CC BY
33
Молекулярная биология и генетика
Вестник ДВО РАН. 2019. № 5
УДК 577.112.5+577.113.5+577.151.7 DOI: 10.25808/08697698.2019.207.5.014
Л.А. БАЛАБАНОВА, МП. ИСАЕВА
Морская биохимия:
достижения и перспективы структурно-функционального исследования генов и геномов морских организмов
Приведены результаты исследований генов морского генеза с использованием геномных и генно-инженерных технологий. Даны примеры изучения биополимеров и усовершенствования методов диагностики на основе рекомбинантных гибридных бифункциональных белков, составной частью которых являются высокоактивные морские ферменты. Представлены данные по геномам морских бактерий как источника ценных ферментов и метаболитов.
Ключевые слова: морские организмы, ферменты, гибридные белки, мутагенез, геномные исследования.
Marine biochemistry: achievements and prospects of structural and functional researches of genes and genomes of marine organisms. L.A. BALABANOVA, M.P. ISAEVA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).
The results of studies on the marine origin genes using genomics and genetic engineering technologies are reported. Herein, there are examples of biopolymers investigation and improvement of diagnostic methods based on the recombinant hybrid bifunctional proteins genetically labelled by the highly active marine enzymes. The data concerning the marine bacteria genomes as a source of biotechnologically valuable enzymes and metabolites are presented.
Key words: marine organisms, enzymes, fusion proteins, mutagenesis, genomic research.
Лаборатория морской биохимии ТИБОХ ДВО РАН была организована в 1972 г. на базе группы изучения нуклеиновых кислот. Со дня основания и до 2018 г. ее бессменным руководителем был Валерий Александрович Рассказов. На протяжении длительного времени основным научным направлением лаборатории было исследование морских ферментов нуклеинового обмена, таких как нуклеазы, нуклеотидкиназы и фосфатазы. Однако позже, с активным развитием методов молекулярного клонирования с постановкой так называемого «полного цикла» - от установления нуклеотидной последовательности, конструирования генетической конструкции и до получения функционально-активного рекомбинантного белка, область научных интересов лаборатории расширилась. При активном сотрудничестве с другими подразделениями института новым направлением исследований стало изучение структуры уникальных и ценных для биотехнологии белков морских и наземных организмов. Результаты этих исследований освещены в обзорной статье В.А. Рассказова [5]. Недавние научные достижения лаборатории, рассмотренные через призму изучения и применения генов морских организмов на основе использования методов сайт-направленного мутагенеза, технологий геномного секвенирования, филогенетического и эволюционного анализа, представлены в данной обзорной статье.
БАЛАБАНОВА Лариса Анатольевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, *ИСАЕВА Марина Петровна - кандидат медицинских наук, заведующая лабораторией (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). *Е-таП: [email protected]
Приоритетным направлением «Стратегии научно-технического развития Российской Федерации» является переход к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения, в том числе за счет рационального применения лекарственных препаратов (прежде всего антибактериальных). Решение этих задач наиболее полно может быть осуществлено за счет изучения и использования биологических ресурсов Океана. Морские организмы и микроорганизмы - ценный источник уникальных биополимеров, прежде всего ферментов, которые могут рассматриваться в качестве новых катализаторов для различных биотехнологических процессов и получения диагностических и терапевтических препаратов. Преимущество этих ферментов заключается в молекулярных и каталитических особенностях, обусловленных адаптационной эволюцией морских (микро)организмов под воздействием крайних значений физических факторов окружающей среды [8].
Высокая активность ферментов из морских источников позволяет эффективно использовать их в генно-инженерных конструкциях для исследования структурно-функциональных свойств новых белков. Для определения углеводсвязывающих свойств рекомбинант-ного бифункционального химерного лектина мидии CGL/CmAP с активностью щелочной фосфатазы (CmAP) морской бактерии Cobetia amphilecti КММ 296 в отношении муцино-подобных онкомаркеров был проведен направленный мутагенез сайтов связывания лектина CGL [14]. Методом твердофазного лектин-ферментного анализа установлено, что сила связывания комплекса «лектин-лиганд» у мутантных форм значительно меньше, чем у дикого типа. Результаты анализа активности фермента CmAP у мутантов гибридного белка и анализа его механизма связывания с такими лигандами, как галактоза, глоботриоза и муцин, in silico показали индивидуальный вклад аминокислотных остатков CGL в угле-водсвязывающую активность. Впервые установлено, что сродство CGL к лигандам зависит от химической структуры трех эпитопных остатков углеводов, что определяет количество водородных связей в комплексах «CGL-лиганд». Полученные результаты важны для понимания молекулярного механизма функционирования CGL, а также для разработки синтетического аналога CGL с улучшенными углеводсвязывающими свойствами для диагностики и терапии рака.
Для ферментов морского происхождения характерны высокая удельная активность при пониженных температурах и устойчивость к действию неблагоприятных факторов. Понимание особенностей их физико-химических и каталитических свойств возможно при сравнительном анализе структур ферментов из морских и наземных организмов [17]. Аль-фа-галактозидазы, инактивирующие серологическую активность эритроцитов человека группы В, - относительно редкие ферменты. С целью исследования свойств альфа-галак-тозидазы Pseudoalteromonas sp. КММ 701 был получен ее рекомбинантный аналог a-Gal и сконструированы мутанты [6, 9]. В результате установлено, что a-Gal катализирует гидролиз альфа-О-гликозидной связи с сохранением оптической конфигурации аномерного центра субстрата, что характерно для альфа-галактозидаз семейства GH36. Искусственное увеличение термостабильности молекулы психрофильного фермента путем замены ключевых аминокислотных остатков по тому же принципу, который существует в структурной организации мезофильных и термостабильных гомологов, ведет к ограничению созданных природой вариантов его активной конформации, что неизбежно отражается на общей скорости каталитической реакции и механизме действия фермента.
К недавним достижениям лаборатории относится усовершенствование метода диагностики псевдотуберкулеза путем получения генно-инженерного гибридного бифункционального белка CmAP/OmрF на основе порина OmpF из патогенной для человека бактерии Yersinia pseudotuberculosis и высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP морской бактерии C. amphilecti КММ 296, у которой каталитическая эффективность субъединицы в разы превышает таковую известных димерных аналогов [3, 4, 13]. Показано, что в гибридном белке модуль OmpF не теряет свойств диагностического антигена, а модуль CmAP сохраняет ферментативную активность для обнаружения комплексов «порин-специфическое
антитело». Использование данного гибридного белка позволяет исключить применение меченных ферментами вторых антител при диагностике острых и вторично-очаговых форм псевдотуберкулеза.
Несомненный практический интерес представляют результаты действия рекомбинант-ных щелочных фосфатаз и альфа-галактозидаз морских бактерий на клетки патогенных бактерий и их способность к образованию биопленок [11]. Было показано, что рекомби-нантные ферменты морских бактерий C. amphilecti KMM 296 и Pseudoalteromonas sp. 701 обладают антибиопленочной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий P. aeruginosa, B. subtilis, S. enterica и S. aureus. Полученные результаты представляют интерес с точки зрения использования психрофильных морских ферментов для контроля качества пищевых продуктов и безопасности медицинского оборудования.
К уникальным белкам морского генеза относятся цитолизины актиний (актинопори-ны). Интерес к таким соединениям связан с возможностью создания на их основе имму-ноконъюгатов для направленного уничтожения клеток чужеродных организмов или опухолевых клеток [18]. Установлено, что геном морской анемоны Heteractis crispa содержит множество генов цитолизинов, различающихся между собой заменами в области, кодирующей зрелый белок. Для этих генов наблюдается сильное влияние стабилизирующего отбора на большинство сайтов, связанных со стабильностью структуры и порообразующей активностью [15].
Морские мицелиальные грибы являются перспективными продуцентами полисахарид-деградирующих ферментов с интересными для сельского хозяйства и медицины свойствами. В ходе исследований найдены новые штаммы с высокоактивными и специфичными ламинариназами, альгинатлиазами, каррагиназами, полиманнуронатлиазами, агаразами и фукоиданазами [2]. В некоторых наземных штаммах микромицетов уровень активности ферментов, катализирующих расщепление полисахаридов водорослей, превышал во много раз активности, проявленные морскими штаммами, что может указывать на вторичное морское происхождение почвенных грибов, выделенных в приморском регионе. Эти результаты открывают перспективы дальнейшего изучения полисахариддеградирующе-го потенциала мицелиальных грибов для переработки различных растительных отходов сельского хозяйства и марикультур [10].
С целью открытия новых метаболических путей, получения новых сведений о распределении и эволюции генов и оперонов, отвечающих за синтез перспективных биополимеров и природных соединений, в лаборатории были начаты работы по секвенированию геномов морских бактерий. Методом пиросеквенирования были получены последовательности геномов таких морских бактерий, как Vitellibacter vladivostokensis KMM 3516T [7], С. amphilecti KMM 296 (ранее - С. marina) [1], Zobellia amurskyensis KMM 3676T [12], Vibrio sp. CB1-14 [16].
Анализ последовательностей геномов обнаружил присутствие большого числа генов, отнесенных к гипотетическим генам белков с неустановленной функцией, а значит новых метаболических путей и их продуктов, представляющих интерес как для фундаментальной науки, так и для биотехнологических решений.
Морские бактерии семейства Flavobacteriaceae хорошо известны как ключевые участники процессов деградации биополимеров, главным образом полисахаридов водорослей. По данным секвенирования, геном морской флавобактерии Z. amurskyensis KMM 3676T кодирует 361 ген системы углеводного обмена, включая 97 генов гликозил-гидролаз, 13 генов полисахаридлиаз и 77 генов сульфатаз [12]. Полученная генетическая информация указывает на то, что бактерия обладает высоким ферментативным потенциалом для гидролиза основных полисахаридов водорослей, а наличие сульфатаз способствует эффективной деградации сульфатированных форм полисахаридов, таких как фуканы, каррагинаны и хондроитин. Большое содержание генов полисахариддеградиру-ющих экзоферментов может указывать на важную экологическую роль бактерии в круговороте органических углерода и серы в океане. В дальнейшем на основании анализа
геномных данных могут быть выбраны гены для получения рекомбинантных аналогов уникальных ферментов, пригодных для модификации и деградации коммерчески важных полисахаридов водорослей.
Новые технологии исследования геномов позволяют также осуществлять направленный поиск генных кластеров для кодирования путей биосинтеза ценных вторичных метаболитов. Особый интерес представляет изучение генома морской бактерии Vibrio sp. CB1-14, выделенной из слизи ловчей сети морской полихеты Chaetopterus variopedatus и являющейся продуцентом гуанидинового алкалоида 6-эпи-монанхорина, обладающего цитостатической активностью [16]. Изучение генома Vibrio sp. CB1-14 открывает возможности для идентификации не только генного кластера биосинтеза 6-эпи-монанхорина, но и других редких и уникальных биосинтетических кластеров. Предварительный анализ генома показал присутствие генных кластеров, ответственных за синтез сахаров, жирных кислот и антимикробных пептидов. Так, в этом геноме найден крайне редко встречающийся биосинтетический кластер антибиотика дапдиамида. Однако ключевых генов ферментов, предсказанных гипотетической схемой биосинтеза 6-эпи-монанхорина, обнаружено не было. Поскольку большинство кластеров определяются как гипотетические, дальнейшая работа должна быть сосредоточена на получении мутантов с «выключенными» генами, а также на привлечении методов метаболомики для детекции биосинтетических интермедиатов.
Таким образом, полученные результаты показывают перспективность молекулярно-ге-нетических и геномных исследований морских биополимеров в качестве новых инструментов в биохимии и биотехнологии морских (микро)организмов, позволяющих открывать новые структуры и функции, находить новые биологические источники уникальных ферментов и вторичных метаболитов, а также получать ключевые ферменты, участвующие в биосинтезе морских биологически активных веществ. Не вызывает сомнений тот факт, что использование геномных и генно-инженерных технологий будет способствовать поиску новых биохимических соединений морского генеза и созданию на их основе новых высокоэффективных лекарственных препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Балабанова Л.А., Голотин В.А., Ковальчук С.Н., Бабий А.В., Шевченко Л.С., Сон О.М., Косовский Г.Ю., Рассказов В.А. Геном морской бактерии Cobetia marina KMM 296, выделенной из мидии Crenomytilus grayanus (Dunker, 1853) // Биол. моря. 2016. Т. 42, № 1. С. 78-81. - http://bm.dvo.ru/2016/n1/r_a013.htm
2. Балабанова Л.А., Бакунина И.Ю., Слепченко Л.В., Киричук Н.Н., Худякова Ю.В., Сон О.М., Пивкин М.В., Рассказов В.А. Полисахариддеградирующая активность морских и наземных штаммов мицелиальных грибов // Биоорган. химия. 2018. Т. 44, № 4. С. 425-432. - http://www.rjbc.ru/2018/4/abstracts/9.shtml
3. Балабанова Л.А., Голотин В.А., Буйновская Н.С., Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Рассказов В.А. Ре-комбинантная плазмидная ДНК pET40CmAP/0mpF, кодирующая гибридный бифункциональный полипептид CmAP/OmpF со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и порообразующего мембранного белка порина OmpF, и рекомбинантный штамм E. coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/OmpF - продуцент гибридного бифункционального полипептида CmAP/OmpF: пат. 2634871 РФ. Заявл. 03.08.2016; опубл. 07.11.2017, Бюл. № 31.
4. Буйновская Н.С., Балабанова Л.А., Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Рассказов В.А. Гибридный бифункциональный белок на основе OMPF порина и высокоактивной щелочной фосфатазы // Биоорган. химия. 2018. Т. 44, № 4. С. 417-424. - http://www.rjbc.ru/2018/4/abstracts/8.shtml
5. Рассказов В. А. Ферменты морских организмов и перспективы их использования в медицине и биотехнологии // Вестн. ДВО РАН. 2014. № 1. С. 61-68.
6. Слепченко Л.В., Балабанова Л.А., Бакунина И.Ю., Исаков В.В., Подволоцкая А.Б., Елисейкина М.Г., Но-скова Ю.А., Рассказов В.А. Свойства и возможная биологическая роль альфа-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas sp. KMM 701 // Вестн. ДВО РАН. 2017. № 2. С. 51-58.
7. Чернышева Н.Ю., Ромашко Д.А. Геномный анализ гидролитического потенциала морской бактерии Vitellibacter vladivostokensis // Вестн. ДВО РАН. 2015. № 6. С. 159-163. - https://elibrary.ru/item.asp?id=25501013
8. Arrigo K.R. Marine microorganisms and global nutrient cycles // Nature. 2004. Vol. 437, N 7057. P. 349. -https://www.nature.com/articles/nature04159
9. Bakunina I., Slepchenko L., Anastyuk S., Isakov V., Likhatskaya G., Kim N., Tekutyeva L., Son O., Balabanova L. Characterization of properties and transglycosylation abilities of recombinant a-galactosidase from cold-adapted marine
bacterium Pseudoalteromonas sp. KMM 701 and its C494N and D451A mutants // Mar. Drugs. 2018. Vol. 16, N 10. P. 349. - https://doi.org/10.3390/md16100349
10. Balabanova L., Slepchenko L., Son O., Tekutyeva L. Biotechnology potential of marine fungi degrading plant and algae polymeric substrates // Front. Microbiol. 2018. Vol. 9. P. 1527. - https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01527
11. Balabanova L., Podvolotskaya A., Slepchenko L., Eliseikina M., Noskova Y., Nedashkovskaya O., Son O., Tekutyeva L., Rasskazov V. Nucleolytic enzymes from the marine bacterium Cobetia amphilecti KMM 296 with an-tibiofilm activity and biopreservative effect on meat products // Food Control. 2017. Vol. 78. P. 270-278. - https://doi. org/10.1016/j.foodcont.2017.02.029
12. Chernysheva N.U., Likhatskaya G.N., Nedashkovskaya O.I., Isaeva M.P. Comparative genomics of Zobellia: analysis of polysaccharide lyases genes and operons // Vestnik FEB RAS. 2018. № 6. Supplement. - www.vestnikdvo. ru/index.php/vestnikdvo/.../204
13. Golotin V., Portnyagina O., Chopenko N., Kim N., Rasskazov V., Novikova O. Production of recombinant porin from Y. pseudotuberculosis in a water-soluble form for pseudotuberculosis diagnostics // Biol. Chem. 2017. Vol. 398, N 11. P. 1229-1236. - https://doi.org/10.1515/hsz-2017-0142
14. Kovalchuk S.N., Buinovskaya N.S., Likhatskaya G.N., Rasskazov V.A., Son O.M., Tekutyeva L.A., Balabano-va L.A. Mutagenesis Studies and Structure-function Relationships for GalNAc/Gal-Specific Lectin from the Sea Mussel Crenomytilus grayanus // Mar. Drugs. 2018. Vol. 16, N 12. P. 471. - https://doi.org/10.3390/md16120471
15. Leychenko E., Isaeva M., Tkacheva E., Zelepuga E., Kvetkina A., Guzev K., Monastyrnaya M., Kozlovskaya E. Multigene family of pore-forming toxins from sea anemone Heteractis crispa // Mar. Drugs. 2018. Vol. 16, N 6. P. 183. - https://doi.org/10.3390/md16060183
16. Makarieva T., Shubina L., Kurilenko V., Isaeva M., Chernysheva N., Popov R., Bystritskaya E., Dmitre-nok P., Stonik V. Marine bacterium Vibrio sp. CB1-14 produces guanidine alkaloid 6-epi-monanchorin, previously isolated from marine polychaete and sponges // Mar. Drugs. 2019. Vol. 17, N 4. P. 213. - https://doi.org/10.3390/ md17040213
17. Rina M., Pozidis C., Mavromatis K., Tzanodaskalaki M., Kokkinidis M., Bouriotis V. Alkaline phosphatase from the Antarctic strain TAB5 // The FEBS J. 2000. Vol. 267, N. 4. P. 1230-1238. - https://doi.org/10.1046/j.1432-1327.2000.01127.x
18. Tejuca M., Anderluh G., Dalla Serra M. Sea anemone cytolysins as toxic components of immunotoxins // Toxicon. 2009. Vol. 54, N. 8. P. 1206-1214. - https://doi.org/10.1016Zj.toxicon.2009.02.025
