CC BY
16Гулов Т.Ё. - Таджикский государственный педагогический университет им. С. Айни, кандидат химических наук, заведующий кафедрой органической и биологической химии. Адрес: 733740, Республика Таджикистан, г. Душанбе, проспект Рудаки, 121. Телефон: 90780-70-10
Абдуллоев А. — Таджикский государственный педагогический университет им. С. Айни, магистр 2-го курса кафедрой органической и биологической химии, химического факультета.
About the authors:
Murodov D.S. - Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor of the Department of Organic and Biological Chemistry of Tajik State Pedagogical University named after S. Aini. Address/Tajik State Pedagogical University named after S. Aini. Tajikistan, Dushanbe, Rudaki, 121.E-mail:ojiz@mail.ru. Tel: 507001313
Bandaev S.G. - Doctor of Chemical Sciences of the Department of Organic and Biological Chemistry of Tajik State Pedagogical University named after S. Aini. Address: Tajik State Pedagogical University named after S. Aini. Tajikistan, Dushanbe, Rudaki, 121.E-mail: badaev@mail.ru, Tel: 907747409.
Gulov T. Y. - Candidate of Chemical Sciences, the Head of the Department of Organic and Biological Chemistry of Tajik State Pedagogical University named after S. Aini. Address: Tajik State Pedagogical University named after S. Aini. Tajikistan, Dushanbe, Rudaki, 121. Tel: 907807010
Abdulloev A. - master student of Chemical Sciences of the faculty of Chemistry of Tajik State Pedagogical University named after S. Aini. Address: Tajik State Pedagogical Universitynamed after S. Aini. Tajikistan, Dushanbe, Rudaki, 121.
УДК 542.91+547
СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДОВ СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ
Валиев Р., Бобиев Х.А.
Таджикский аграрный университет Ш.Шотемур
Важную роль в выполнении биологических функций в живом организме играют ферменты, которые с поразительно высокой скоростью катализируют различные химические реакции, происходящие в живых клетках. Эти белки в настоящее время широко изучаются, так как находят применение в различных сферах медицины и биотехнологии. Однако источники их поставки ограниченны, поэтому многие исследователи заняты поиском более рациональных способов их получения плп же стремятся заменить их модельными соединениям, обладающими близкими к ним свойствам.
Химический синтез молекул даже небольших белков требует много сложных и трудоемких химических операций [1], поэтому весьма перспективным представляется синтез отдельных их фрагментов, приближающихся по своей структуре и свойствам к природным макромолекулам. В данной работе в качестве объектов исследования, выбраны полипептиды регулярного строения, моделирующие активный центр некоторых эстераз [2]. Иавестно, что в ферментативном катализе, где происходит до порно- акцепторного взаимодействие с субстратом, принимают участие определён- ные функциональные группы аминокислот, в частности имидазольная группа пептида и карбоксильные группы глутаминовой и аспарагиновой кислот. Поэтому изучение влпянпя отдельных функциональных групп па процесс катализа па примере полипептидов регулярного строения, содержащих упомянутые выше аминокислоты, представляется интересным.
В настоящее время установлено, что «активный центр» фермента образуется при формировании определенной пространственной структуры белка и для его функционирования, не обязательно наличие полного набора аминокислот, входящих в состав данного фермента. Именно с этой точки зрения создание определенных синтетических моделей полипептидов-катализаторов, которые по принципу своего действия могут быть близки к природным ферментам, помогло бы созданию искусственных биокатолизаторов. Не исключено, что одним из путей решении итого вопроса полнотел получение полипептидом регулярного строения, содержащих полифункциональные аминокислоты.
К настоящему времени опубликованы роботы, в которых исследовалась эсторознол активность как смеси аминокислот, так и синтетических олиго- и полипептидов равного строения, а также изучалось влияние различных факторов на их гидролитическую активность [3—10). Интерес к такому роду а работам более возрастает. 1.1, в предыдущих роботах [2,9] мы сообщали, что
полипептиды, содержащие трифункцианальные аминокислоты, способны гидролитически расщеплять n-нитрофеинлацетат, однако скорость расщепления была на несколько порядков ниже, чем в случае про-; теолитических ферментов.
Структурные исследования показали, что каталитической активность о случае регулярных полипептидов мало зависит от упорядоченности структуры. Поэтому в данной роботе нами предпринята попытка путем варьирования аминокислотной последовательности существенно повысить каталитическую активность полипептидов. С этой целью было синтезированы 6 полипептидов регулярного строения: (His-Glu)n (I), (His-Ser-Glu)n (II), (Ala-Tyr-Glu)n(III), His-(Tyr-Glu)n(IV) (Glu-His- Glu)n(V), (Ser-His-Glu)n, (VI).
Синтсз полипептидов осуществляли классическими методами пептидной химии. В процессе синтеза пептидов-мономеров N-аминоогруппы аминокислот блокировали о-нитрофонилсульфенильной, кирбобензокси- и да^еда-бутилоксикарбонильной группировками, а у-карбоксильную группу глутаминовой кислоты, гидроксил фенольной группы тирозина и имида-зольную группу гистидина — бензильной группой. 2,4,5-трехфениловые эфиры N-защищенных аминокислот и пептидов синтезировали кар- бодиимидниым мотодом. Полученные защищенные пептиды очищали пере- кристаллизацией из органических растворителей и в некоторых случаях хроматографией на колонках с силикагелем марки Ll00/160 (ЧССР). Синтезированные 2,4,5-трехфениловые эфиры пептидов подвергали поли- конденсации в диметилформамиде или диметилсульфоксиде, содержащих триэтиламин, в течение 7—10 сут. Бензильные защиты с боковых функциональных групп удаляли каталитическим гидрогенолизом в присутствии палладиевой черни в течение 4 сут. Полноту удаления групп с полипептидов контролировали по исчезновению характерных полос поглощения в ИК-спектрах в области 1750, 750, 700 см-1 и в УФ-спектрах в области 245—255 нм. Следует отметить, что снятие бензильной защиты в случае His^z^^^ Glu(Bzl)n в описанных условиях проходило не полностью, поэтому пришлось увеличить время гидрирования и часто менять катализаторы.
В работе были использованы аминокислоты фирмы Кеат^енгрия). Чистота продуктов контролировалась ТСХ(на пластинках Silufol) и хроматографией па бумаге FN-14 (ГДР) в следующих системах растворителей: н-бутанол—вода - уксусная кислота, 4: I: 1 (А), н-бутанол — вода, пиридин, уксусная кислота, 3 : 2,4 : 2 :0.6 (Б), толуол — диоксан — гептан — этанол, 10:6:3: 1 (В), бензол — этанол, 2:1 (Г), хлороформ - метанол. 60:13 (Д). Пептиды детектировали парами иода и 0,5% раствором нингидрина в ацетоне.
Промежуточные соединения Вос-Ak-OH, Boc-Tyr(Bzl)-OH, Nps-Giu(Bzl)-ОТср, Z2-His-OPfp, Boc-His(Bzl)-OH, Nps-Ser-Glu(Bzl)-OTcp, (Tyr-Glu)n были получены по ранее описанным методиками. В процессе ступенчатого синтеза полипептидов Z-фуппу снимали действием HBr/CH3COOH(^.) и НВг/диоксан, Nps-фуппу- 2,5 н. НС1 в этилацетате, а Вос - 3 н. раствором HCl в эти ацетате или CF3COOH. Полипептиды выделяли из раствора осаждением из метанола эфиром, осадок промывали водой до полного удаления триэтиламмонийных солей и высушивали в вакууме. Растворители, в которых проводили гидрогенолиз, во избежание отравления катализатора выдерживали над никелем Ренея. Полученные свободные полипептиды очищали гель-фильтрацией на колонке (40х1,5 см) с сефадексом LH-20 ( 25-100 мкм). В качество элюента использовали смесь диоксан - вода (1:1). Очищенные таким образом полипептиды фракциони ровали на калиброванной маркерными белками колонке(60х2см) с сефадексом G-50 со скоростью 12 мл/ч (рис. 1). что позволило определять молекулярные массы фракций.
1. Boc-His(BzJ)Ser-Glu(BzJ)-OTcp (1).К раствору 1,59 г (3,08 ммоль) Вос-Ш^^ЮН 0,94 г (4,50 ммоль) DCC в 30 мл тетрагидрофурана при интенсивном перемешивании и охлаждения до -5° С прибавили 2,5 г (5,5 ммоль) HCl*Glu (^!)-ОТср и 0.77 мл (5,5 ммоль) Et3N и перемешивали 2 ч при 0°С. Затем перемешивание проводили 4 ч при 18° С п реакционную смесь оставили на 8 ч, после чего раствор отфильтровали от дициклогексилмочевина, растворитель выпарили, остаток растворили в 40 мл хлороформа и промыли 10% лимонной кислотой, водой, 0,5 н. NaHCO3, водой и осушили над Na2SO4. Растворитель упарили, остаток хроматографировала на колонке (2,5х100 см) с силикагелем L100/160 в системе Г, получили 3 г (98,4%) маслообразного продукта (VII), Rf 0,30 (А), 0,72 (Г). ГаЪ20 -160(с 2,CHCh)
2. Boc-His(Bzl)-Glu(Bzl)-OTcp (Ц)получали аналогпчио методики 1, исходя из 1,73 г (5 ммоль) Boc-His(Bzl)-0H, 2.26 г (5 ммоль) HCl-Glu^z^-O^, 1,03 г (5 ммоль) DC^ 0,7 мл (5 ммоль) Et3N; реакцию проводили в 20 мл хлороформа. Получили 3 г (81%) маслообразного продукта (VIII). Rf 0,44 (В), 0,09 (Д), 0,84 (Б).
ГаЪ -5,260(с 2, DMF)
3. Boc-Tyr(Bzl)-Glu(Bzl)-OTcp (III). К охлажденному до -5° С раствору 2.5 г (0.73 ммоль) Вос-Туг(^!)-ОН и 1,0 г (7,8 ммоль) D^ в 20 мл тетрагидрофурана добавили 3 г (0,03 ммоль) HCl-GIu (^!)-ОТср и 0,92 мл (6,63 ммоль) Et3N. Реакционную смесь перемешивали 2 ч при этой же
температуре, 4 ч при 200 С и оставили па 14 ч при 18 С. Затем раствор отфильтровали, растворитель выпарили досуха в вакууме, а остаток растворили в 35 мл этилацетата и промыли 5% раствором лимонной кислоты, водой и 0,5 н. NaHCO3 водой над Na2SO4. Растворитель упарили в вакууме досуха, получили 4,36 г маслообразного продукта (IX). ). Rf 0,96 (А), 0,76 (Б), [аЬ20 -6,940(с 4, этилацетат)
HCl-His(Bzl)-Scr-Glu(Bzl)-OTcp(IV). К раствору 4 г (4.82 ммоль) продукт (VII) в 20 мл абсолютного этилацетата добавили 3,33 мл 3 н. HCI и этилацетат. Через 1 ч продукт осадили сухим эфиром, осадок отфильтровали, промыли эфиром п высушили под вакуумом. После перекристаллизации из сухого ацетона получили 2,5 г (67,5%) кристаллического продукта. Т. пл. 150° С, Я/ 0,13 (А), 0,18 (Д).
HCl-His(Bzl)-Glu(Bzl)-OTcp(V) получали аналогично методике 7, исходя пз 4,34 г (5,9 ммоль) продукта (VIII) и 4,8 мл (2 ммоль) 2,5 н. НС1 в этилацетата. После добавления эфира выпадает тестообразная масса, которая кристаллизируется при растворение с сухим эфиром. Выход 3 г (74,7%). #0.13. (Д). Т. пл. 79—80 С.
CFsCOOIITyr(Bzl)-Glu(Bzl)-OTcp(VI).K раствору 4,3 г» (5,59 ммоль) продукта (IX) в 10 мл СНгСЬ добавили 2 мл (1,5 экв.) CF3COOlI, энергично перемешаем и оставили на 40 мл при 20°С. После этого добавили абсолютным бензол и упарили в вакууме досуха; эту операцию повторили несколько раз. Осадок несколько раз промыли декантацией абсолютным эфиром. Получили 3,5 г (80%) маслообразного продукта (XV). #0,64 (А), 0,9 (В), [а]р +8, 67° (с 4, этил ацетат),
[Hls(Bzl)-Glu(Bzl)]n(VII) получали аналогично мотодико 13, исходи из 2 г (2,94 ммоль) продукта (V), 0,8 мл (5,7 ммоль) EtaNt 2 мл DMF. Выход 3 г (60,7%).
Tyr(B2l)-Glu(Bzl)n (VIII) получили по мотодике 15, переходя из 1,2 г 4U4 ммоль) продукта (V7), 0,36 мл (2,57 ммоль) Et3№ 1,2 мл DMF. Получили: продукт очищали гель-фильтрацией па сeфадекс LH-20. Выход 0,53 г.
(His-Glu)n - 1 г продукта (VII) растворили в метаноле и гидрировали над - палладиевой чернью 4 ст. при 18 С. Катализатор отделили фильтрованием, а продукт осаждали смесью метанол-эфир(1:3). после 3-часового диализа против воды и очистки гель-фильтрацией на сефадексах LH-20, G20, функционирования на сефадексе G50 и лиофилизации получили 0,2 г (32,8 %) продукта.
ЛИТЕТАТУРА
1. Вольпина О.м., Михалева И.И., Иванов В.Т.// Биоорган. химия, 1982. -Т 8. -№1. -С.5-43.
2. Шибнев В.А., Исмаилов М.И., Халиков Ш.Х // Химия природ. соединений. 1979. -№1. -с. 987-699.
3. Fax I. L// Chem and Eng/ News. 1983. v.61. 7. P.33-34.
4. Goren H.J., Fletcher T.// Biopolymers/ 1978. V. 17. P.1679-1692.
5. Pets D., Schneider F.// FEBS Lett/ 1976. V. 167. №>1. P. 32-35.
6. Noguchi J., Yamamoto H//J. Biochem .1969. V.65. №1 .P. 123-132.
7. Yamamoto H., Noguchi J.// J. Biochem .1971. V.70. №1.P. 103-111.
8. Komai T., Noguchi J. J. Biochem .1971. V.70. №3.P. 467-476.
9. Халиков Ш.Х., Алиева С.В., Валиев Р.// Химия природ. соединений, 1984. -.№4. -С. 503-506.
10. Photaki I., Bardanos V.// Chem. communs. 1967. P. 257.
СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДОВ СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ
Описываются синтез и исследование каталитических своств серии полипептидов регулярного строения, включающих остатки полифункциональных аминокислот, входящих в активный центр эстераз: (Ala-Tyr-Glu)n, (His-Ser-Glu)„, (His-Glu-Glu)„, (His-Glu)„, (Ser-His-Glu)n и His-(Tyr-Glu)n. Мономеры для реакции поликонденсации синтезированы карбамидным методом в растворе, полипептиды получены с помощью 2,4,5-трихлорфениловых эфиров.
Ключевые слова: синтез, аминокислот, дипептид, полипептид, полифункциональных аминокислот, активный сентр, поликонденсация, эстераз
THE SYNTHESIS OF REGULAR POLYPEPTIDES CONTAINING POLYFUNCTIONS AMINO ACIDS
Synthesis of series of regular polypeptide which contains residues of polyfunctional amino acids forming the active centre of esterases are described viz (Ala-Tyr-Glu)n (His-Ser-Glu)n (His-Glu-Glu)n (His-Glu)n, (Ser-His-Glu)n, His-(Tyr-Glu)n.
Monomers for polycondensation were synthesized by carbodiimide method in solution, and polypeptids were obtained via 2,4, 5- trichlorphenylates.
Key words: synthesis, amino acids, dipeptide, polypeptide, polyfunctional amino acids, active center, polycondensation, esterases
