CC BY
10УДК 542.91: 547.466.1
ПРИМЕНЕНИЕ 2,4,5-ТРИХЛОРФЕНИЛОВЫХ ЭФИРОВ КАК С-ЗАЩИТНОЙ
ГРУППЫ
БОБИЗОДА ГУЛОМКОДИР МУККАМАЛ
академик Академии Образования Таджикистана, д.б.н., д.фарм.н., профессор кафедры органической химии Таджикского национального университета
КОДИРОВ МУРОД ЗОКИРОВИЧ
к.х.н., доцент кафедры органической химии Таджикского национального университета
ЗАФАРОВ СОРБОН ЗАФАРОВИЧ
к.х.н., ассистент кафедры органической химии Таджикского национального университета
ШАРИПОВА ДИЛРАБО АЗИЗБЕГОВНА
к.х.н., ассистент кафедры органической химии Таджикского национального университета
Аннотация. В последние десятилетия прошлого века велись интенсивные исследования по синтезу активных центров белков. В результате этих исследований было показано, что синтетические гормоны полностью идентичны по биологической активности природным. Наиболее часто при синтезе использовались методы активированных эфиров, смешанных ангидридов и карбодиимидный. Карбодиимиды при взаимодействии с карбоновыми кислотами образуют реакционноспособные О-ацилизомочевины, которые при взаимодействии с аминокомпонентом образуется пептид и NN'-замещенная мочевина. При получении защищенных дипептидов Nps-Tyr(OBzl)-Glu(OBzl)-OPCh и Nps-Glu(OBzl)-Tyr-OPhCh было показано, что 2,4,5-трихлорфенильную группу можно использовть в качестве С-защитной группы. В данном случи отмечался высокий выход продукта на каждой стадии синтеза. 2,4,5-трихлорфенильная группа оказалась стабильной в условиях удаления Nps-группы и в условиях проведения синтеза карбодиимидным методом. Был разработана недорогая технология синтеза пептидов по существу в любом диапазоне с применением N-карбодиимидным методом. После добавочной однократной перекристаллизации чистота пептида становится выше 99%.
Ключевые слов: тирозин, - глутаминовая кислота - 2,4,5, -трихлорфенол, карбодиимид, перекристаллизации пептид, О-ацилизомочевины.
2020 год можно считать одним из самых сложных за последние несколько десятилетий. Он запомнится как год COVID-19, нанесший значительный ущерб здоровью множества людей и экономике всех стран из-за своего быстрого распространения. Для фармацевтической отрасли встал гигантский вызов как в разработке антиковидных вакцин, так и иных препаратов, призванных заменить устаревшие и менее эффективные. Согласно последним данным центра исследований и оценки качества лекарственных препаратов (CDER) FDA, за первые 4 месяца 2021 было одобрено 18 новых препаратов, пять из которых являются препаратами пептидной природы [1-3].
К данному типу препаратов фармацевтическая индустрия прибегает с каждым годом все чаще и чаще. Это показывают последние данные и прогнозы, согласно которым в 2020 году рынок пептидов оценивался в 23 миллиарда долларов США с прогнозируемым ростом до 57 миллиардов долларов США к 2027 году [4]. Связано это с постоянно ведущимися работами и исследованиями как по созданию совершенно новых, так и по модификации ранее разработанных препаратов. Например, можно привести глюкагонподобный пептид-1 (GLP-1),
время жизни которого в плазме крови составляет около двух минут. Впоследствии его структура послужила основой при разработке лираглутида и оземпика [5, 6].
В основе фармакокинетики пептидов лежат важнейшие клеточные функции, включающие в себя рост клеток, репликацию дезоксирибонуклеиновой кислоты, активацию транскрипции, трансляцию и трансмембранную сигнальную трансдукцию. Они регулируются мультипротеиновыми комплексами, что позволяет легче выявлять терапевтические агенты, избирательно нацеленные на специфические для какого-либо заболевания молекулярные механизмы, так как пептиды с большей эффективностью и селективностью связываются с большой белковой мишенью, не вызывая сильных побочных эффектов и высокого потенциала токсичности в сравнении с малыми молекулами того же действия. Вышеперечисленные преимущества объясняются тем, что аминокислоты, на которые организм и расщепляет пептиды различными протеиназами и пептидазами, метаболизируются с образованием нетоксичных продуктов распада. Более того организм проявляет высокую восприимчивость к данной категории препаратов. В то же время аминокислотный состав является самым большим недостатком из-за той же высокой восприимчивости, пептидные молекулы очень быстро распадаются, не успев оказать терапевтический эффект. Для минимизации вышеописанного недостатка и проводятся различные структурные модификации [7].
Один из тирозинсодержаших гексапептид (Aгg-Asp-Lys-Val-Tyг-Aгg) является иммунофан обладает антиоксидантной активностью, восстанавливает клеточный и гуморальный иммунитет: стимулирует созревание Т-лимфоцитов, взаимодействие Т-хелперов и клеток костного мозга, усиливает активность ЕКК и кислородзависимую систему бактерицидности нейтрофилов; на фоне иммунопатологии активирует ранние этапы антителогенеза, увеличивает синтез IgM, IgG, ^А, снижает гиперпродукцию ^Е; стимулирует нарушенную продукцию сывороточного химического фактора и в 4 - 6 раз увеличивает количество антителообразующих клеток [8]; регулирует образование медиаторов иммунной системы [9].
Принципиальным отличием иммунофана от многих других иммуномодуляторов является его действие на другие системы гомеостаза организма [10]. Он защищает дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) лимфоцитов при воздействии низких концентраций перекиси водорода, нормализует структуру дезоксирибонуклеиновая кислота лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови й после завершения патогенетической терапии у больных бруцеллезом. Напротив, использование бруцеллезной вакцины усугубляет степень повреждения. На основе глутамил-триптофана, полученного синтетическим путем, разработан препарат тимоген [9, 10], имеющий высокое сродство дипептида с рецепторами тимоцитов, их связь является, вероятно, стартовым сигналом, запускающим каскад биоэнергетических реакций. Тимоген воздействует на механизмы внутритимической дифференцировки Т-лимфоцитов [9], повышает биосинтез ДНК и рибонуклеиновая кислота (РНК), снижает уровень вызванных формальдегидом аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови человека, повышает устойчивость организма к радиационному воздействию, тормозит спонтанный и индуцированный радионуклидами канцерогенез и оказывает геропротекторный эффект, положительно влияет на интегративные процессы в мозгу, имеет антидепрессивное и психостимулирующее действия [9].
Все вышеизложенное обуславливает необходимость проведения исследований возможности применения 2,4,5-трихлофениловых эфиров в качестве С-защитной группы при синтезе пептидов, содержащих тирозин и глутаминовую кислоту.
Материалы и методы:
Н-Tyг(0Bzl)-0Н (I). К раствору 18,1 г тирозина в 12.5 мл 2н NaOH при нагревании до 70 добавляли 17 г CuSO4 5H2O. Смесь охлаждали до 20 при сильном перемешивании в течение 1 часа прибавляли 20 мл С6Н5СШО, растворенного в 50 мл ацетона, перемешивали 2 часа при
20 и 2 часа при 60-70. Отфильтровывали образовавшийся осадок промывали водой и эфиром до получения бесцветного фильтрата. После высушивания получили 25 г медного комплекса бензилтирозина, который восстанавливали 28 г трилона Б в смеси 200 мл воды и 200 мл н-бутанола при кипячении 5 часов с обратным холодильником. Образуется трехслойная система, которую фильтровали, промывали последовательно водой и эфиром до получения бесцветного фильтрата.
Nps-Tyr(OBzl)-OH ДЦГА (II). К раствору12,38 Г (I) в смеси44 мл 1н NaOH и 60 мл диоксана при сильном перемешивании за 15 мин прибавляли одновременно 9,2 г Nps-Cl и по каплям 26,5 мл 2н NaOH (рН 7-9) добавляли 100-150 мл этилацетата и подкисляли 1н H2SO4 до рН 5-4. Полученный двухслойный раствор отфильтровывали от непрореагировавшего (I), водный слой экстрагировали этилацетатом (4х100 мл). объединенные этилацетатные вытяжки промывали водой и сушили безводным Na2SO4. После отделения осушителя к раствору прибавляли ДЦГА и оставляли на 5-10 часов в холодильнике. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывали, промывали эфиром и сушили в вакууме при 40-50. Выход (II) 26,6 г (84,2%), Тпл. 166Б [a]D24 +30,7 (c1,27, CHCb), Rf 0,79 (В).
Nps-Tyr(OBzl)-OPhCl3 (III). Для отделения ДЦГА к суспензии 10,9 г (II) в 150 мл этилацетата добавляли 22,0 мл 1н H2SO4 и встряхивали до полного растворения. Водный слой отделяли, а этилацетатный промывали водой, сушили над Na2SO4 и упаривали в вакууме. К полученному Nps-Tyr(OBzl)-OH в 75 мл абсолютного этилацетата добавляли 3,6г 2,4,5 -трихлорфенола, охлаждали до -15, добавляли 3,8г дициклогексилкарбодиимида, перемешивали 2 часа при -15о, 1 час при 20 и оставляли на ночь. Затем реакционную массу разбавляли этилацетатом, добавляли 1 мл 50%-ной уксусной кислоты и через 15 мин отфильтровывали от дициклогексилмочевины. Фильтрат промывали 1н H2SO4, водой и сушили над Na2SO4. Отделяли растворитель и раствор упаривали досуха. Продукт содержит незначительное количество Nps-Tyr(OBzl)-OH, который легко отделяется при пропускании раствора (III) в хлороформе на колонке с силикагелем; (III) элюируется хлороформом, а примесь остается. После упаривания элюата остаток перетирали с гексаном, растворитель сливали, сушили, вновь растворяли в СНСЬ и высаживали эфиром. Выход (III) 10,7 г, (92,0%), Тпл. 114-114,5, Rf 0,95 (Б), 0,97 (В).
HCl H-Tyr(OBzl)-OPhCl3 (IV). К 11,47 г (III) в 80 мл абсолютного CHCb, добавляют 19,4 г 3 н HCl в этилацетате и выдерживали 4 мин при 20 и 60 мин при -4-5. Образовавшуюся суспензию разбавляли абс. эфиром, фильтровали и промывали до получения бесцветного фильтрата. После переосаждения из метанола эфиром получено 8,52 г (92,6%) (IV), Тпл. 190, Rf 0,72 (А), 0,69 (Б).
Nps-Tyr(OBzl)-Glu(OBzl)-OPCl3 (V). К смеси 3,73 г (II) [освобожденного от ДЦГА аналогично (II)] 2,8 г HCl H-Glu(OBzl)-OPCb в 45 мл абс. этилацетата при -15 -20 добавляют 1,3 г дициклогексилкарбодиимида и 0,85 мл ТЭА. Смесь перемешивали 2 ч при -15 -20, 2 часа при 20, и оставляли н ночь, затем разбавляли этилацетатом, добавляли 0,5 мл 50%-ной уксусной кислоты и через 15 мин отделяли ДЦГМ. Фильтрат промывали 1 н H2SО4, водой и сушили над Na2SО4. После отделения осушителя растворитель упаривали, а остаток растворяли в CCl4 и очищали на колонке аналогично (III). После упаривания ССЦ получено 5,58 г кристаллического (V), который содержал 0,5 молекулы сольватного ССЦ, что соответствует выходу 108,8%, Тпл. 88-89, Rf 0,97 (Б).
Nps-Tyr^PhCb (VI). После отделения ДЦГА от 4,58 г Nps-Tyr-ОН ДЦГА и сушки Nps-Tyr-ОН растворяли в 45 мл сухого этилцетата к которому прибавляли 1,75 г 2,4,5-трихлорфенола, охлаждали до -15 и прибавляли 1,85 г дициклогексилкарбодиимида. Перемешивали еще 2 ч при -15о и оставляли на ночь при 20. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и обрабатывали аналогично (III). Остаток растворяли в 100-150 мл CCU и и пропускали через колонку с силикагелем и отмывали ССЦ до прекращения выделения
раствора желтого цвета. Продукт элюировали этилацетатом. После упаривания этилацетата получено 4,5 г (98,5%) (VI) в виде аморфного продукта 4 0,86 (Б), 0,87 (В).
НИ H-Tyг-ОPhClз (VII). Получали аналогично (IV). Исходя из 4,5 г соединения (VI). Получено 2,85 г (82,6%) продукта, Тпл.209-210, Rf 0,81 (А).
Nps-Glu(0Bzl)-Tyг-0PhClз (VIII). Получали аналогично (V) исходя из 2,92 г соединения (IV). Получено 3,3 г (88,5%) аморфного продукта, Rf 0,93 (А), 0,85 (Б).
Для удаления бензильных защитных групп 0,065 г полипептида гидрировали в смеси диоксан-уксусная кислота-диметилформамид (1:1:2) в присутствии Pd-черни. Катализатор удаляли, растворитель упаривали, а остаток последовательно перетирали с диоксаном и эфиром. Получено 0,0357 г (26,5%). Отщепление бензильных групп контролировали по исчезновению в ИК-спектре (инфракрасный) полос поглощения при 1740, 750 и 700см-1.
Nps-Tyг-ОPhClз (VIII). После отделения ДЦГА от 4,58 г Nps-Tyг-ОН ДЦГА и сушки Nps-Tyг-ОН растворяли в 45 мл сухого этилцетата к которому прибавляли 1,75 г 2,4,5-трихлорфенола, охлаждали до -15 и прибавляли 1,85 г дициклогексилкарбодиимида. Перемешивали еще 2 ч при -15о и оставляли на ночь при 20. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и обрабатывали аналогично (III). Остаток растворяли в 100-150 мл CCl4 и и пропускали через колонку с силикагелем и отмывали ССЦ до прекращения выделения раствора желтого цвета. Продукт элюировали этилацетатом. После упаривания этилацетата получено 4,5 г (98,5%) (VI) в виде аморфного продукта 4 0,86 (Б), 0,87 (В).
НИ H-Tyг-ОPhClз (IX). Получали аналогично (IV). Исходя из 4,5 г соединения (VI). Получено 2,85 г (82,6%) продукта, Тпл.209-210, Rf 0,81 (А).
Nps-Glu(0Bzl)-Tyг-0PhClз (X). Получали аналогично (V) исходя из 2,92 г соединения (IV). Получено 3,3 г (88,5%) аморфного продукта, Rf 0,93 (А), 0,85 (Б).
НИ Н-Glu(0Bzl)-Tyг-0PhClз получали аналогично (IV). Исходя из 0,9 г соединения (Х). Получено 0,5 г (66,2%) аморфного продукта, Rf 0,86 (А).
Н-(Glu-Tyг)n-ОН. 1,1445 г соединения (XI) растворяли в 0,9842 г диметилсульфоксида, прибавляли 0,635 мл (2,5 экв) и перемешивали. Через 15 суток содержимое ампулы растворяли в метаноле и полипептид высаждали из суспензии эфиром. Осадок отфильтровывали и для отделения трихлорфенола и хлоргидрата триэтиламина промывали эфиром, перетирали с теплой водой. Получено 0,5 г (77%) Н-Glu(0Bzl)-Tyг-0Н, 0,34 г которого растворяли в 3,4 мл абс. трифторуксусной кислоты и добавляли 3,4 мл 35%-ного НБг в ледяной уксусной кислоте. Через 40 мин приливали абс. эфир до полного осаждения полипептида. Эфир упаривали в вакууме, растирали с эфиром и эфирный слой отделяли декантацией. Выход полипептида 0,3 г, М.в. 2900-3200.
Обсуждение результатов Свойства все синтезированных соединений и выход продукта на каждой стадии синтеза приведен в таблице 1. Таблица 1
Выход и свойства полученных соединений
Соединение Выход, % Тпл., С Rf
H-Tyr(OBzl)-OH 46,8% 228-229 0,49 (А)
Nps-Tyr(OBzl)-OH ДЦГА 84,2% 166 0,79 (В)
Nps-Tyr(OBzl)-OPhCl3 92,0% 114-114,5 0,95 (Б), 0,97 (В)
HCl H-Tyr(OBzl)-OPhCl3 92,6% 190 0,72 (А), 0,69 (Б)
Nps-Tyr(OBzl)-Glu(OBzl)-OPCl3 108,8% 88-89 0,97 (Б)
Nps-Tyr-OPhCl3 (98,5%) Аморфн. 0,86 (Б), 0,87 (В)
HCl H-Tyr-OPhCl3 82,6% 209-210 0,81 (А)
Nps-Glu(OBzl)-Tyr-OPhCl3 88,5% Аморфн. 0,93 (А), 0,85 (Б)
А - вода-уксусная кислота-н-бутанол (3:1:10) Б - толуол-диоксан-циклогексан-уксусная кислота (10:6:3:1) В - толуол-диоксан-циклогексан -этиловый спирт (10:6:3:1)
Как видно из полученных результатов, отмечался высокий выход продукта на каждой стадии синтеза. 2,4,5-трихлорфенильная группа оказалась стабильной в условиях удаления Nps-группы и в условиях проведения синтеза карбодиимидным методом.
Таким образом, при получении защищенных дипептидов Nps-Tyr(OBzl)-Glu(OBzl)-OPCl3 и Nps-Glu(OBzl)-Tyr-OPhCl3 было показано, что 2,4,5-трихлорфенильную группу можно использовать в качестве С-защитной группы.
ЛИТЕРАТУРА
1. U.S. Food and Drug Administration (FDA): официальный сайт — URL: https://www.fda.gov/drugs/newdrugs-fda-cders-new-molecular-entities-and-newtherapeutic-biological-products/novel-drug-approvals-2021 (дата обращения 3 мая 2021).
2. U.S. Food and Drug Administration (FDA): официальный сайт — URL: https://www.fda.gov/drugs/newdrugs-fda-cders-new-molecular-entities-and-newtherapeutic-biological-products/novel-drug-approvals-2020 (дата обращения 3 мая 2021).
3. Beatriz G. de la Torre, Fernando Albericio. Peptide Therapeutics 2.0 // Molecules. 2020. Vol. 25. P. 2293. doi:10.3390/molecules25102293.
4. Vincent Martin, Peter H. G. Egelund, Henrik Johansson, Sebastian Thordal Le Quement, Felix Wojcik and Daniel Sejer Pedersen. Greening the synthesis of peptide therapeutics: an industrial perspective // RSC Adv. 2020. Vol. 10. P. 42457. DOI: 10.1039/d0ra07204d.
5. Yun Ding, Joey Paolo Ting, Jinsha Liu, Shams Al-Azzam, Priyanka Pandya, Sepideh Afshar. Impact of non-proteinogenic amino acids in the discovery and development of peptide therapeutics // Amino Acids. 2020. Vol.52. P. 1207-1226. https://doi.org/10.1007/s00726-020-02890-9.
6. Mary S. Rosendahl. Modified peptides and proteins. Patent 14/752,461 Pub. No.: US 2015/037484.0 A1. Pub. Date: Dec. 31, 2015. Filed Jun. 26, 2015, 98 P.
7. Artificial Protein and Peptide Nanofibers Design, Fabrication, Characterization, and Applications. Edited by Gang Wei, Sangamesh G. Kum bar, Elsevier Science & Technology, Duxford, UK, 2020, 502 P. https://doi.org/10.1016/C2018-0-02149-0.
8. Сравнительная оценка антиоксидантных свойств иммунорегуляторных препаратов / Тутельян А.В. [и др.] // Бюлл. эксперимент. биол. и медицины. - 2003. - Т. 138, №8. -С.179 - 183.
9. Морозов В.Г. Пептидные тимомиметики / В.Г.Морозов, В.Х.Хавинсон, В.В. Малинин // - СПб.: Наука, 2000. - 158 с.
10. Клиническая фармакология тимогена / Ред. В.С. Смирнов. - СПб, 2003. - 106 с.
