CC BY
18
https://doi.org/10.17116/molgen201937041173
Поиск и отбор бактериоцин-продуцирующих штаммов морских бактерий из экосистем акваторий Японского моря
© В.В. МИХАЙЛОВ1, Б.Г. АНДРЮКОВ2, И.Н. ЛЯПУН2
'Минобрнауки России «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН, Владивосток, Россия, 690022; 2Минобрнауки России «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова», Владивосток, Россия, 690087
Резюме
В условиях нарастающей антибиотикорезистентности патогенных бактерий ведется активный поиск альтернативных антимикробных стратегий. Одним из перспективных направлений является изучение антибактериальной активности бакте-риоцинов, особых пептидов, продуцируемых бактериями, играющих важную роль в регулировании конкурентных меж- и внутривидовых взаимоотношений в естественных микробных системах. Морские микроорганизмы — богатый и перспективный источник бактериоцинов. Морские экосистемы содержат огромное разнообразие организмов, до 90% которых составляют бактерии, обитающие в высококонкурентных и экстремальных условиях. Выделение и изучение антибактериальной активности бактериоцинов морского происхождения — перспективное и малоисследованное направление инновационных биотехнологий. В статье приводятся результаты проведенного авторами пилотного исследования по поиску и отбору бактериоцин-продуцирующих штаммов морских бактерий из экосистем акваторий Японского моря. В составе кластеров Pseudoalteromonas elyakovii, Cobetia amphilecti, Paraglaciecola mesophila и Idiomarina abyssalis обнаружены гены, схожие с участками ДНК Escherichia coli E. K12: J62, участвующими в биосинтезе колицинов (microcin V MccV). Это дает основание предполагать бактериоциногенный потенциал у исследованных штаммов морских бактерий. Последующее выделение и изучение биологической активности этих пептидов позволит сделать вывод о биологических свойствах и механизмах антагонистического действия этих важных соединений и перспективах их использования в промышленном разведении морепродуктов (марикультуры), а также в медицинских и ветеринарных целях.
Ключевые слова: антибиотикорезистентность, морские бактерии, бактериоцины, метагеномный анализ.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Михайлов В.В. — e-mail: mikhailov@piboc.dvo.ru; https://orcid.org/0000-0001-8332-063X Андрюков Б.Г. — e-mail: andrukov_bg@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4456-808X Ляпун И.Н. — e-mail: irina-lyapun@list.ru; https://orcid.org/0000-0002-5290-3864
АВТОР, ОТВЕТСТВЕННЫЙ ЗА ПЕРЕПИСКУ: Андрюков Б.Г. — e-mail: andrukov_bg@mail.ru
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Михайлов В.В., Андрюков Б.Г., Ляпун И.Н. Поиск и отбор бактериоцин-продуцирующих штаммов морских бактерий из экосистем акваторий Японского моря. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):173-177. https://doi.org/10.17116/ molgen201937041173
Search and selection bacteriocin-producing strains of marine bacteria ecosystem of the Japan sea regions
© V.V. MIKHAILOV1, B.G. ANDRYUKOV2, I.N. LYAPUN2
'Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok, Russia, 69022; 2Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia, 690087
Abstract
Under the conditions of increasing antibiotic resistance of pathogenic bacteria, an active search for alternative antimicrobial strategies is being conducted. One of the promising areas is the study of the antibacterial activity of bacteriocins, special peptides produced by bacteria, which play an important role in regulating the competitive inter- and intraspecific relationships in natural microbial systems. Marine microorganisms are a rich and promising source of bacteriocins. Marine ecosystems contain a huge variety of organisms, up to 90% of which are bacteria living in highly competitive and extreme conditions. Isolation and study of the antibacterial activity of bacteriocins of marine origin is a promising and unexplored direction of innovative biotechnology. The article presents the results of a pilot study conducted by the authors on the search and selection of bacteriocin-producing, strains of marine bacteria from ecosystems of the Sea of Japan. Pseudoalteromonas elyakovii, Cobetia amphilecti, Paraglaciecola mesophila and Idiomarina abyssalis clusters contain genes similar to Escherichia coli K12: J62 DNA, which are involved in the biosynthesis of colicins (microcin V MccV). This suggests a bacteriocinogenic potential in the studied strains of marine bacteria. The subsequent isolation and study of the biological activity of these peptides will make it possible to draw a conclusion about the biological properties and mechanisms of the antagonistic action of these important compounds and the prospects for their use in industrial breeding of seafood (mariculture), as well as in medical and veterinary purposes.
Keywords: antibiotic resistance, marine bacteria, bacteriocins, metagenomic analysis.
INFORMATION ABOUT AUTHORS
Mikhailov V.V. — e-mail: mikhailov@piboc.dvo.ru; https://orcid.org/0000-0001-8332-063X Andryukov B.G. — e-mail: andrukov_bg@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4456-808X Lyapun I.N. — e-mail: irina-lyapun@list.ru; https://orcid.org/0000-0002-5290-3864
CORRESPONDING AUTHOR:
Andryukov B.G. — e-mail: andrukov_bg@mail.ru
TO CITE THIS ARTICLE:
Mikhailov VV, Andryukov BG, Lyapun IN. Search and selection bacteriocin-producing strains of marine bacteria ecosystem of the Japan sea regions. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2019;37(4):173-177 (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen201937041173
Как и прочие микроорганизмы, бактерии обладают защитными механизмами, которые позволяют им выживать в конкурентной борьбе в своих экосистемах. В процессе внутри- и межвидовых взаимодействий прокариоты синтезируют ряд вторичных метаболитов, обладающих ингибирующей или бактерицидной активностью и являющихся одним из факторов поддержания микробного биоразнообразия [1—3]. К ним относятся бактериоцины, представляющие собой многочисленную и гетерогенную по размеру, структуре и механизму биологической активности группу рибосомально синтезированных антимикробных пептидов. В отличие от традиционных антибиотиков, которые имеют широкий спектр действия, бактериоцины токсичны только в отношении близкородственных видов бактерий [1, 4, 5].
Эти пептиды являются предметом повышенного внимания в качестве натуральных пищевых консервантов и потенциальной альтернативы современным антимикробным средствам [3, 5, 6]. Кроме того, бактерио-циногенез является ключевым признаком бактериальных штаммов, используемых в качестве пробиотиков, обеспечивающих нормализацию состава нормальной микрофлоры кишечника [2, 3, 5, 7].
Выработка бактериоцинов широко распространена в природе. Практически все бактерии и археи, известные на сегодняшний день, способны выделять в окружающую среду антимикробные пептиды, большинство из которых пока не идентифицировано [2, 5, 6]. Наиболее охарактеризованной и многочисленной группой бактериоцинов являются колицины. Они синтезируются Escherichia coli и другими членами семейства Enterobacteriaceae. Спектр антибиотической активности этих пептидов ограничивается близко родственными видами бактерий. За последние десятилетия выделено более 30 типов колицинов с различными структурой и механизмами антимикробного действия в отношении возбудителей энте-ропатогенных инфекций [2, 3, 7, 8].
Научный интерес к изучению бактериоцинов опосредован угрожающим ростом антибиотикорези-стентности бактерий, осознанием важности нормального биоценоза для здоровья человека, а также необходимостью изучения эффективности этих антими-
кробных пептидов, являющихся интересным и перспективным направлением для терапии инфекционных заболеваний [1, 2, 5, 8].
Несмотря на значительный прогресс в медицине, диагностике и лечении инфекций, патогенные микроорганизмы по-прежнему представляют серьезную угрозу для мирового сообщества. Их влияние велико как в развивающихся странах из-за ограниченного доступа к лекарствам, так и в развитых государствах, где бесконтрольное применение антибиотиков привело к широкому распространению мультирези-стентных бактерий. Стратегия создания новых синтетических антибиотиков путем модификации существующих природных средств себя не оправдывает: патогенные микроорганизмы адаптируются к новым препаратам уже после первых испытаний. Мировая общественность выражает обоснованную тревогу за будущее человечества и призывает к поиску новых антимикробных средств. Применение бактериоцинов является одной из альтернативных стратегией лечения инфекционных заболеваний [2, 6, 9].
Перспективным направлением поиска новых бактериоцинов стало изучение антимикробной активности продуктов вторичного метаболизма морских бактерий, являющихся наиболее многочисленной и разнообразной группой живых организмов экосистем Мирового океана [1, 10—12]. Они существуют в условиях высокой конкуренции за пространства и ресурсы и служат перспективным источником бак-териоцинов, возможно, более мощных и многочисленных по сравнению с аналогичными соединениями, выделенными из бактерий других экосистем [6, 13—16].
Цель исследования — проведение поиска и отбора бактериоцин-продуцирующих штаммов морских бактерий из экосистем акваторий Японского моря.
Материал и методы
Объект исследования: морские бактерии из Коллекции морских микроорганизмов (КММ) Тихоокеанского института биоорганической химии (ТИБОХ) им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, относящиеся к типам Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, родам Vibrio,
Рис. 1. Дизайн пилотного исследования.
Pseudoalteromonas, Aeromonas, Alteromonas и к группе Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides акваторий Японского моря. Для исследования были выбраны следующие штаммы, принадлежащие к Phylum Proteobac-teria, классу Gammaproteobacteria:
1) Pseudoalteromonas neustonica КММ 7501 (морская вода, залив Восток, Японское море); 2) Pseudoalteromonas distincta КММ 7504 (морская вода, бухта Попова, Японское море); 3) Marinomonas arenicola КММ 7506 (морская вода, залив Восток, Японское море); 4) Marinomonas arenicola КММ 7509 (морской грунт, залив Восток, Японское море); 5) Pseudomonas zhaodongensis KMM 7507 (грунт, залив Восток, Японское море); 6) Cobetia sp. KMM 7505 (морская вода, залив Восток, Японское море); 7) Cobetia marina KMM 7508 (морская вода, залив Восток, Японское море); 8) Pantoea sp. KMM 7511 (морская вода, залив Восток, Японское море); 9) Paraglaciecola sp. KMM 7513 (морская вода, залив Находка, Японское море).
Phylum Actinobacteria: Microbacterium testaceum KMM 7512 (морская вода, залив Восток, Японское море).
Все штаммы идентифицированы с помощью полифазной таксономии [17, 18] по фено-, гено- и фи-лотипу. Ранее геномы 10 морских бактерий коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН были секвенированы (Pseudoalteromonas elyakovii
KMM 162, Winogradskyella eximia KMM 3944, Idioma-rina abyssalis КММ 227, Paraglaciecola mesophila KMM 241, Echinicola pacifica KMM 6166, Cobetia amphilecti KMM 1561, Formosa algae KMM 3553, Formosa agar-iphila KMM 3901, Flavobacterium sp. MF 4-5, Formosa sp. MF 2-3) [2, 13, 18, 19].
Дизайн пилотного исследования
Исходя из поставленной цели и решаемых задач, был разработан дизайн пилотного исследования, включающий программу и методы. Он предусматривал проведение последовательных этапов: культивирование бактерий, скрининг продуцентов бактерио-цинов и их частичную очистку, поиск потенциальных кластеров, участвующих в биосинтезе бакте-риоцинов (рис. 1).
Культивирование бактерий
Штаммы выращивали на качалке (250 об./мин) в колбах Эрленмейера (250 см3) со 100 мл питательной среды примерно 18 ч. Для приготовления сред брали простые сахара и соли. Основу питательных сред составляла отфильтрованная морская вода + 1,0—2,5% агара + солевые добавки: хлорид аммония, хлористый натрий, нитрат натрия, сернокислая медь, фосфорнокислый калий, нитрат аммония (10 ммоль л-1), казеин (10 мг мл-1). Из коммерческих сред использовался
Рис. 2. Кластер генов, участвующий в биосинтезе колицина в штамме Е. coli K12, и потенциальные кластеры генов морских бактерий Pseudoalteromonas elyakovii KMM 162, Cobetia amphilecti KMM 1561, Paraglaciecola mesophila KMM 241, Idiomarina abyssalis КММ227, участвующие в биосинтезе бактериоцинов.
Цифрами и цветом обозначены гомологичные гены
Sea Water Agar (Twin Pack, Himedia). При культивировании морских бактерий учитывались рекомендации American Public Health Association (APHA) [20].
Скрининг продуцентов бактериоцинов
Был проведен поиск продуцентов бактериоцинов среди этих штаммов бактерий.
Для анализа готовили серию разведений бактериальных клеток, максимально в 10 раз. Затем 0,1 мл каждого разведения распределяли по поверхности стерильной чашки Петри, выливали в нее питательную среду и инкубировали 18 ч. Для инактивации выросших бактерий чашки Петри переворачивали над фильтровальной бумагой, смоченной в хлороформе, и инкубировали 20—30 мин. После этого на чашку Петри наслаивали 3—5 мл жидкой агаризованной среды, содержащей 100 мкл чувствительного штамма, и инкубировали 18 ч. Затем оценивали зоны ин-гибирования роста чувствительных штаммов.
Частичная очистка бактериоцинов
Штаммы, показавшие ингибирующую способность, культивировали на жидкой питательной среде. Культу-ральную жидкость отделяли от бактериальных клеток. Потом в культуральную жидкость добавляли сульфат аммония до 70% насыщения и оставляли на магнитной мешалке при 4 °С на 24 ч. Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием при 8000 g и ресуспендировали в минимальном количестве 0,1 М Na-фосфатного буфера, рН 7,0. К полученному раствору приливали трихлоруксусную кислоту с таким расчетом, чтобы получился 5% раствор. Смесь центрифугировали при 8000 g 20 мин, осадок собирали и растворяли в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,0.
Посредством технологии in silico был проведен поиск потенциальных кластеров, участвующих в биосинтезе колицина V (microcin-V MccV). Анализ про-
водили посредством технологии in silico с помощью сервисов MG-RAST (MetaGenomics Rapid Annotation с использованием Subsystem Technology) [13] и BAGEL4 (BActeriocin GEnome mining tooL) [16].
Результаты и обсуждение
В результате анализа в штаммах морских бактерий Pseudoalteromonas elyakovii KMM 162, Cobetia amphilecti KMM 1561, Paraglaciecola mesophila KMM 241, Idiomarina abyssalis КММ 227 были выявлены кластеры генов, схожие с кластерами E. coli K12: J62, участвующих в биосинтезе Microcin-V, MccV. Этот бактериоцин сначала был назван колицином V (ColV). Однако из-за нескольких характеристик (низкая молекулярная масса и специализированная система секреции) он стал классифицироваться как микроцин [7].
Полученные результаты позволяют предположить, что обнаруженные кластеры генов морских бактерий Pseudoalteromonas elyakovii KMM 162, Cobetia amphilecti KMM 1561, Paraglaciecola mesophila KMM 241, Idiomarina abyssalis КММ 227 участвуют в биосинтезе микроцина-V. В составе кластеров этих бактерий выявлены гены (рис. 2), предположительно кодирующие тРНК-псевдоуридин-синтазу А, ацетил-KoA карбокситрансферазу, а также ряд белков, принимающих участие в синтезе и транслокации бакте-риоцинов (DedA-E).
При сравнительном анализе кластеров морских бактерий и тест-штамма E. coli K12: J62 принимался во внимание тот факт, что этот серотип эшерихий чаще, чем другие сероварианты, синтезирует микроцин V [7, 17].
Заключение
Морская микробиология и химия морских природных соединений развиваются в настоящее время
быстрыми темпами, являясь основой для морской биотехнологии и фармакологии. Однако успех на этом пути может быть достигнут только при фундаментальном изучении биологии морских микроорганизмов.
Результаты, полученные при проведении пилотного исследования, показали значительный бактерио-циногенный потенциал исследованных штаммов морских бактерий, что дает основание предполагать их способность синтезировать антимикробные вещества (пробиотики) и консерванты, подавляющие рост и развитие патогенных и условно-патогенных бактерий и дрожжевых грибов. Последующие очистка выделенных антибактериальных белков и изучение их биологической активности в отношении грамотри-цательной и грамположительной флоры позволят сделать вывод о биологических свойствах и механиз-
мах антагонистического действия этих важных соединений и перспективах их использования в промышленном разведении морепродуктов (марикуль-туры), а также в медицинских и ветеринарных целях.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке Комплексной программы фундаментальных исследований Дальневосточного отделения РАН «Дальний Восток», грантовый проект №18-5-099 «Молекулярные механизмы антагонистических взаимодействий бактериоцинных штаммов в микробных сообществах морских экосистем как основа новой стратегии выбора антибактериальных пептидов для использования в качестве пробиотиков».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Андрюков Б.Г., Михайлов В.В., Беседнова Н.Н., Запорожец Т.С. и др. Бактериоциногенный потенциал морских микроорганизмов. Биология моря. 2018;44(6):371-380.
Andryukov BG, Mikhailov VV, Besednova NN, Zaporozhets TS i dr. Bac-teriocinogenic potential of marine microorganisms. Russian Journal of Marine Biology. 2018;44(6):371-380. (In Russ.). https://doi.org/10.1134/S0134347518060013
2. Михайлов В.В., Пивкин М.В. Изучение морских бактерий и грибов. Некоторые результаты и перспективы исследования. Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2014;1(173):149-156. Mikhailov VV, Pivkin MV. The study of marine bacteria and fungi. some results and prospects of research. Vestnik of the Far East Branch of the Russian Academy of Sciences. 2014;1(173):149-156. (In Russ.).
3. Chikindas ML, Weeks R, Drider D, Chistyakov VA, Dicks LM. Functions and emerging applications of bacteriocins. Curr Opin Biotechnol. 2017;49: 3-28. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2017.07.011
4. Offret C, Desriac F, Le Chevalier P, et al. Spotlight on Antimicrobial Metabolites from the Marine Bacteria Pseudoalteromonas: Chemodiversity and Ecological Significance. Mar Drugs. 2016;14(7):129. https://doi.org/10.3390/md14070129
5. Андрюков Б.Г., Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н. Перспективные стратегии поиска новых средств борьбы с инфекционными заболеваниями. Антибиотики и химиотерапия. 2018;63(1-2):44-55.
Andryukov BG, Zaporozhets TS, Besednova NN. Promising strategies for finding new means of combating infectious diseases. Antibiotics and Chemotherapy. 2018;63(1-2):44-55. (In Russ.). https://doi.org/10.5281/zenodo.1306245
6. Böhringer N, Fisch KM, Schillo D, et al. Antimicrobial Potential of Bacteria Associated with Marine Sea Slugs from North Sulawesi, Indonesia. Front Microbiol. 2017;8:1092. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01092
7. Jeziorowski A, Gordon DM. Evolution of microcin V and colicin Ia plas-mids in Escherichia coli. J Bacteriol. 2007;189(19):7045-7052. https://doi.org/10.1128/JB.00243-07
8. Wojdyla JA, Papadakos G, Kleanthous C. Nuclease colicins: mode of action, immunity and mechanism of import into escherichia coli. In: The bacteriocins: current knowledge and future prospects. Ed.: Dorit R.L., Roy S.M., Riley M.A. USA: Caister Academic Press; 2016.
9. Chen E, Chen Q, Chen S, et al. Mathermycin, Lantibiotic marine Actino-mycete Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652. Appl Environ Mi-crobiol. 2017;83(15):e00926-17. https://doi.org/10.1128/AEM.00926-17
10. Keegan KP, Glass EM, Meyer F. MG-RAST, a Metagenomics Service for Analysis of Microbial Community Structure and Function. Methods Mol Bi-ol. 2016;1399:207-233.
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3369-3_13
11. Nguyen VD, Pham TT, Nguyen TH, Nguyen TT, Hoj L. Screening of marine bacteria with bacteriocin-like activities and probiotic potential for ornate spiny lobster (Panulirus ornatus) juveniles. Fish Shellfish Immunol.
2014;40(1):49-60.
https://doi.org/10.1016/j.fsi.2014.06.017
12. Ahmad V, Khan MS, Jamal QMS, et al. Antimicrobial potential of bacteriocins: in therapy, agriculture and food preservation. International Journal of Antimicrobial Agents. 2017;49(1):1-11.
https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2016.08.016
13. Application of a Quality Management System Model for laboratory services; approved guideline. 3rd edition. CLSI/NCCLS document GP26-A3. Wayne, PA, NCCLS. 2004;196.
14. Ghequire MGK, De Mot R. Turning Over a New Leaf: Bacteriocins Going Green. Trend Microbiol. 2018;26(1):1-2. https://doi.org/10.1016/j.tim.2017.11.001
15. Chau Nguyen Dang Giang, Sebesvari Z, Renaud F, et al. Occurrence and Dissipation of the Antibiotics Sulfamethoxazole, Sulfadiazine, Trimethoprim, and Enrofloxacin in the Mekong Delta, Vietnam. PLoS One. 2015;10(7):e0131855.
16. de Jong A, van Hijum SA, Bijlsma JJ, Kok J, Kuipers OP. BAGEL: a web-based bacteriocin genome mining tool. Nucleic Acids Res. 2006;34(Web Server issue):273-279.
17. Langa S, Arqués JL, Medina M, Landete JM. Coproduction of colicin V and lactic acid bacteria bacteriocins in lactococci and enterococci strains of bio-technological interest. J Appl Microbiol. 2017;122(5):1159-1167.
https://doi.org/10.1111/jam.13439
18. Dorit RL, Roy SM, Riley MA. The bacteriocins: current knowledge and future prospects. Ed. USA: Caister Academic Press; 2016.
19. Стоник В.А., Михайлов В.В. Перспективы использования микроорганизмов окраинных морей Дальнего Востока и Арктики для поиска и практического применения природных биоактивных веществ. М.: Научно-технические проблемы освоения Арктики; 2015.
Stonik VA, Mikhailov VV. Prospects for the use of microorganisms of the marginal seas of the Far East and the Arctic for the search and practical use of natural bioactive substances. M.: Scientific and technical problems of the Arctic exploration; 2015. (In Russ.).
20. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. Ed.: Y. Salfinger and M.L. Tortorello. APHA. 2016;612.
Поступила в редакцию 14.12.18 Received 14.12.18
После доработки 22.05.19 Revised 22.05.19 Принята к публикации 29.05.19 Accepted 29.05.19
