраструктурной организации и, наконец, принципиальных отличий капсул тканевых клеток С. moformans от аналогичных в культуре in vitro. В литературе имеются данные, что увеличение толщины капсулы тканевых
форм связано с усилением митохондриальной активности [9], которая характерна для дрожжевых клеток сильновирулентных штаммов [2]. По нашим данным, клетки гриба в условиях in vitro имели однообразное строение стенок вне зависимости от штаммовой принадлежности, по сравнению с аналогичными в условиях in vivo. О прогрессивном возрастании толщины клеточной стенки с течением легочной инфекции во времени (от 2 часов до 28 дней) сообщали и другие исследователи [10].
Изменения в толщине клеточной стенки, обнаруженные в ходе экспериментальной инфекции, мы связываем с увеличением размеров дрожжевой клетки. На основании вышесказанного можно заключить, что строение полисахаридной капсулы тканевых форм криптококка in vivo принципиально отличалось от таковой in vitro. Очевидно, что возникновение феноти-пических вариантов криптококков в макроорганизме
непосредственно связано с патогенезом криптокок-коза, и, следовательно, необходимо изучать не только ответные защитные реакции макроорганизма, но и обязательно учитывать морфофунк-циональные характеристики тканевых форм гриба.
ВЫВОДЫ
1. Зрелые дрожжевые клетки исследованных штаммов C. neoformans in vitro и in vivo различаются по толщине и строению клеточной стенки и полисахаридной капсулы и не связаны со степенью их вирулентности.
2. Ультраструктура полисахаридной капсулы зрелых клеток C. neoformans подвергается динамическим изменениям при смене условий in vitro^in vivo.
ПРИМЕЧАНИЕ
Памяти нашего учителя профессора Николая Петровича Елинова посвящается.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bose I., Reese A. J., Ory J. J., Janbon G. A yeast under cover: the capsule of Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell. 2003; 2 (4): 655-663.
2. Васильева Н.В., Степанова А.А., Синицкая И.А. Особенности морфогенеза клеток Cryptococcus neoformans в зависимости от вирулентности штаммов. Проблемы медицинской микологии. 2007; 9 (4): 23-30. [Vasileva N.V., Stepanova A.A., Sinitskaya I.A. Osobennosti morfogeneza kletok Cryptococcus neoformans v zavisimosti ot virulentnosti shtammov. Problemyi meditsinskoy mikologii. 2007; 9 (4): 23-30 (In Russ)].
3. Stepanova A.A., Vasilyeva N.V., Yamaguchi M., et al. Electron microscopy of autopsy material from the human brain cryptococcosis and AIDS. Problems in medical mycology. 2015; 17 (1): 35-40.
4. Stepanova A.A., Vasilyeva N.V., Yamaguchi M., et al. Ultrastructural investigations of the yeast^hyphal cell switching of the Cryptococcus neoformans var. grubii in murine brain. Problems in medical mycology. 2017; 19 (2): 19-24.
5. Stepanova A., Vasilyeva N.V., Yamaguchi M. Cellular pattern of morphogenesis, ultrastructure of senescent and dessicated in vitro growing yeast cells of Cryptococcus neoformans. Problems in medical mycology. 2016; 18 (4): 47-51.
6. Feldmesser M., Kress Y., Novikoff P., Casadevall A. Cryptococcus neoformans: is a facultative intracellular pathogen in murine pulmonary infection. Infect. Immun. 2000; 68 (7): 4225-4237.
7. Kopeckä M., Yamaguchi M., Gabriel M., et al. Morphological transitions during the cell division cycle of Cryptococcus neoformans as revealed by transmission electron microscopy of ultrathin sections and freeze-substitution. Scripta medica (Brno). 2000; 73 (6): 369-380.
8. Yamaguchi M., Ohkusu M., Sameshima M., Kawamoto S. Safe specimen preparation for electron microscopy of pathogenic fungi by freeze-substitution after glutaraldehyde fixation. Jpn. J. Med. Mycol. 2005; 46: 187-192.
9. Trevigano- Contador N.T., Rossi S.A., Alves E., et al. Capsule enlargement in Cryptococcus neoformans is dependent on mitochondrial activity. Fronties in Microbiology. 2017; 8: 1423.Feldmesser A. M., Kress Y.,
10. Casadevall A. Dynamic changes in the morphology of Cryptococcus neoformans during murine pulmonary infection. Microbiology. 2001; 147 (8): 2355-2365.
Поступила в редакцию журнала: 09.01.2018
Рецензент: Т.С. Богомолова
