CC BY
23УДК 57.086.3:582.282.23
УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТОК ШТАММОВ CANDIDA ALBICANS И CANDIDA PARAPSILOSIS, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ И УСТОЙЧИВЫХ К АЗОЛАМ
Степанова A.A. (зав. лаб.)*, Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой), Выборнова И.В. (н.с.), Босак И.А. (с.н.с.), Чилина Г.А. (зав. лаб.)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, СевероЗападный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2018
В статье приведены данные по микроморфологии и ультраструктуре выращенных in vitro клеток Candida albicans (РКП^-1624, РКПГУ-1314, РКПГУ-1274) и Candida parapsilosis (РКПГУ-1579, РКПГУ-1525), различающиеся по чувствительности к антимикоти-кам (флуконазол и вориконазол). Выявлены различия в строении клеточных стенок дрожжевых клеток чувствительных и устойчивых штаммов изученных видов к антимикотикам. Для дрожжевых клеток резистентных штаммов C. albicans (РКПГУ-1274, РКПГУ-1624) было характерно присутствие толстых клеточных стенок, тогда как для дрожжевых клеток резистентного штамма C. parapsilosis (РКПГУ-1525) - наличие тонких меланифицированных клеточных стенок. Для клеток псевдомицелия изученных штаммов двух видов описанные особенности не были характерны, они имели тонкие клеточные стенки и однотипное строение.
Ключевые слова: in vitro, Candida albicans, Candida parapsilosis, культура, микроморфология, резистентность, ультраструктура, чувствительность
ULTRASTRUCTURE OF CELLS OF CANDIDA ALBICANS AND CANDIDA PARAPSILOSIS STRAINS RESISTANT AND SUSCEPTIBLE TO ASOLES
Stepanova A.A. (head of the labotatory), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department), Vybornova I.V. (scientific collaborator), Bosak I.A. (senior scientific collaborator), Chilina G.A. (head of the laboratory) Kashkin Research Institute of Medical Mycology of NorthWestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
©Collective of authors, 2018
The data regarding the micromorphology and ultrastructure growing in vitro cells of Candida albicans (РКПГУ-1314, РКПГУ-1274, РКПГУ-1624) and Candida parapsilosis (РКПГУ-1579, РКПГУ-1525) differing in sensitivity to antifungals (fluconazole and voriconazole) were presented in the article. Differences in the structure of cell walls of sensitive and resistant strains yeast cells of studied species to antimycotics were revealed. For yeast cells of resistant strains (РКПГУ-1274, РКПГУ-1624) of C. albicans more thick walls were typical and for susceptible C. parapsilosis strain (РКПГУ-1525) more thin but melanized cells walls. For the cells of pseudomycelium of the studied strains of two species the described features were not typical, they had thin cells walls with the same structure.
Key words: in vitro, Candida albicans, Candida parapsilosis, culture, micromorphology, resistance, sensibility, ultrastructure
Контактное лицо: Степанова Амалия Аркадьевна, e-mail: [email protected]
ВВЕДЕНИЕ
Изучение вопросов резистентности грибов рода Candida к противогрибковым препаратам - одна из актуальных задач современной медицины [1]. Знание механизмов резистентности Candida spp. необходимо для оптимизации тактики лечения больных с диагнозом «кандидоз» и разработки новых противогрибковых препаратов.
Цель исследования - анализ строения клеток, выращенных in vitro чувствительных и резистентных штаммов C. albicans и C. parapsilosis современными методами световой и трансмиссионной микроскопии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Культуры трех штаммов C. albicans (C.P. Robin) Berkhout (РКПГУ-1314, РКПГУ-1274 и РКПГУ-1624) и двух штаммов C. parapsilosis (Ashford) Langeron& Talice выращивали 8 суток на среде Сабуро в термостате при 37 °С.
РКПГУ-1314 был выделен со слизистой оболочки пищевода, РКПГУ-1274 - со слизистой оболочки ротовой полости пациента (И., 59 лет) с хроническим кандидозом. Первый штамм был чувствителен к флу-коназолу и вориконазолу, тогда как второй - резистентным по отношению к данным препаратам. Также дополнительно в работу был привлечен резистентный к флуконазолу и вориконазолу штамм (РКПГУ-1624) C. albicans, полученный от пациентки (Г., 40 лет) с хроническим кандидозным вульвовагинитом.
Чувствительный к антимикотикам штамм (РКПГУ-1579) C. parapsilosis был выделен из крови взрослого пациента (В., 30 лет), тогда как резистентный штамм этого вида (РКПГУ-1525) - с отделяемого кожи недоношенного младенца (А.).
Идентификацию культур проводили с использованием методов MALDI-TOF масс-спектрометрии и ДНК-секвенирования.
Кусочки агаризованной среды из периферической, средней и центральной частей колонии гриба фиксировали глутаральдегидом-параформальдегидом-осми-ем по методике, описанной нами ранее [2]. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-V (Швеция) с помощью стеклянных ножей, окрашивали раствором уранилацетата и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе просвечивающего типа JEM 100 CX-2 (Япония).
Колонии грибов фотографировали c помощью стереоскопического микроскопа SreREO Lumar.V12. Полутонкие эпоксидные срезы толщиной 3 мк получали с эпоксидных блоков на пирамитоме 11800 (LKB) c использованием стеклянных ножей. Полутонкие срезы анализировали и фотографировали в микроскопе AxioImager.Z1 (Carl Zeiss, Германия) с оптикой Номар-ского.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Через 8 суток роста на среде Сабуро колония штамма РКПГУ-1314 C. albicans достигала в диаметре 2,8 см. Форма колонии округлая, с четко очерченным периферическим ободком и волнистым краем (Рис. 1 а). На поверхности колонии, примыкающей к периферическому ободку, наблюдали кратерообразные сферические образования варьирующего диаметра. Колония кремовая, мягкой консистенции, с умеренным числом
Í--
гиф псевдомицелия (Рис. 1 б), перемежающихся с таким же количеством дрожжевых клеток (Рис. 1 б, в). Последние одиночные или в многочисленных группах, круглоовальные (3,0-5,0 x 4,0-8,0 мкм, Рис. 1 в).
Диаметр колонии штамма РКПГУ-1274 C. albicans через 8 суток роста на среде Сабуро составлял 3,3 см. Колония округлой формы, гладкая, с четко очерченным периферическим ободком и волнистым краем (Рис. 1 г), кремовая, мягкой консистенции. В составе колонии выявили умеренное число гиф псевдомицелия (Рис. 1 д), перемежающихся с массивными неправильной формы скоплениями дрожжевых клеток (Рис. 1 д), которые имели круглоовальную (3,0-6,0 x 4,0-8,9 мкм, Рис. 1 e) форму.
Колония C. albicans штамма РКПГУ-1624 через 8 суток роста на среде Сабуро имела диаметр 3,0 см, округлую форму, гладкий центр и периферический ободок (Рис. 1 ж); большая часть контура ровная, а меньшая - в виде гладких и с веерообразной поверхностью раковинообразных выростов. Колония кремового цвета и мягкой консистенции, в ее полутонких эпоксидных срезах отмечали небольшое количество гиф псевдомицелия (Рис. 1 з), перемежающихся с дрожжевыми клетками, формирующими крупные группы неправильной формы (Рис. 1 з). Дрожжевые клетки одиночные, кру-глоовальные (3,0-6,0 x 3,5-8,7 мкм, Рис. 1 и).
Через 8 суток роста на среде Сабуро колония штамма РКПГУ-1579 C. parapsilosis достигала в размере 2,5 х 4,2 см, эллипсоидальной формы, снабжена периферическим ободком и волнистым краем (Рис. 1 к), центральная часть - гладкая. Колония кремового цвета и мягкой консистенции; обнаружили равное количество гиф псевдомицелия (Рис. 1 л), перемежающихся с таким же количеством дрожжевых клеток (Рис. 1 л). Псевдомицелий хорошо развит, ветвистый, Конидии одиночные или в многочисленных группах, круглоо-вальные (2,0-5,0 x 4,0-7,0 мкм, Рис. 1 м), равномерно покрывали псевдогифы.
Колония штамма РКПГУ-1525 C. parapsilosis через 8 суток роста на среде Сабуро имела несколько вытянутую форму (3,0 х 3,8 см), гладкая, с четким периферическим ободком и волнистым краем (Рис. 1 о), кремовая, мягкой консистенции. Наблюдали большое количество число гиф псевдомицелия (Рис. 1 и), перемежающиеся с таким же количеством дрожжевых клеток (Рис. 1 п, р). Гифы псевдомицелия сильно ветвящиеся. Дрожжевые клетки одиночные или в многочисленных группах, круглоовальные (3,0-5,2 x 3,5-8,0 мкм, Рис. 1 р), часто располагаются на ветвящихся гифах псевдомицелия.
Вышеприведенные данные показывают отсутствие существенных различий по скорости роста и размерам дрожжевых клеток изученных чувствительных и резистентных штаммов C. albicans и C. parapsilosis. Обращает на себя внимание тот факт, что в культурах резистентных штаммов C. albicans (Рис. 1 д, ж), в отличие от чувствительного (Рис. 1 б), дрожжевые клетки доминировали. Они формировали массивные скопления неправильных очертаний (Рис. 1 д, з, стрелки). Для псевдомицелия C. parapsilosis был характерен тип роста Mycocandida [3].
При исследовании клеточных стенок штаммов разных видов (табл.) выявили, что наиболее толстые клеточные стенки были характерны для дрожжевых кле-
ток резистентных штаммов C. albicans (РКПГУ-1274, РКПГУ-1624).
Таблица
Средние значения толщины слоев клеточных стенок (мкм) зрелых дрожжевых клеток и клеток псевдомицелия штаммов
C. albicans и C. parapsilosis, мкм
Номер штамма и отношение к атимикотикам Толщина слоев клеточной стенки дрожжевых клеток Суммарная толщина клеточной стенки дрожжевых клеток Толщина слоев клеточной стенки клеток псевдомицелия Суммарная толщина клеточной стенки дрожжевых клеток
С. albicans
РКПГУ-1314 чувствительный 0,05* 0,05 0,10 0,04 0,04 0,08
РКПГУ-1274 резистентный 0,05 0,45 0,50 0,05 0,20 0,25
РКПГУ-1624 резистентный 0,02 0,53 0,55 0,05 0,10 0,15
С. parapsilosis
РКПГУ-1579 чувствительный 0,02 0,19 0,21 0,03 0,03 0,10
РКПГУ-1525 резистентный 'Примечание: числителе-толш 0,04 0,21 в знаменателе ина второго (не 0,25 - толщина пе ружного) слоя 0,04 0,04 рвого (внутре 0,08 ннего) слоя, в
В то же время для дрожжевых клеток этого вида наиболее тонкие клеточные стенки были присущи для чувствительного штамма (РКПГУ-1314). Клетки псевдомицелия у изученных штаммов C. albicans имели более тонкие клеточные стенки по сравнению с дрожжевыми клетками. Однако они были в 2-5 раз толще таковых клеток псевдомицелия C. parapsilosis. Стенки дрожжевых клеток и гиф псевдомицелия чувствительного штамма C. albicans (РКПГУ-1314) состояли из двух слоев. Сходное двуслойное строение было характерно и для клеточных стенок дрожжевых клеток и гиф псевдомицелия других штаммов C. albicans [4-9].
У чувствительного штамма нижний слой в составе стенки был светлый, с хаотично ориентированными микрофибриллами, тогда как верхний - электронно-плотный, с вертикально расположенными темными и высококонтрастными микрофибриллами (Рис. 2 а, б, слой 2). Очевидно, что темный цвет второго слоя обусловлен присутствием меланина, что было показано другими авторами [6]. Дрожжевые клетки резистентных штаммов C. albicans имели клеточные стенки различного строения. У штамма РКПГУ-1274 первый слой состоял из перемежающихся слоев микрофибрилл разной плотности (Рис. 2 в, слой 1), у другого резистентного штамма (РКПГУ-1624) он был умеренной электронной плотности, гомогенным по плотности расположения микрофибрилл (Рис. 2 д, слой 1). Второй слой в стенках обоих штаммов был темным, с хаотично расположенными микрофибриллами (Рис. 2 в, д, слои 2). Клеточные стенки гиф псевдомицелия у резистентных штаммов C. albicans состояли из двух слоев (Рис. 2 г, е): нижнего толстого светлого и верхнего темного с хаотично расположенными микрофибриллами.
Дрожжевые клетки чувствительного (РКПГУ-1579) и резистентного (РКПГУ-1525) штаммов C. parapsilosis практически не различались между собой по толщине клеточной стенки (табл.). Толщина их клеточных стенок была в два раза меньше, чем у дрожжевых клеток резистентных штаммов C. albicans и в два раза больше таковых чувствительного штамма последнего вида. Морфологической особенностью строения клеточной стенки дрожжевых клеток резистентного штамма C. parapsilosis был тот факт, что первый нижний слой
Рис. 1. Особенности микроморфологии колоний (а, г, ж, к, о) и строения клеток культур в световом микроскопе на полутонких эпоксидных срезах (б, д, з, л, п) и с использованием оптики Номарского (в, е, и, м, р). С. albicans: а-в -РКПГУ-1314, г-е - РКПГУ-1274, ж-и - РКПГУ-1624, C. parapsilosis: к-м - РКПГУ-1579, РКПГУ-1525. Условные обозначения: ДК -
дрожжевые клетки, ПМ - псевдомицелий.
Рис. 2. Ультраструктура клеточных стенок дрожжевых клеток и гиф псевдомицелия С. albicans и C. parapsilosis. а, б - С. albicans (РКПГУ-1314), в, г - С. albicans (РКПГУ-1274), д, е - С. albicans (РКПГУ-1624), ж, з - C. parapsilosis (РКПГУ-1579), и, к - C.
parapsilosis (РКПГУ-1525).
(собственно клеточная стенка) в них был полностью меланифицирован (Рис. 2 и). Он был гомогенно темный; небольшой по толщине наружный слой клеточной стенки также был темным, с четко различимыми микрофибриллами. Отметим, что меланификация клеточной стенки происходит у дрожжевых клеток Cryptococcus neoformans при выращивании их на среде L-DOPA [9] и у тканевых форм этого вида гриба [10].
Первый слой в составе клеточных стенок чувствительного штамма C. parapsilosis (РКПГУ-1579) имел умеренную электронную плотность и слабоконтрастные микрофибриллы. Второй наружный слой был в четыре раза тоньше, темный, с хаотично ориентированными микрофибриллами (Рис. 2 ж). Клеточные стенки гиф псевдомицелия C. parapsilosis тонкие (табл.), с однотипным строением - состояли из двух слоев одинаковой толщины (Рис. 2 з, и). Нижний слой, умеренно электронно-плотный, состоял из слабоконтрастных, беспорядочно расположенных микрофибрилл, тогда как микрофибриллы верхнего слоя были темные и вертикально ориентированные.
РЕЗЮМЕ
Установлено, что у дрожжевых клеток резистентных штаммов C. albicans и C. parapsilosis, в отличие от чувствительных, имеются значительные изменения в строении клеточных стенок, характерные для каждого из них. Пока остается открытым вопрос о том, как можно объяснить контрастные изменения в строении стенок дрожжевых клеток резистентных штаммов двух видов Candida под влиянием сходных антимикотиков. Важен тот факт, что изменения в строении клеточных стенок дрожжевых клеток под действием антимикотиков не исчезают при переходе их в культуральную форму, то есть представляют собой генетически закрепленный признак. Интересно, что стенки гиф псевдомицелия не были утолщены и имели сходное строение у штаммов двух изученных видов. Можно предположить, что in vivo они не подвергаются изменениям и сохраняют присущее им строение, иными словами, дрожжевые клетки более чувствительны к влиянию антимикотиков, в отличие от клеток псевдомицелия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Капустина О.А., Карташова О.Л., Пашинин Н.С., Нургалиева Р.М. Чувствительность к противогрибковым препаратам грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов тела человека. Современные наукоемкие технологии. 2010; 2: 9495. [Kapustina O.A., Kartashova O.L., Pashinin N.S., Nurgalieva R.M. CHuvstvitel'nost' k protivogribkovym preparatam gribov roda Candida, vydelennyh iz raznyh biotopov tela cheloveka. Sovremennye naukoemkie tekhnologii. 2010; 2: 94-95 (In Russ)].
2. Степанова А.А., Васильева Н.В., Чжан Ф., Тонг Д. Ультраструктурное исследование клеток вегетативного мицелия Aspergillus candidus Link, выращенных in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2016; 18 (2): 23-27. [Stepanova A.A., Vasileva N.V., Chzhan F., Tong D. Ul'trastrukturnoe issledovanie kletok vegetativnogo miceliya Aspergillus Candidus Link, vyrashchennyh in vitro. Problemy medicinskoj mikologii. 2016; 18 (2): 23-27 (In Russ)].
3. Елинов Н.П., Васильева Н.В., Степанова А.А. и др. Краткий атлас медицински значимых микромицетов рода Candida. СПб: Изд-во СЗГМУ им. Н.Н. Мечникова. 2013: 73 c. [Elinov N.P., Vasileva N.V., Stepanova A.A. i dr. Kratkij atlas medicinski znachimyh mikromicetov roda Candida. SPb: Izd-vo SZGMU im. N.N. Mechnikova. 2013: 73 c. (In Russ)].
4. Gow N.A.R., Hube В. Importance of the Candida albicans cell wall during commensalism and infection. Current Opinion in Microbiol. 2012; 15: 406-412.
5. Iwada K., Kanda Y., Yamaguchi H., Osumi M. Electron microscopic studies on the mechanism of action of clotrimazole on Candida albicans. Sabouraudia. 1973; 11: 205-209.
6. Gow N.A.R., Latge J.-P., A. Munro C.A. The fungal cell wall: structure, biosynthesis, and function. Microbiology. 2017; 5 (3): 1-25.
7. Степанова А.А., Шевяков М.А., Авдеенко Ю.Л. и др. Изучение слизистой оболочки пищевода при кандидозе у ВИЧ-инфицированного больного. Проблемы медицинской микологии. 2011; 13 (1): 54-61. [Stepanova A.A., Shevyakov M.A., Avdeenko Y.L. i dr. Izuchenie slizistoj obolochki pishchevoda pri kandidoze u VICH-inficirovannogo bol'nogo. Problemy medicinskoj mikologii. 2011; 13 (1): 54-61 (In Russ)].
8. Степанова А.А., Цинзерлинг В.А., Шевяков М.А. и др. Сканирующая электронная микроскопия слизистой оболочки пищевода при кандидозе у ВИЧ-инфицированного больного. Проблемы медицинской микологии. 2008; 10 (2): 81-82. [Stepanova A.A., Cinzerling V.A., Shevyakov M.A. i dr. Skaniruyushchaya ehlektronnaya mikroskopiya sli-zistoj obolochki pishchevoda pri kandidoze u VICH-inficirovannogo bol'nogo. Problemy medicinskoj mikologii. 2008; 10 (2): 81-82 (In Russ)].
9. Васильева Н.В. Факторы патогенности Cryptococcus neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза: Дисс. на соискание уч. степени д.б.н.. СПб, 2005: 340 c. [Vasileva N.V. Faktory patogennosti Cryptococcus neoformans i ih rol' v patogeneze kriptokokkoza: Diss. na soiskanie uch. stepeni d.b.n.. SPb, 2005: 340 c. (In Russ)].
10. Stepanova A.A., Vasilyeva N.V., Yamaguchi M., et al. Electron microscopy of autopsy material from the human brain cryptococcosis and AIDS. Problems in medical mycology. 2015; 17 (1): 35-40.
Поступила в редакцию журнала: 05.09.2018
Рецензенты: Т.С. Богомолова, Е.В. Фролова
