Пространственное строение некоторых олигопептидов по данным CP/MAS ямр 13С спектроскопии в твердой фазе Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

Том 151, кн. 1

Естественные науки

2009

УДК 541.12.038.2:536.75:536.728

ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ОЛИГОПЕПТИДОВ ПО ДАННЫМ CP/MAS ЯМР 13С СПЕКТРОСКОПИИ В ТВЕРДОЙ ФАЗЕ

А.В. Клочков, А.Р. Юльметов, Р. Ф. Байкиев, Ф.Р. Мухамадиев, В. В. Клочков

Аннотация

Установлена конформация основных цепей олигопептидов Glu-Trp, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr и nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe в твердой фазе по CP/MAS ЯМР 13С спектрам этих соединений в порошке. На основе сравнительного анализа величин ЯМР 13С химических сдвигов aCH или aCH2 углеродных атомов олигопептидов в растворе и порошке определены конформации цепей олигопептидов в твердой фазе.

Ключевые слова: ЯМР, CP/MAS ЯМР13С, твердое тело, олигопептиды, конфор-мации.

Введение

Известно, что биологическая активность протеинов или белков связана с их пространственным строением. Изучение конформаций олигопептидов, содержащих в цепи от двух и более аминокислотных остатков, также важно, поскольку их можно рассматривать в качестве структурных блоков протеинов, и знание их строения может быть использовано для предсказания конфигурации цепей полипептидов [1, 2].

Ранее [3-6] с использованием подхода, основанного на анализе величин констант остаточного диполь-дипольного взаимодействия [7, 8] между магнитными ядрами С и Н, разделенными одной химической связью ( D), определено пространственное строение олигопептидов Glu-Trp, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr и nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe в растворе D^ (рис. 1). Для всего ряда этих систем получены координаты атомов [3-6], определяющих химический состав олигопептидов, которые, в дальнейшем, могут быть использованы при сравнении с координатами атомов аналогичных аминокислотных последовательностей, входящих в состав полипептидов или белков. Данные о координатах атомов протеинов в подавляющем большинстве случаев определяются методом рентгеноструктурного анализа в твердой фазе. Отсюда задача определения структурных параметров олигопептидов в твердой фазе независимыми методами имеет важное значение. Данная статья посвящена установлению конформаций основных цепей некоторых олигопептидов в твердой фазе методом CP/MAS ЯМР 13С спектроскопии.

в1и-Тгр (глютомат-триптофан) 01у-в1у-в1у (триглицин)

01у-в1у-Ш8 (глицин-глицин-гистидин) в1у-в1у-Туг (глицин-глицин-тирозин)

пЛс-8ег-РЬе-УаЮ1у-0Ме (ацетилсерин-фенилаланин-валин-оксиметилглицин)

Рис. 1. Конформации олигопептидов в1и-Тгр, 01у-в1у-в1у, в1у-в1у-Н18, в1у-в1у-Туг и пЛс-8ег-РИе-Уа1-01у-0Ме, для которых наблюдалось лучшее соответствие между наблюдаемыми и рассчитанными значениями остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия [3-6]

Экспериментальная часть

Спектры ЯМР 13С CP/MAS (75.43 МГц) олигопептидов Glu-Trp, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr и nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe в твердом состоянии (порошок) сняты при комнатной температуре на ЯМР-спектрометре "Unity-300" фирмы "Varian" с использованием датчика фирмы "Doty Scietific". Регистрация спектров проводилась при скоростях вращения 4.5 кГц. Число накоплений - от 64. В качестве внешнего стандарта использовался ЯМР-сигнал адамантана.

Обсуждение результатов

Спектры ЯМР 13С CP/MAS (75.43 МГц) олигопептидов, таких, как дипеп-тид Glu-Trp (глютомат-триптофан); трипептиды Gly-Gly-Gly (триглицин), Gly-Gly-His (глицин-глицин-гистидин), Gly-Gly-Tyr (глицин-глицин-тирозин); тетрапептид nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe (ацетилсерин-фенилаланин-ва-лин-оксиметилглицин) получены для твердой фазы. Результаты сравнительного анализа величин химических сдвигов 13С aCH или aCH2 углеродных атомов олигопептидов в растворе и порошке позволили установить их пространственное строение в твердой фазе. С одной стороны, эти соединения могут рассматриваться как модельные, поскольку найденные координаты всех атомов, входящих в их состав, могут быть непосредственно использованы в сравнении с координатами атомов аналогичных аминокислотных последовательностей, входящих в состав полипептидов или белков. С другой стороны, эти олигопеп-тиды представляют самостоятельный интерес. Так, дипептид Glu-Trp является основной составляющей лекарственного средства, повышающего работу иммунной системы пациентов [3]. Трипептиды Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His и Gly-Gly-Tyr [4, 5] являются лигандами в комплексах с Cu(II), которые используются в качестве моделей активных центров работоспособности ферментов. Тетра-пептид nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe является моделью исследования межмолекулярных взаимодействий с растворителями, поскольку, являясь коротким пептидом, он содержит как ароматическую, так и алифатическую составляющие, а также полярные группы [9].

ЯМР 13С спектр дипептида Glu-Trp (рис. 2) в растворе D2G описан в работе [3] и состоит из десяти синглетных сигналов (нами рассматривались лишь ме-тиновые и метиленовые атомы углеродов), химические сдвиги которых сведены в табл. 1.

Для установления конформации основной цепи дипептида Glu-Trp в твердой фазе были сняты и проанализированы CP/MAS ЯМР 13С спектры соединений в порошкообразном состоянии. Неизменность величин химических сдвигов 13С олигопептидов в растворе и твердой фазе позволяла бы утверждать о неизменности конформации при переходе из одного фазового состояния в другое, поскольку отличие в конформациях привело бы к существенным различиям в химических сдвигах (от 3 до 7 м. д.) [10, 11].

Glu | Trp

Рис. 2. Структурная формула дипептида Glu-Trp (глютомат-триптофан)

Табл. 1

Химические сдвиги ЯМР 13С атомов углерода (8С, м. д., относительно ТМС) для дипептида в1и-Тгр в изотропном растворителе и твердой фазе

Среда a CH Glu в CH2 Glu Y CH2 Glu a CH Trp в CH2 Trp 2-CH Trp 4-CH Trp 5-CH Trp 6-CH Trp 7-CH Trp

Б2О 52.35 26.20 30.15 55.45 26.75 124.20 119.40 118.55 121.8 111.60

твердая фаза 47.9 22.6 23.9 54.8 23.9 125.1 118.7 115.3 120.4 111.2

120 100 80 60 40 [ррпп]

Рис. 3. CP/MAS ЯМР 13C (75.43 МГц) спектр дипептида Glu-Trp. Скорость вращения образца - 4.5 кГц; четыре сигнала с 8С от 58 до 78 м. д. - «боковые вращения» основных сигналов

I |

Gly i Gly j Gly

■ i

O O

Н

о

Рис. 4. Структурная формула трипептида 01у-в1у-в1у (триглицин)

Рис. 5. Фрагмент ЯМР 13С (75.43 МГц) спектра (без развязки от протонов) триглицина в изотропном растворителе ф2О); сигналы относятся к углеродным СН2-группам фрагментов в!у [4]

Табл. 2

ЯМР 13С и CP/MAS ЯМР 13С химические сдвиги атомов углерода (8С, м. д., относительно ТМС) для триглицина в изотропном растворителе и твердой фазе

Среда 1 ac C=O; CH2 2 ac C=O; CH2 3 ac C=O; CH2

Б2О 167.7; 41.4 170.8; 42.2 176.4; 42.9

твердая фаза 167.0; 42.5* 171.0; 42.5* 175.0; 42.5*

*Наблюдается один уширенный сигнал с 8С = 42.5 м. д.

На рис. 3 приведен CP/MAS ЯМР 13С спектр дипептида Glu-Trp, а в табл. 1 -значения химических сдвигов дипептида в твердой фазе. Как следует из данных таблицы, переход от раствора к твердой фазе приводит к существенному изменению значений химических сдвигов атомов углеродов (до 5 м. д.) дипептида Glu-Trp, что не позволяет говорить об идентичности конформеров дипептида в этих фазовых состояниях.

ЯМР С спектр триглицина (рис. 4), растворенного в Б2О, состоит из шести синглетных сигналов, снятых в условиях развязки от протонов (рис. 5), химические сдвиги которых сведены в табл. 2. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР Н и С сделано ранее, в соответствии с литературными данными [4, 10].

С целью установления конформации триглицина в твердой фазе были сняты и проанализированы CP/MAS ЯМР 13С спектры Gly-Gly-Gly в порошкообразном

I I

Gly | Gly \ His

Табл. 3

ЯМР 13С и CP/MAS ЯМР 13С химические сдвиги алифатических атомов углерода для Gly-Gly-His в изотропном растворителе и твердой фазе

Среда aCH2 Gly 1 aCH2 Gly 2 aCH His PCH2 His yCH His 5CH His

Б2О 40.4 41.5 54.1 27.9 116.7 134.3

твердая фаза 39.4 41.0 55.0 29.0 116.2 136.0

состоянии. Близость величин ЯМР 13С химических сдвигов Gly-Gly-Gly в растворе этим величинам в твердой фазе (табл. 2) позволяет однозначно утверждать о неизменности конформации при смене фазового состояния.

Химические сдвиги алифатических атомов углерода Gly-Gly-His (рис. 6) приведены в табл. 3. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 13С было сделано ранее, также в соответствии с литературными данными [5, 10].

Были сняты и проанализированы CP/MAS ЯМР 13С спектры соединения в порошкообразном состоянии. Хорошее соответствие величин ЯМР 13С химических сдвигов Gly-Gly-His в растворе аналогичным величинам в твердой фазе (табл. 3) позволяет утверждать об идентичности конформаций основной цепи трипептида при переходе из одного фазового состояния в другое.

ЯМР 13С химические сдвиги алифатических атомов углерода Gly-Gly-Tyr (рис. 7) приведены в табл. 4. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР 13С также сделано ранее в соответствии с литературными данными [5, 10].

Близость величин ЯМР 13С химических сдвигов Gly-Gly-Tyr в растворе и твердой фазе (CP/MAS ЯМР 13С, табл. 4) позволяет утверждать о неизменности конформации глицин-глицин-тирозина при переходе из одного фазового состояния в другое.

ЯМР 13С спектр тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-Ome (рис. 8), растворенного в Б2О, состоит из десяти синглетных сигналов (рассматривались лишь метиновые и метиленовые атомы углеродов), химические сдвиги которых сведены в табл. 5. Отнесение сигналов в ЯМР 13С спектрах тетрапептида было сделано на основании использования двумерной ЯМР-спектроскопии (COSY и HSQC модификации) [6, 12].

I I

I I

I I

Gly i Gly i Tyr

I I

I I

Табл. 4

ЯМР 13С и CP/MAS ЯМР 13С химические сдвиги алифатических атомов углерода (8С, м. д. относительно ТМС) для Gly-Gly-Tyr, растворенного в изотропном растворителе и твердой фазе

Среда aCH2 Gly 1 aCH2 Gly 2 aCH Tyr PCH2 Tyr yCH Tyr 5CH Tyr

D20 40.4 42.2 56.4 36.7 115.2 130.6

твердая фаза 40.7 43.1 57.7 36.6 115.3 129.0

Ser

HO в

Val

о

\

CH2

Phe Y Y

H3C ^CH о CH в

Gly

о

N H

la H a II

,CH N ^

X CH

о в CH2

I H II

CH N .CH3

H || H2

о

Z

H3C

5

8

e

e

Рис. 8. Структурная формула тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-Ome (ацетилсерин-фенилаланин-валин-оксиметилглицин)

Табл. 5

ЯМР 13С и CP/MAS ЯМР 13С химические сдвиги алифатических атомов углерода (8С, м. д. относительно ТМС) для тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe, растворенного в изотропном растворителе и твердой фазе

Среда a CH Ser в CH2 Ser a CH Phe в CH2 Phe 2,6-CH Phe 3,5-CH Phe 4-CH Phe a CH Val в CH Val a CH2 Gly

D2O 54.3 59.9 55.1 36.9 128.6 129.0 127.0 59.1 30.1 40.9

твердая фаза 55.0 60.0 55.0 36.9 126.9; 126.3 131.0 124.4 59.4 29.8 40.8

200 175 150 125 100 75 50 25

Рис. 9. CP/MAS ЯМР 13C (75.43 МГц) спектр тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe. Скорость вращения образца - 4.5 кГц

Пространственное строение тетрапептида nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe в твердой фазе устанавливали по CP/MAS ЯМР 13С спектрам соединения в порошкообразном состоянии. На рис. 9 приведен CP/MAS ЯМР 13С спектр nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe, а в табл. 5 - значения химических сдвигов тетрапептида в твердой фазе. Неизменность величин ЯМР 13С химических сдвигов тетрапептида в растворе и твердой фазе также позволяет утверждать о неизменности конформации основной цепи nAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe при переходе из одного фазового состояния в другое.

Таким образом, в четырех из пяти случаев изменение фазового состояния (раствор и твердая фаза) не привело к существенным изменениям величин ЯМР 13С химических сдвигов aCH или aCH2 углеродных атомов исследованных олигопептидов. Очевидно, что в случае твердой фазы к внутримолекулярным механизмам, определяющим значения химических сдвигов, должны добавляться и межмолекулярные (эффекты упаковки, относительная ориентация молекул в узлах решетки молекулярного кристалла и т. п.). Тем не менее, как следует из эксперимента, существенных изменений химических сдвигов в рамках каждого из соединений не наблюдалось. Все это позволяет говорить о неизменности конформаций основных цепей олигопептидов при переходе из одного фазового состояния в другое и использовать координаты атомов, определяющих химический состав олигопептидов, найденные с использованием подхода, который основан на анализе величин констант остаточного диполь-дипольного взаимодействия в твердой фазе.

Работа выполнена при поддержке РФФИ и программы РНП Высшей школы Министерства образования РФ.

Summary

A.V. Klochkov, A.R. Yulmetov, R.F. Baikeev, F.R. Muhamadiev, V.V. Klochkov. A Spatial Structure of the Some Oligopeptides in Solid State Determined by CP/MAS NMR 13С Spectroscopy.

Conformation of main oligopeptide chains, such as Glu-Trp, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-His, Gly-Gly-Tyr and nAc-Ser-Phe-Val-Gly-Ome, was determined in solid state by CP/MAS NMR 13С spectra of these compounds in powder. Comparative analysis of NMR 13С chemical shift values for aCH or aCH2 carbons of the oligopeptides in solution and in powder allowed determining the oligopeptide chain conformations in solid state.

Key words: NMR, CP/MAS NMR 13С, solid state, oligopeptides, conformations.

Литература

1. Bradley E.K., Kerr J.M., Richter L.S., Figliozzi G.M., Goff D.A., Zuckermann R.N., Spellmeyer D.C., Blaney J.M. NMR structural characterization of oligo-N-substituted glycine lead compounds from a combinatorial library // Molecular Diversity. - 1997. -V. 3. - P. 1-15.

2. Anishetty S., Pennathur G., Anishetty R. Tripeptide analysis of protein structures // BMC Struct. Biol. - 2002. - V. 2. - P. 1472-1507.

3. Klochkov V.V., Baikeev R.F., Skirda V.D., Klochkov A.V., Muhamadiev F.R., Baskyr I., Berger S. Spatial structure of peptides determined by residual dipolar couplings analysis // Magn. Reson. Chem. - 2009. - V. 47, No 1. - P. 57-62.

4. Klochkov V.V., Khairutdinov B.I,. Klochkov A.V., Shtyrlin V.G., Shaykhutdinov R.A. A spatial structure of triglycine determined by the residual dipolar couplings analysis // Appl. Magn. Reson. - 2003. - V. 25, No 1. - P. 113-119.

5. Клочков А.В., Шамсутдинов М.Н., Валеев Б.К., Юльметов А.Р., Зявкина Ю.И., Штырлин В.Г., Клочков Ал.В., Скирда В.Д., Клочков В.В. Пространственное строение некоторых трипептидов в лиотропных средах, растворах и твердой фазе по данным ЯМР спектроскопии // XIII Всерос. конф. «Структура и динамика молекулярных систем»: Сб. ст. - Казань - Москва - Йошкар-Ола - Уфа, 2006. - Ч. 1. - С. 406-410.

6. Клочков В.В., Скирда В.Д., Клочков А.В., Бергер С. Пространственное строение тет-рапептида NAc-Ser-Phe-Val-Gly-OMe определенное путем анализа констант остаточного диполь-дипольного взаимодействия // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2007. - Т. 149, кн. 1. - С. 21-30.

7. Tjandra N., Bax A. Direct Measurement of distances and angles in biomolecules by NMR in a dilute liquid crystalline medium // Science. - 1997. - V. 278. - P. 1111-1114.

8. Alba E., Tjandra N. NMR dipolar couplings for the structure determination of biopolymers in solution // Progress in NMR Spectroscopy. - 2002. - V. 40. - P. 175-197.

9. DiazM.D., Berger S. Preferential Solvation of a Tetrapeptide by Trifluorethanol as Studied by Intermolecular NOE // Magn. Reson. Chem. - 2001. - V. 39, No 7. - P. 369-373.

10. Breitmaier E., Woelter W. 13C NMR spectroscopy. Methods and application in organic chemistry. - Weinheim, New York.: Verlag Chemie, 1978. - 322 p.

11. Wuthrich K. NMR of Proteins and Nucleic Acids. - N. Y.: Wiley-VCH, 1986. - 396 p.

12. Berger S., Braun S. 200 and More NMR Experiments. - Weinheim: Wiley-VCH, 2004. -853 р.

Поступила в редакцию 13.11.08

Клочков Антон Владимирович - аспирант кафедры молекулярной физики Казанского государственного университета.

Юльметов Айдар Рафаилович - кандидат физико-математических наук, инженер кафедры общей физики Казанского государственного университета.

Байкиев Рустем Фрунзевич - доктор медицинских наук, профессор кафедры биохимии Казанского государственного медицинского университета.

Мухамадиев Фархат Рифатович - лаборант кафедры биохимии Казанского государственного медицинского университета

Клочков Владимир Васильевич - доктор химических наук, профессор кафедры общей физики Казанского государственного университета.

E-mail: vladimir.klochkov@ksu.ru