Особенности взаимодействия макрофагов с разными по вирулентности штаммами Cryptococcus neoformans Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.992

ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МАКРОФАГОВ С РАЗНЫМИ ПО ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММАМИ CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS

Филиппова Я.В. (науч. сотр.) *, ^чеваткина А.Е. (ст. науч. сотр.),

Фролова Е.В. (зав. лаб.), Васильева Н.В. (директор), 2Киселева Е.П. (вед. науч. сотр.)

'НИИ медицинской микологии им.П.Н. Кашкина ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава; 2НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

© Коллектив авторов, 2010

Изучены особенности фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов мышей в отношении разных по вирулентности штаммов Cryptococcus neoformans in vitro. Исследованы разные этапы взаимодействия макрофагов с криптококками - поглощение, индукция оксида азота (NО) и киллерная активность. Установлено, что интактные макрофаги фагоцитировали и разрушали клетки всех исследованных штаммов C.neoformans с различной интенсивностью вне зависимости от вирулентности и в низкой степени индуцировали продукцию N0. При опсониза-ции клеток гриба свежей мышиной сывороткой отмечали повышение фагоцитарной активности макрофагов при неизменной индукции N0 и незначительном усилении их киллерной активности. После предварительной стимуляции макрофагов липопо-лисахаридом (ЛПС) отмечали усиление продукции оксида азота и киллинга С. neoformans, что подтверждает важность роли N0 в разрушении криптококков.

Ключевые слова: вирулентность, киллинг, Cryptococcus neoformans, макрофаги, оксид азота, фагоцитоз

PECULIARITIES OF MACROPHAGES INTERACTION WITH DIFFERENT IN VIRULENCE OF CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS STRAINS

Filippova L.V. (scientific researcher), ^chevatkina A.E. (senior researcher), Frolova E.V. (head of the laboratory), Vasilyeva N.V. (director), 2Kiseleva E.P. (leading researcher)

* Контактное лицо: Филиппова Лариса Вячеславовна Тел.: (812) 303-51-40

’Kashkin Research Institute of Medical Mycology, SPb MAPS; 2Research Institute of Experimental Medicine RAMS, Saint Petersburg, Russia

© Collective of authors, 2010

The peculiarities of phagocytic activity of mice peritoneal macrophages with different in virulence of Cryptococcus neoformans strains in vitro have been studied. We have investigated the different phases of interaction of macrophages with Cryptococcus - uptake (ingestion), induction of nitric oxide (NO) and killer activity. Intact macrophages phagocytized and destroyed the cells of all investigated strains C.neoformans with varying intensity, regardless of virulence and a low degree of induced production of NO. When opsonization of fungus cells with fresh mouse serum indicated increased phagocytic activity of macrophages in the induction of NO and sustained a slight strengthening their killer activity. After the pre-stimulation of macrophages, lipopoly saccharide (LPS) notably increased production of nitric oxide and killing of C. neoformans, which confirms the importance of NO role in the destruction of Cryptococcus.

Key words: Cryptococcus neoformans, killing, macrophages, nitric oxide, phagocytosis, virulence

ВВЕДЕНИЕ

Cryptococcus neoformans - дрожжеподобный ба-зидиомицетовый гриб, являющийся причиной тяжелого менингоэнцефалита и диссеминированных инфекций, возникающих преимущественно у имму-нокомпрометированных лиц. Ранее было показано, что возможность инвазии тканей С. neoformans и характер течения криптококковой инфекции определяются не только степенью иммунодефицита макроорганизма, но и вирулентностью штамма [1].

Известно, что С. neoformans - факультативный внутриклеточный патоген, который может выживать внутри фагоцитирующих клеток и приводить к диссеминации инфекции. Со временем микроорганизмы выработали ряд механизмов, позволяющих им избегать фагоцитоза макрофагами. Особенности биологии возбудителя криптококкоза определяют, в известной степени, сложный характер взаимодействия макроорганизма и микромицета. Однако механизмы, обеспечивающие криптококкам уклонение от поглощения фагоцитирующими клетками и разрушения внутри фаголизосом клетки, остаются мало изученными [2].

Фагоцитированный макрофагами гриб может быть разрушен различными факторами микробоцид-ности: кислородзависимым (образование токсичных форм кислорода /02', Н202, ОН и др./ и выработка оксида азота) и кислороднезависимым (действие протеиназ и катионных белков) [3, 4]. В течение последних лет были накоплены данные о том, что доминирующая роль среди кислородзависимых факторов в разрушении грибов макрофагами отводится продукции NO. Однако до сих пор не существует единого мнения по этому вопросу [5, 6]. Кроме того, в научной литературе практически не отражены сведения об особенностях фагоцитоза в зависимости от вирулентности штаммов С. neoformans.

Цель настоящего исследования - изучение особенностей взаимодействия перитонеальных мышиных макрофагов со штаммами С. neoformans разной вирулентности in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали 12 штаммов криптококков из Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ) №№ 1106, 1178, 1165, 1090, 1216, 1262, 1272, 1257, 1271, 1276, 1175, 1164, выделенных от пациентов, больных криптококкозом. Культуры C. neoformans, после выращивания в течение 72 часов на скошенном агаре Сабуро с 4% глюкозой при 37 “С, отмывали в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида, и суспензию клеток доведили до концентрации 1 х 10'; кл/мл в среде RPMI-1640 («РАА», Австрия). Использовали окраску трипановым синим для оценки жизнеспособности грибов ( мертвые клетки окрашивались, живые - не поглощали красителя).

Экспериментальные исследования проведены на мышах - самцах линии Balb/c массой 18-20 г; определяли вирулентность штаммов С. neoformans на мышах, инфицированных внутривенно дозой 1х106 кл/ мл (по 0,5 мл взвеси на мышь). Время наблюдения -70 дней.

Макрофаги получали из перитонеальной полости мышей 8-12-недельного возраста. Концентрацию клеток доводили до 1х106 кл/мл в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и генгамицина. В эксперименте использовали интактные макрофаги и макрофаги, обработанные ЛПС (Е. coli 055:В5, Sigma), а также клетки С. neoformans, опсонизированные 10% мышиной сывороткой в течение 1 часа при 37 °С, и клетки С. neoformans без: опсонизации.

Для оценки поглотительной активности макрофагов их предварительно инкубировали в 4-луночных слайд-камерах (Chamber Slides, LabTek II) в течение 18 часов при 37 ° в СО2-инку0аторе (Sanyo) с 5% содержанием С02. Затем макрофаги отмывали и инкубировали с криптококками в соотношении 1:2. Через 2 часа клетки фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Фагоцитарный индекс (ФИ) определяли как отношение числа адгезированных и поглощенных криптококков к общему числу макрофагов.

Культуру С.neoformans добавляли к макрофагам в соотношении 10:1 для определения киллерной активности и продукции NO. Через 48 часов после инкубации при 37 ° в С02-инкубаторе с 5% содержанием С02 полученный супернатант переносили из лунок в стерильные 1,5 мл центрифужные пробирки и замораживали для последующего определения выработки NO. Продукцию NO оценивали спектрофотометрическим методом. Предварительно готовили серию стандартов (разведений NaN02) для построения калибровочной кривой. Полученный ранее супернатант размораживали и центрифугировали, затем 70 мкл каждого стандарта и образца вносили в 96-луночные планшеты, добавляли 70 мкл реактива Грисса в каждую лунку и инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Оценку спектра проводили при 540 нм с использованием ридера для микропланшет [7].

При оценке киллерной активности макрофагов, после удаления супернатанта, в каждую лунку вносили 100 мкл 0,02% раствора натрия додецил-сульфата; образовавшийся лизат пипеткой переносили в стерильные центрифужные пробирки. Затем лунки дополнительно отмывали 200 мкл стерильной Н20. Полученную смесь объемом 100 мкл в разведении 1:10 засевали на чашки Петри с агаром Сабуро с последующей инкубацией в термостате при 37 °С в течение 72 часов. Киллерную активность оценивали как процент жизнеспособных клеток грибов после инкубации с макрофагами по сравнению с контрольным ростом грибов без макрофагов.

Каждый эксперимент был выполнен не менее трех раз в трех повторностях. Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета прикладных программ ЗТАТКПСА (версия 6.0) для \Х|Гтс1ош8 с использованием модуля «Анализ выживаемости», параметрического метода Стьюдента (I) с определением средней арифметической величины (М) и ошибки средней (т), корреляционного анализа (г). Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сроки гибели экспериментальных животных после внутривенного заражения мышей разными штаммами С. пе/фтпапя варьировали в зависимости от вирулентности штаммов. В этой связи грибы условно разделили на две группы - сильновирулентные и слабовирулентные. Сильновирулентные штаммы С. пеофогтат (п =5) вызывали гибель 50% животных на 8-16 день (12,8± 1,46), а слабовирулентные (п =7) - на 27-65 день (46,85±5,84) после заражения. Достоверность различий по вирулентности между этими двумя группами была подтверждена 2-мерным анализом по всем парным критериям и многомерному хи-квадрат (р<0,001) (Рис.1). Эти результаты согласуются с раннее полученными нами данными и данными других исследователей о том, что штаммы С. пео^огтат различаются по вирулентности [1,6].

Дни наблюдения

60 70 80

1 — Слабо-

вирулентные

2 — Сильно -

вирулентные

Рис.1 Выживаемость мышей, инфицированных штаммами С. пео/огтат разной вирулентности (р<0,001).

При исследовании способности макрофагов к поглощению разных по вирулентности штаммов С. пео-/огтаж (Рис.2,А) установлено, что интактные макрофаги слабо фагоцитировали клетки всех исследованных штаммов грибов, что совпадает с данными других исследователей [8,9]. При опсонизации клеток грибов свежей мышиной сывороткой отмечали увеличение фагоцитарной активности макрофагов при сохранении зависимости от степени вирулентности криптококков. Это может быть обусловлено тем, что поверхность криптококков покрыта компонентами комплемента и антителами (СЗЬ, СЗЫ, 1дСт) и это, по-видимому, облегчает их поглощение фагоцитарными клетками [3,8]. Однако активация макрофагов АПС не приводила к достоверным изменениям их фагоцитарной активности по отношению ко всем исследованным штаммам.

На следующем этапе было проведено изучение способности макрофагов к продукции оксида азота после поглощения С. пео/огтаж. Установлено, что все штаммы грибов при взаимодействии с интактны-ми макрофагами слабо индуцировали продукцию оксида азота, что согласуется с литературными данными [10]. Опсонизация клеток грибов сывороткой не вызывала повышения выработки N0 (Рис. 2,Б). Это, по-видимому, связано с тем, что рецепторы компонентов комплемента не имеют цитоплазматической части и не могут передать сигнал для активации 1чЮ-синтетазы [3]. При оценке влияния разных по вирулентности штаммов на продукцию оксида азота макрофагами, предварительно стимулированными АПС, установили, что высоковирулентные штаммы достоверно снижали продукцию оксида азота макрофагами, предварительно стимулированными АПС. Однако в отличие от них, низковирулентные штаммы действовали активирующе - они дополнительно стимулировали активность N0.

Так как киллинг микроорганизмов является завершающим этапом фагоцитоза и отражает согласованность действия всех фаз фагоцитарного процесса, сравнили степень вирулентности грибов с кил-лерной способностью макрофагов в отношении исследованных штаммов. Установлено, что киллерная активность макрофагов была сравнима в отношении разных по вирулентности штаммов С. пео/огтаж как при взаимодействии их с интактными клетками гриба, так и в случае предварительной опсонизации сывороткой. Напротив, стимуляция макрофагов АПС достоверно повышала киллерную активность в отношении всех исследованных штаммов, но этот процесс был более выражен у низковирулентных (Рис.2,В). Заметим, что выживаемость мышей, зараженных штаммами С. пеофогтаж разной вирулентности, в высокой степени коррелировала с фагоцитозом (г=0,65; р<0,05), продукцией N0 (г=0,83; р<0,05) и киллерной активностью макрофагов, стимулированных АПС (г=0,75; р<0,05). По-видимому, суммарный киллерный эффект макрофагов в отношении С. пео-/огтаж зависит не только от продукции N0, но и от

ФИ %

30 25 20 15 10 5 О

■ сильновирулентные штаммы (п=5) □ слабо вирулентные штаммы (п=7)

A. Фагоцитарная активность макрофагов (р<0,01; *-между штаммами разной вирулентности,**- внутри группы штаммов)

нмоль/106 кл

250 200 150 100 50 О

Б. Продукция N0 макрофагами (р<0,01; *-МФлпс)

60 50 40 30 20 10 О

B. Киллерная активность макрофагов (р<0,01; * - между группами, **- внутри группы штаммов)

Рис. 2 (А,Б,В). Показатели взаимодействия макрофагов со штаммами С. пеоЬгтапз разной вирулентности. (МФ-макрофаги; МФлпс - макрофаги, активированные ЛПС;

С.п.- С. пеоЬгтат; опс С.п.-опсонизированные С. пеоЬгтап$)

других факторов микробоцидности.

Криптококки попадают в организм человека аэрогенным путем, и основными клетками, с которыми они взаимодействуют на первом этапе, являются альвеолярные макрофаги. В соответствии с современными представлениями, именно взаимодействие лиганд - рецептор (РАМРя - ЙЩ|| определяет все стадии фагоцитоза макрофагов по отношению к грибам [11]. Для осуществления фагоцитоза необходимо прикрепление гриба к поверхности макрофага, которое осуществляется посредством рецепторного взаимодействия. Способность фагоцитов отличать безвредные компоненты собственного организма от чужеродных обеспечивается системой рецепторов, распознающих полисахариды и полинуклеотиды на

%

53,8

34,3 32,5 29,3

17 7

10,3 ■

1

^--------1--^---------1--^--------

МФ+С.п. МФ+опсС.п. МФлпс+С.п.

1 68, 3

ш

8£\2$ 5.3^4 |

МФ+С.П. МФЛПС+С.П.

■29.52

**

14,8 1 14,3

8.98 * и,о;

■

МФ+С.п. МФ+опс С.п, МФлпс+С.п,

поверхности клетки микроорганизма [3]. Их условно можно разделить на две группы. К первой группе относят маннозный рецептор (MR), рецепторы компонентов комплемента (CR1,CR3), Fc-рецептор. Они отвечают в большей степени за поглощение микроорганизмов. Ко второй группе относят рецепторы передачи сигналов - толл-подобные рецепторы (tolllike receptor, TLR), включающие, по меньшей мере, 11 трансмембранных белков, распознающих различные микробные продукты [11]. Полученные нами данные об увеличении фагоцитарной активности при опсони-зации служат подтверждением большего вовлечения фагоцитарных рецепторов (CR1, CR3, Fc-рецептор к IgG) у слабовирулентных штаммов в сравнении с сильновирулентными. Известны немногие данные об особенностях взаимодействия компонентов клеток стенки С. neoformans с рецепторами макрофагов. Известно, что капсула криптококков состоит на 9095% из глюкуроноксиломаннана (ГМ) и на 5% - из галактоксиломаннана. Кроме того, в структуре капсулы имеется несколько маннопротеинов (<1%). Показано, что ГМ связывается с MR, CD 14, TLR2, TLR4, и CR3 [12], но особенности этого взаимодействия до конца не выяснены. Связывание соответствующих лигандов с TLR инициирует каскад биохимических реакций, активирующих ядерный фактор транскрипции NFkB с последующим активированием механизмов микробоцидности. Так, при взаимодействии MR с маннопротеинами клеточной стенки грибов генерируется сигнал, инициирующий фазу поглощения, происходит активация актиномиозиновой сократительной системы макрофага и, таким образом, гриб оказывается внутри фагосомы. TLRs, являясь

сигнальными рецепторами, не участвуют в процессе поглощения грибов. Интактные клетки микромице-тов плохо взаимодействуют с этими рецепторами и поэтому слабо индуцируют продукцию оксида азота. АПС взаимодействует с комплексом рецепторов на макрофагах - СБ14 и Т1Л-4, что приводит к продукции ФНО-а и ИЛ-1(3, которые потенцируют ферментативную активность КЮ-синтетазы, превращающей I,-аргинин в оксид азота [3,4]. Различия, полученные нами при оценке индукции N0 при взаимодействии макрофагов с сильно- и слабовирулентными штаммами, определяются, по-видимому, особенностями биологии возбудителя, в частности, факторами патогенности. Патогенность С. пео/огтат определяется сочетанием факторов вирулентности в его клетках, их выраженностью и действием.

ВЫВОДЫ

1. Интактные макрофаги фагоцитировали клетки штаммов С. пео/огтат с различной интенсивностью - активнее поглощались слабовирулентные штаммы. Опсонизация повышала поглотительную активность макрофагов вне зависимости от степени вирулентности штаммов С. пео/огтат.

2. Выявлены штаммные различия С. пео/огтат в отношении индукции N0: сильновирулентные штаммы, стимулированные ЛПС, ингибировали продукцию N0, тогда как слабовирулентные штаммы оказывали стимулирующее действие на этот процесс.

3. Киллерная активность макрофагов, стимулированных ЛПС, была более выражена в отношении слабовирулентных штаммов С. пео/огтат.

ЛИТЕРАТУРА

і.

Васильева Н.В. Факторы патогенности Cryptococcus neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза: Дисс... докт. биол. наук. - СПб., 2005.

Chai L., Netea М., VonkA., KullbergB. Fungal strategies for overcoming host innate immune response //Medical mycology. - 2009. - Vol 47. - P. 227-236.

МейлД. Бростофф Дж., Рот Д.Б. Ройтт А. Иммунология. Пер с англ. - М.: Логосфера, 2007. - 568 с.

Netea М., Van Der Meer J, Kullberg В. Recognition of fungal pathogen by Toll-like receptors // Immunology of fungal infection. - Springer, 2007. - P.259-272.

Blackstock R., Buchanan K. L, Adesina A. М., Murphy J.W. Differential regulation of immune responses by highly and weakly virulent Cryptococcus neoformans isolates // Infect, and Immun. -1999. - Vol.67. - P.3601-3609.

MaH., May R.C. , Virulence in Cryptococcus species // Advances in Applied Microbiology. - 2009. - Vol.67. - P.131-190. Wormley F.L. Jr, Perfect JR. Immunology of infection caused by Cryptococcus neoformans // Methods in Molecular Medicine. - 2005. - Vol.118. - P.193-198.

Zaragoza O., Taborda C.P., CasadevallA. The efficacy of complement-mediated phagocytosis of Cryptococcus neoformans is dependent on the location of C3 in the polysaccharide capsule and involves both direct and indirect C3-mediated interactions // Eur. J. Immunol. - 2003. - Vol. 33. - P. 1957-1967.

9. Del Poeta M. Role of phagocytosis in the virulence of Cryptococcus neoformans // Eukaryotic cell. - 2004. - Vol.3. - P. 1067-1075.

10. Kawakami K., Zhang Т., Qureshi M.H., Saito A. Cryptococcus neoformans inhibits nitric oxide production by murine peritoneal macrophages stimulated with interferon-y and lipopolysaccharide // Cellular immunology.-1997. - Vol.180. -P.47-54.

11. Medzhitov R. The innate immune system/ in: Fundamental immunology. - Lippincott Wiliams&Wilkins. -2008. - P.428-450.

12. Zaragoza O., et al. The capsule of the fungal pathogen Cryptococcus neoformans // Advances in Applied Microbiology -2009. -Vol.68. - P.133-216.

Поступила в редакцию журнала 09.03.2010 Рецензент: Н.П. Блинов