CC BY
12УДК 616.992
АНАЛИЗ ДНК В ГЕНОМЕ CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS ИЗОЛЯТОВ ОТ БОЛЬНЫХ МЕТОДАМИ ПЦР'ОТПЕЧАТКОВ И РАПДФ
В.Мейер1, Н.В. Васильева2, Н.П.Блинов2, Е.А.Тилева2, Т.С. Богомолова2
1 —Лаборатория молекулярной микологии центра инфекционных заболеваний Сиднейского университета, Австралия
2 — НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования, Россия
© Коллектив авторов, 2003
В работе исследовано генетическое родство 17 клинических изолятов Cryptococcus neoformans в России. С помощью методов ПЦР-отпечатков и РАПДФ (случайно амплифицированных ДНК-фрагментов) изоляты подразделили на три молекулярных типа: VN I, VN III, VNIV — (var. neoformans I, III и IV соответственно). Большинство изолятов -11 штаммов отнесены к типу VN I, и по три штамма — к молекулярным типам VNIII и VNIV.
Ключевые слова: Cryptococcus neoformans, ДНК, ПЦР-отпечатки, РАПДФ
ВВЕДЕНИЕ
СгурШсоссш пео/огтат — оппортунистический патоген, вызывающий криптококкоз у чувствительных лиц, один из основных маркерных возбудителей у пациентов, инфицированных ВИЧ, прежде всего в развивающихся странах [1,2]. Так же известно, что криптококкоз может развиваться у иммуно-компетентных лиц [3]. Возбудитель криптококкоза
— диморфный базидиомицетовый гриб, к основным факторам патогенности которого в настоящее время относят продукцию меланина, капсульных полисахаридов, а также тип спаривания и некоторые экзоферменты.
В зависимости от структуры глюкуроноксило-маннана, основного полисахарида капсулы, выделено 5 серотипов С. пео/огтат: А и А1), присущие штаммам С. пео/огтат уаг. grubii, серотип Б, присущий С. пео/огтат уаг. пео/огтат, обычно встречающиеся в тропических и субтропических регионах штаммы С. пео/огтат уаг. gattii с серотипами В и С. В этой связи интересна работа [4].
Тем не менее, один из нас (Н.П. Блинов), выдвинул гипотезу о защитной роли криптококкового полисахарида в аспекте общебиологического про-тективного значения гликанов [5].
С. пео/огтат уаг. пео/огтат ранее был выделен в Дании, Франции и Италии, в отличие от С. пео/огтат уаг. grubii, который встречается повсеместно. Выявлены биохимические различия между вариантами, а также особенности течения заболевания в зависимости от варианта возбудителя. Установлено, что в организм С. пео/огтат попадает через легкие, а затем гематогенно проникает в ЦНС.
До введения высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) у 8-10% пациентов с ВИЧ-инфекцией развивался криптококкоз, после введения ВААРТ этот показатель несколько снизился. Тем не менее, криптококковую инфекцию до сих пор считают СПИД-маркерным заболеванием.
Систематические молекулярные исследования дрожжевых организмов проведены и проводятся в настоящее время исследователями в разных учреждениях, включая и одного из авторов этой статьи (В.Мейер) [6-9]. Данные молекулярных исследований дополняют результаты исследований по эпидемиологии криптококкоза и экологии возбудителя, выполненных классическими методами. Научными коллективами в Австралии, США, Японии и других стран проведены эпидемиологические и таксономические исследования с использованием методов КБ1 ,Р, КАР!) (РАПДФ), ДНК и ПЦР-отпечатков (1)ЫА, Р( !К-Ппдегрпп1тд) [10-12].
Эти данные помогают выявить различия между штаммами. Было установлено, что молекулярные типы С. пео/огтат, выявленные с помощью этих методов, коррелируют с некоторыми серотипами С. пео/огтат. Так, типы УЫ I УЫ II соответствуют серотипу А, тип УЫ III — серотипу А1) и тип УКМУ
— серотипу Б.
Figure 1. PCR fingerprinting with the primer M13
Bp
2036-
1636-
1018-
506/517-
397-
Bp
1636-
1018
506/517-
397-
220-
134-
75-
Figure 2. RFLP analysis of the URA5 gene Hha\ISau96
П ml 1НЫЕ : ,И Е : I
Вр
2036-
1636-
1018-
506/517-
397-
Вр
1636-
1018-
506/517-
397-
220-
134-
75-
Рис. 2. РАПДФ-анализ URA-гена с использованием рестриктаз HhaUSau96
В России Ю.А. Любимов [13] и И.Е. Колуканов [14] исследовали морфобиологические характеристики и вирулентность штаммов С. neoformans из коллекций Санкт-Петербурга (Ленинграда). Большой цикл научных исследований криптококковых полисахаридов был проведен учениками профессора
Н.П. Блинова в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии (Ленинградский химикофармацевтический институт) [15-20]. Постоянные исследования морфологических, биохимических и патогенных свойств криптококков, изолированных от пациентов, ведутся в НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина с 1998 г. Первый случай криптококкоза был выявлен в Санкт-Петербурге в 1989 г. у ВИЧ-инфицированной пациентки О.Б. За период с 1990 по 2002 г. сотрудниками НИИ медицинской микологии было выявлено 18 случаев криптококкоза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы штаммы С. neoformans, в основном выделенные от пациентов в Санкт-Петербурге (Таблица 1). Все штаммы были идентифицированы в соответствии со стандартными морфологическими и биохимическими тестами [21]. Для девяти штаммов С. neoformans были проведены исследования вирулентности на модели экспериментального криптококкоза у белых мышей при внутривенном введении патогена [14].
Таблица 1.
Штаммы С. neoformans, использованные в настоящем исследовании
Коллекционный номер штамма С. neoformans Шифр штамма в генетических исследованиях Год изо- ляции Клинические данные
Инициалы, поли возраст Фактор риска и окончательный диагноз
ВКПГУ-719 1 1989 Пациентка Г. СПИД, криптококковый менингит
ВКПГУ-1063 2 1995 Пациентка С., 43 ?
ВКПГУ-1067 3 1995 Пациент И., 46 СПИД, криптококковый менингит
ВКПГУ-1085 4 1994 Пациентка К. ?
ВКПГУ-1088 5 1995 Пациент С., 42 СПИД, диссеминированный криптококкоз
ВКПГУ-1091 6 1995 Пациент С., 42 СПИД, диссеминированный криптококкоз
ВКПГУ-1093 7 1996 Пациент В. спид, криптококкоз
ВКПГУ-1095 8 1997 Пациент Н., 38 спид, диссеминированный криптококкоз, менингит
ВКПГУ-1105 9 1997 Пациент Н.Т.П., 38 спид, криптококковый менингит
ВКПГУ-1113 10 1997 Пациент Г. спид,
ВКПГУ-1166 11 1998 Пациентка X., 42 криптококкома среднего мозга
ВКПГУ-1165 12 1998 Пациент Б. ВИЧ СПИД, криптококкоз, диссеминированный кандидоз
ВКПГУ-1164 13 1998 Пациент Я., 40 СПИД, трансплантация почки, острый серозный менингит
ВКПГУ-1175 14 1999 Пациент А. СПИД
ВКПГУ-1176 15 2001 Пациентка М., 77 лимфолейкоз
ВКПГУ-1178 16 2001 Пациентка Д., 20 Трансплантация почки
ВКПГУ-1180 17 2001 Пациент М. СПИД
По договоренности с доктором В. Мейером (Австралия), штаммы С. neoformans из России были исследованы в его лаборатории методами III (Р с праймером М13 и RI Л-'Р гена с использованием рес-триктаз Hhal и Sau96 в соответствии с методиками, описанными ранее [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Морфологические характеристики указанных выше штаммов показаны в таблице 2, в которой приведены характеристики фенолоксидазной активности, продукции полисахаридов и серотипа. Данные анализа ПЦР-отпечатков (PCR-fingerprinting) и анализа длин рестрикционых полиморфных ДНК URA 5 гена Hhal/Sau96 (RI I ,Р) приведены на рисунках 1 и 2.
Таблица 2.
Морфобиологические характеристики штаммов С. neoformans
Штамм Активность фенолоксидазы Продукция полисахаридов Серотип
ВКПГУ-719 ++ +++ D
ВКПГУ-1063 - +++ D
ВКПГУ-1067 - ++ D
ВКПГУ-1085 ++ + А
ВКПГУ-1088 +++ ++ А
ВКПГУ-1091 +++ + А
ВКПГУ-1093 ++ ++ А
ВКПГУ-1095 ++ ++ А
ВКПГУ-1105 ++ + А
ВКПГУ-1113 +++ +++ AD
ВКПГУ-1164 ++ +++ А
ВКПГУ-1165 +++ + А
ВКПГУ-1166 +++ ++ А
ВКПГУ-1175 ++ +++ А
ВКПГУ-1176 ++ + AD
ВКПГУ-1178 + + AD
ВКПГУ-1180 ++ +++ А
Примечание: активность фенолоксидазы оценивали по продукции пигмента на среде с дофамином: «-» нет, практически отсутствует, — «+» слабая, «++»-умеренная, «+ ++» — высокая; активность продукции капсульных полисахаридов проводили на плотном агаре Сабуро with glucose.
Таблица 3.
Результаты анализа 17 штаммов С. neoformans в ПЦР с праймером М13 и определения рестриктов гена URA5 с помощью рестриктаз Hhal и Sau96
Штамм Молекулярный тип VN Изменения URA5 гена
ВКПГУ-719 VNIV мутация
ВКПГУ-1063 VNIV Не выявлены
ВКПГУ-1067 VNIV Не выявлены
ВКПГУ-1085 VNI Не выявлены
ВКПГУ-1088 VNI Не выявлены
ВКПГУ-1091 VNI Не выявлены
ВКПГУ-1093 VNI Не выявлены
ВКПГУ-1095 VNI Не выявлены
ВКПГУ-1105 VNI Не выявлены
ВКПГУ-1113 VNIII Выявлен образец с 7 рестриктами
ВКПГУ-1164 VNI Не выявлены
ВКПГУ-1165 VNI Не выявлены
Штаммы С. neoformans серотипа D, относительно редко выделяемые в мире, за исключением некоторых регионов Европы, выделены у трех российских пациентов.
2. Штаммы С. neoformans серотипа D, с молекулярно-биологическим типом VN IV, относительно редко выделяемые в мире, за исключением некоторых регионов Европы, выделены у трех пациентов в Санкт-Петербурге.
См. ангийский текст.
ЛИТЕРАТУРА
1 Casadevall A., Perfect J. Cryptococcus neoformans. American Society of Microbiology. Washington D.C., 1998.
2. Pappas P.G. New approaches to therapy for cryptococcosis// 5th Internat. Confer. Cryptococcus and Cryptococcosis, 3d-7th
March, 2002, Adelaida, Australia, 2002. — P.47-48.
3. Chen S.C. Where are molecular techniques going to impact on clinical medicine in cryptococcosis// 5th Internat. Confer. Cryp-
tococcus and Cryptococcosis, 3d-7th March, 2002, Adelaida, Australia, 2002. -P.77-79.
4. Kidd S.E., Sorrell T.C. and Meyer W. Isolation of two Types of Cryptococcus neoformans var. gattii from Insect Frass// Medical
Mycology.- 2003,- Vol. 41, № 2,- P.171-176.
5. Yelinov NP. Premises to generalization of biological functions of the natural polysaccharides. Materials of Scientific Conference
dedicated to results of research work in Leningrad Chemico-Pharmaceutical Institute for 1970 year. — L., 1971.- P. 5-7.
6. Meyer W. and Mitchell T.G. PCR fingerprinting to distinguish species and strains of yeast/ In: Molecular Biology of Pathogenic
Fungi: A Laboratory Manual; (eds) Maresca B. and Kobayashi G.S.- New York: Telos Press.- P. 293-302.
7. Lodge J.K., KarterD., Dietrich F., etal. Update on Cryptococcus neoformans genome project // 5th Internat. Confer. Cryptococcus
and Cryptococcosis, 3d-7th March, 2002, Adelaida, Australia, 2002,- P. 47-48.
8. Meyer W., Kidd S., Kronstad/., Marro М., et al. Cryptococcus neoformans var. gattii (serotype B) — Comparative Genomics // 5th
Internat. Confer. Cryptococcus and Cryptococcosis, 3d-7th March, 2002, Adelaida, Australia, 2002.- P. 37.
9. Meyer W. Cryptococcus neoformans. A case for on going speciation ISHAM // The 15th Congress of the Internat. Soc. for Human
and Animal Mycology May 25-29, 2003. San Antonio. Texas. Mariott Revercenter. Abastracts.- P. 165-166.
10. Mitchell T.G., Perfect J.R. Cryptococcosis in the era of AIDS// Clin, microbiol.- 1995.- Rev. 8.- P. 515-548.
11. Mitchell T.G., etal. Unique oligonucleotide primers in PCR for identification of Cryptococcus neoformans //J.Clin. Microbiol.-1994,- P.253-255.
12. S.E.Kidd, W.Meyer, et all. Molecular epidemiology of clinical and environmental isolates of Cryptococcus neoformans from Tamil Nadu, India//Australian Micologist.- 2001.- Vol. 20, №2.- P. 105-114.
13. Lyubimov Iu. A. Peculiarities of pathogenic and non pathogenic Cryptococci in the pathogenetically painful organism. Thesis.
— L. 1974.
14. Kolukanov I. Ye. Cryptococcosis. The lecture for physicians. — LSIPS. — 1968.
15. IozepA.A. Polysaccharides of some microorganisms from Sporobolomyces and Cryptococcus geni. Thesis.- L., 1974.
16. Vitovskaya G.A. The Yeast Polysaccharides of Rhodotorula and Cryptococcus geni. Thesis for PhD. — Kiev, 1979.
17. Abelian V.A. Investigations of polysaccharides produced by some Cryptococcus spp. Thesis. — L., 1982.
18. Gurina S.V. The influence of yeast polysaccharides at some components of immune system in experiment. Thesis. — L., 1988.
19. Vasilyeva NV. The influence of cryptococcal polyuronide at macrophages. Thesis. — L., 1990.
20. Grigoryanz A.O. Peculiarities Cryptococcus luteolus (Saito) Skinner in a connection with a production of polysaccharides. Thesis.- St. Petersburg, 1996.
21. Thileva Ye.A. The Enzymatic and pathogenic characteristics of Cryptococci — isolated from patients and saprobionts. Thesis.-St. Petersburg, 1996.
ВКПГУ-1166 VNI Не выявлены
ВКПГУ-1175 VNI Не выявлены
ВКПГУ-1176 VNIII Выявлен образец с 6 рестриктами
ВКПГУ-1178 VNIII Выявлен образец с 6 рестриктами
ВКПГУ-1180 VNI Не выявлены
ВЫВОДЫ
1. От пациентов в России выделены штаммы: серотип А (молекулярный тип VNI) — 64% (11 штаммов), Б (молекулярный тип VNIV) — 17% (3 штамма) и А1) (молекулярный тип VNIII) — 17% (3 штамма).
DNA ANALYSIS IN THE GENOME IN CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS ISOLATED FROM PATIENTS IN RUSSIA BY PCR-FINGERPRINTING AND RAPDF METHODS
W. Meyer1, N.V. Vasilyeva2, N.P. Yelinov2, Ye.A. Thileva2, T.S. Bogomolova2
'Centre for Infectious Diseases and Microbiology, Molecular Mycology Laboratory, Westmead Hospital, Westmead, N.S.W., Australia
2Kashkin Research Institute of Medical Mycology, Saint Petersburg Medical Academy of Postgraduate Education, Russia
© Collective of authors, 2003
The genetic relationship of 17 C. neoformans clinical isolates in Saint Petersburg (Russia) have been investigated with the help of PCR-fingerprinting and RAPDF-methods. It was shown that isolates belong to three molecular types — VNI, VNIII and VNIV; the majority of them composed the type VNI
— 11 strains, three strains — the molecular types VNIII and VNIV each.
Key words: Cryptococcus neofomans, DNA, PCR-finger-printing, RAPDF
INTRODUCTION
C. neoformans — one of the basic pathogen of opportunistic mycoses at patients (prevalent — in the development countries), infected by HIV [1, 2]. Also it is known that cryptococcosis is able to develop and at immunocompetent people [3].
C. neoformans is dimorphic basidiomycetous fungus the major pathogenicity factors of which admit now the melanin production, capsular glycans, mating type and some exoenzymes. There are five C. neoformans serotypes picked out by reason of the glucuronoxylomannan chemical structure — main polysaccharide (glycan) in a capsule of C. neoformans. Serotypes A and AD applied to C. neoformans var. grubii strains, serotype D — to C. neoformans var. neoformans strains, serotypes B and C — to C. neoformans var. gattii strains which inhabit in tropical and sub-tropical regions as rule. In this connection is interest the publication [4].
Nevertheless one from us (N.P. Yelinov) else in 1970 spoken out the consideration about protective role of the cryptococcal polysaccharide in an aspect of the common-biological protective meaning of glycans [5].
C. neoformans var.neoformans have been discover earlier in Denmark, France and Italy where as C. neoformans var. grubii which is distributed everywhere. The biochemical distinctions between variants have been discovered and also clinical peculiarities of diseases depending on serovariant of the pathogen.
It was established that C. neoformans gets into macroorganism through lungs and then hematogenously will penetrate in a brain.
Before introduction of HAART at 8-10% of patients with HIV-infection was developed the cryptococcosis; this parameter has decreased a little after introduction HAART. Nevertheless cryptococcosis is considered until now as AIDS-marker disease.
Systematic molecular-biological investigations of yeast organisms have been conducted and are conducted in the present time in several institutions including investigators are at the head of one of us (W. Meyer) [6-9]. Results of such researched supplement results of a study of cryptococcosis epidemiology and ecology carried out by classical experimental methods. Some authors conducted epydemiological and taxonomic investigations in Australia, USA, Japan, India and oths.[10,11] using the methods of determination — RFLP, RAPD, DNA-and PCR-fingerprintings. These methods help to reveal distinctions between strains. It has been established that the molecular types of C. neoformans revealed with the help of these methods correlate with some known cryptococcal serotypes. So types VNI and VNII correspond to serotype A, types VNIII — serotype AD and type VNIV — to serotype D [12].
In Russia Iu.A. Lyubymov [13] and I.Ye. Kolukanov [14] researched the morphobiological characteristics and virulence of Cryptococcus neoformans strains from some collections in Saint Petersburg (former Leningrad). The great cycle of scientific works about cryptococcal polysaccharides have been conducted by Dr. Yelinov’s
pupils in Saint Petersburg State Chemico-Pharmaceu-tical Academy (former the Chemico-Pharmaceutical Institute in Leningrad) [15-20 and oths.]
Regular investigations of the morphophysyologi-cal, biochemical and other properties of Cryptococcus spp., isolated from patients were started since 1998 year in Kashlcin Research Institute of Medical Mycology (KRIMM, Russia). The first cryptococcosis case was registered in Saint Petersburg in 1989 year at HIV-infected patient O.G. and then for period 1990-2002 years were revealed 18 cases of cryptococcosis by collaborators of KRIMM.
MATERIALS AND METHODS
C. neoformans strain isolated from patients in Saint Petersburg mostly have been taken for research (Table 1). All strains were identified according to the standard morphological and biochemical tests [21]; additionally for nine strains have been determined the virulence in model of experimental cryptococcosis at white by i.v. injection of pathogens [21].
In accordance with Dr. W. Meyer (Australia) strains C. neoformans from Russia have been investigated in his laboratory by PCR method with primer M13 and RFLP URA5 gene, using Hhal and Sau96 restrictases according to techniques described earlier [12].
RESULTS AND DISCUSSION
Morphological characteristics of above named strains are given in table 2 in which show qualitative data about phenoloxydase activity, polysaccharide production and serotype.
Table 1.
Cryptococcus neoformans strains used in the study
ARCPFY-1165 12 1998 Masc., B.,42 AIDS, cryptococcosis, disseminated candidosis
ARCPFY -1164 13 1998 Masc.,YA.,40 Kidney's transplantation, sharp serous meningitis
ARCPFY-1175 14 1999 Masc., A. Cryptococcal meningitis
ARCPFY-1176 15 2001 Fem.,M., 77 Lympholeucosis
ARCPFY-1178 16 2001 Fem.,D., 20 Kidney's transplantation
ARCPFY-1180 17 2001 Masc., M. AIDS
* Patient from Moscow city (Russia)
Table 2.
Morphobiological characteristics of Cryptococcus neoformans strains
Strains Phenoloxydase activity Polysaccharide production Seroy type
ARCPFY-719 ++ +++ D
ARCPFY-1063 ± +++ D
ARCPFY-1067 ± ++ D
ARCPFY-1085 ++ + A
ARCPFY-1088 +++ ++ A
ARCPFY-1091 +++ + A
ARCPFY-1093 ++ ++ A
ARCPFY-1095 ++ ++ A
ARCPFY-1105 ++ + A
ARCPFY-1113 +++ +++ AD
ARCPFY-1164 ++ +++ A
ARCPFY-1165 +++ + A
ARCPFY-1166 +++ ++ A
ARCPFY-1175 ++ +++ A
ARCPFY-1176 ++ + AD
ARCPFY-1178 + + AD
ARCPFY-1180 ++ +++ A
Foot note: Phenoloxydase activity is estimated on production of a pigment in the medium with dophamine: «-» — negative, «±» — almost negative, «+» — weak, «++» — moderate, «+ ++» — high; the activity of a production of capsular polysaccharide tested on Sabouraud agar with glucose.
Table 3.
Results of PCR-analysis of 17 Cryptococcus neoformans strains with primer M13 and determination restricts URA5 gene, using Hhal and Sau96 restrictases
Lab No Current No Year of isolation Patients
Sex and age (years) Risk factor and final diagnosis
ARCPFY-719 1 1989 Fem., O.G. AIDS, cryptococal meningitis
ARCPFY-1063 2 1995 Fem.,S.,43 ?
ARCPFY-1067 3 1995 Masc., I.,46 AIDS, cryptococcal meningitis
ARCPFY-1085 4 1994 Fem.,K. ?
ARCPFY-1088 5 1995 Masc., S.A.I., 42 AIDS, disseminated cryptococcosis
ARCPFY-1091 6 1995 Masc., S.A.I., 42 AIDS, disseminated cryptococcosis
ARCPFY-1093 7 1996 Masc.,V. AIDS, cryptococcosis
ARCPFY-1095 8 1997 Masc., N.,38 AIDS, disseminated cryptococcosis, meningitis
ARCPFY-1105 9 1997 Masc. N.T.P., 38 AIDS, cryptococcal meningitis
ARCPFY-1113 10 1997 Masc., G AIDS
ARCPFY-1164 11 1998 Fem., H.,42' ?
Strains Molecular type var. neoformans (VN) Changes in the URA5 gene
ARCPFY-719 VNIV Mutation
ARCPFY-1063 VNIV Not revealed
ARCPFY-1067 VNIV Not revealed
ARCPFY-1085 VNI Not revealed
ARCPFY-1088 VNI Not revealed
ARCPFY-1091 VNI Not revealed
ARCPFY-1093 VNI Not revealed
ARCPFY-1095 VNI Not revealed
ARCPFY-1105 VNI Not revealed
ARCPFY-1113 VNIII Revealed 7 bands RFLP-pattern
ARCPFY-1164 VNI Not revealed
ARCPFY-1165 VNI Not revealed
ARCPFY-1166 VNI Not revealed
ARCPFY-1175 VNI Not revealed
ARCPFY-1176 VNIII Revealed 6 bands RFLP-pattern
ARCPFY-1178 VNIII Revealed 6 bands RFLP-pattern
ARCPFY-1180 VNI Not revealed
Data about PCR fingerprinting and RFLP analysis of the URA5 gene Hhal/Sau96 are leaded in Fig. 1 and 2.
CONCLUSIONS
1. Cryptococcus neoformans strains isolated from the patients in Russia (in Saint Petersburg mostly) belonging to serotypes A (molecular type VNI) — 64% (11 strains), D (molecular type VNIV) — 17% (3 strains) and AD (molecular type VNIII) — 17% (3 strain).
2. Cryptococcus neoformans strains serotype D with molecular type VNIV, concerning seldom picked out in the world, exepting of some European regions, are isolated from three patients in Russia.
References — see page 7.
