CC BY
28
© Коллектив авторов, 2019 г doi: 10.5281/zenodo.3559614
УДК 57.085.23 + 577.114
А.К. Гажа1, Т.А. Кузнецова1, Т.П. Смолина1, М.С. Кокоулин2
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П.Сомова, Владивосток
2 Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток
Проведено исследование биологической активности трех ранее неизученных полисахаридов, выделенных из морских грамотрицательных бактерий Cobetia litoralis KMM 3890T, Idiomarina abyssalis КММ 227T, Pseudoalteramonas Nigrifaciens КММ 156. Оценивали токсичность исследуемых полисахаридов и выживаемость лабораторных животных при парентеральном введении, а также влияние на процесс апоптоза иммунокомпетентных клеток периферической крови человека. Установлено, что полисахариды не оказывают токсического действия на мышей в широком диапазоне доз (5-500 мг/кг) и не индуцируют апоптоз лимфоцитов и нейтрофильных лейкоцитов периферической крови человека, что свидетельствует о сохранении структурной и функциональной активности иммунокомпетентных клеток под влиянием этих полисахаридов. Полученные результаты открывают перспективу для дальнейшего изучения биологической активности этих химических соединений.
Ключевые слова: морские бактерии, полисахариды, токсичность, апоптоз, лимфоциты, нейтрофилы. Для цитирования: Гажа А.К., Кузнецова Т.А., Смолина Т.П., Кокоулин М.С. Биологическая активность полисахаридов из морских бактерий // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2019; 3(79): 23-27. doi: 10.5281/zenodo.3559614
Для корреспонденции: Гажа Анна Константиновна, e-mail: [email protected].
Поступила 18.10.19 Принята 11.11.19
A.K. Gazha1, T.A. Kuznetsova1, TP. Smolina1, M.S. Kokoulin2
BIOLOGICAL ACTIVITY OF POLISHACCHARIDES FROM SEA BACTERIA
1 G.P. Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia
2 G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Vladivostok, Russia
A study of the biological activity of the three formerly unexplored polysaccharides isolated from the sea Gramnegative bacteria Cobetia litoralis KMM 3890T, Idiomarina abyssalis КММ 227T, Pseudoalteramonas Nigrifaciens КММ 156 was conducted. We evaluated the toxicity of the studied polysaccharides and the survival of laboratory animals after parenteral administration, as well as the effect of polysaccharides on human peripheral blood apoptosis. It was established that polysaccharides do not have a toxic effect on mice in a wide range of doses (5-500 mg/kg) and do not induce apoptosis of lymphocytes and neutrophilic leukocytes of human peripheral blood, which indicates the maintenance of the structural and functional activity of immunocompetent cells under these polysaccharides influence. The results obtained open the prospects for further study of the biological activity of these polysaccharides.
Key words: marine bacteria, polysaccharides, toxicity, apoptosis, lymphocytes, neutrophils. For citation: Gazha A.K., Kuznetsova T.A., Smolina T.P., Kokoulin M.S. Biological activity of polishaccharides from sea bacteria. Health. Medical ecology. Science. 2019; 3(79): 23-27. doi: 10.5281/zenodo.3559614
For correspondence: Gazha A.K., e-mail: [email protected].
Conflict of interests. The authors are declaring absence Financing. The study had no sponsor support.
Введение
В последнее время проблема поиска новых биологически активных веществ привлекает внимание исследователей к различным морским организмам. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют, что полисахариды (ПС), выделенные из различных гидробионтов, обладают широким, экс-
of conflict of interests.
Received 18.10.19
Accepted 11.11.19
периментально и клинически доказанным спектром фармакологических эффектов (иммуномодулирую-щим, противовоспалительным, антикоагулянтным, противоопухолевым, гиполипидемическим, гипо-гликемическим, антиоксидантным и др.) и являются весьма перспективными для конструирования на их основе препаратов для биомедицинского примене-
ния [1, 2]. Особого внимания заслуживают морские бактерии, которые привлекают внимание исследователей в связи с особенностями их метаболизма, обусловленными средой обитания. На жизнедеятельность морских бактерий значительное влияние оказывают такие факторы, как содержание растворенного кислорода, колебания температур океанических вод, гидростатическое давление [2, 3].
Морские микроорганизмы обладают широким спектром ферментов углеводного обмена, отличным от такового у наземных микробов, которые активно участвуют в различных биохимических реакциях в клетке, в микробной деградации белковых молекул, нуклеиновых кислот, а также специфических для морской среды полисахаридов [3]. Грамотрицатель-ные бактерии являются неотъемлемым компонентом морской среды и представляют значительную часть сообщества микробов океана. Микробная адаптация к морской среде была достигнута путем разработки сложной серии процессов, заряжающих биомолекулы, составляющие клетку, для обеспечения правильной физиологии и функциональности в этих условиях. Молекулы полисахарида, которые составляют большую часть внешней мембраны гра-мотрицательных бактерий, участвуют в контактных взаимодействиях между бактериальной клеткой и окружающей средой и играют важную роль в адаптации организмов к специфическим условиям окружающей среды [4].
Полисахариды выполняют различные функции в тканях, из которых они происходят. Они способны связываться с белками на нескольких уровнях специфичности и участвуют главным образом в развитии, дифференцировке клеток, клеточной адгезии, передаче сигналов клетки и взаимодействиях клеточного матрикса. Эти биоактивные молекулы представляют большой потенциал для медицинских, фармацевтических и биотехнологических применений, таких как повязки на раны, биоматериалы, ускорение регенерации тканей, 3D-культуральные каркасы и даже лекарственные средства.
Морские полисахариды представляют огромное разнообразие структур; они все еще недостаточно изучены и недостаточно используются, и поэтому их следует рассматривать как исключительный источник химического разнообразия для открытия лекарств. Бактериальные полисахариды представляют реальный потенциал для применения в клеточной терапии и тканевой инженерии с преимуществом по сравнению с полисахаридами из эукариот, поскольку они могут быть получены в полностью контролируемых условиях в биореакторах и с использованием химических модификаций. Это позволяет оптимизировать биологические свойства и конструировать лекарственные средства с высокой эффективностью и низким риском побочных реакций для пациента [5].
Цель исследования
Целью настоящей работы явилось оценка биологической активности трех новых полисахаридов, выделенных из морских грамотрицательных бактерий, в частности, их влияния на выживаемость лабораторных животных и на процесс апоптоза им-мунокомпетентных клеток периферической крови человека.
Материалы и методы исследования
В работе были использованы три образца ПС, выделенных из различных видов морских грамо-трицательных бактерий из Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН. ПС 1 выделен из морской бактерии Cobetia litoralis KMM 3890T. O-полисахарид состоит из разветвленных триса-харидных повторяющихся звеньев, состоящих из D-глюкозы (D-Glcp), D-маннозы (D-Man^) и суль-фатированной по положению О-5 З-дезокси-D-манноокт-2-улозоновой кислоты (Kdop5S) [4]: ^7-p-Kdop5S-(2^4)-p-D-Man^-(1^
2
í 1
P-D-Glcp
ПС 2 выделен из штамма Idiomarina abyssalis КММ 227T О-специфический полисахарид состоит из сульфатированных пентасахаридных повторяющихся звеньев и содержит два остатка 2-ацетамидо-2-дезокси^-глюкуроновой кислоты (D-GlcpNAcA), L-рамнозы (L-Rhap), 2,4-диацетамидо-2,4,6-тридезокси^-глюкозы (D-QuipNAc4NAc), а также сульфатированный по положению О-2 остаток 3,6-дидезокси-3-(4-гидроксибутирамидо)-D-глюкозы [D-Quip2S3N(4Hb)] [6]: ^3)-p-D-QuipNAc4NAc-(1^3)-p-D-GlcpNAcAn-(1^4)-p-D-Glc^NAcA4^
4
í
1
P-D-Qui^2S3N(4Hb)-(1^2)-a-L-Rha^
ПС 3 получен из штамма КММ 156 бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens и состоит из тетраса-харидных повторяющихся звеньев, содержащих два остатка L-Rha, один остаток 2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюкозы (D-GlcpNAc) и один остаток 3-0-[(R)-1-карбоксиэтил]^-глюкозы [a-D-Glcp3(R-Lac), глю-колактиловой кислоты] [7]:
^4)-p-D-GlcpNAc-(1^2)-a-L-Rhap-(1^3)-p-L-Rhap- (^
3
í
1
a-D-Glcp3(R-Lac)
Экспериментальные исследования по определению острой токсичности in vivo выполнены на неинбред-ных мышах-самцах. Животные находились в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Су-
хой порошок ПС растворяли в 0,85% растворе NaCl. Введение осуществляли внутрибрюшинно в дозах 5, 50, 100, 500 мг/кг однократно. Животным контрольных групп по той же схеме вводили 0,85% раствор NaCl. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 суток. Ежедневной регистрации подлежали гибель животных, данные осмотра, вес тела. По истечении 2-х недель производилось вскрытие животных для оценки состояния внутренних органов.
Для изучения влияния ПС на апоптоз клеток периферической крови человека исследуемые вещества использовались в рабочей концентрации 100 мкг/мл. Лимфоциты и нейтрофилы выделяли из венозной крови здоровых доноров. Клетки крови культивировали в полной питательной среде (RPMI 1640 c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 ммоля L-глютамина и бактериостатической концентрации гентамицина (20 мг) в присутствии образцов ПС в СО2 инкубаторе при 37°С в течение 24 часов. Оценку количества иммунокомпетентных клеток, вступивших в апоптоз, проводили с использованием ANNEXIN V -FITC Kit («Beckman Coulter», Франция) на проточном цитофлюориметре BD FACSCalibur (США).
Таким образом, введение экспериментальным животным образцов полисахаридов (ПС1, ПС2, ПС3) в широком диапазоне доз (5-500 мг/кг) не вызывает видимых клинических проявлений интоксикации в течение всего периода наблюдения.
Следующим этапом исследования было изучение способности исследуемых ПС оказывать влияние на апоптоз клеток крови человека.
Апоптоз или программированная гибель клетки является естественным процессом и основным компонентом эмбриогенеза, морфогенеза и роста тканей, необходимым для поддержания нормального
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы «Statistica-10».
Результаты исследования
При однократном внутрибрюшинном введении мышам ПС в дозе до 500 мг/кг в течение 2-х недель эксперимента ПС 1, 2 и 3 не вызывали гибели экспериментальных животных. Существенных отклонений в поведении мышей, в потреблении корма, воды, приросте массы тела не отмечено. Животные опытных групп нормально развивались и прибавляли в массе наравне с контрольными. Мыши были подвижны, шерстный покров и видимые слизистые чисты. Не наблюдалось нарушений координации движений, поведенческих реакций, угнетения дыхания, нарушений мышечного тонуса.
Показатели массы тела опытных мышей не имели статистически значимых отличий от аналогичных показателей у интактных животных (табл.1). При вскрытии установлено, что внутренние органы, региональные лимфатические узлы у опытных мышей в пределах физиологической нормы.
тканевого гомеостаза, и представляет собой процесс физиологической клеточной смерти, при котором происходят изменения во всех структурах клетки [8]. Фундаментальная биологическая роль апоптоза обусловливает его вклад в реализацию различных форм патологий, таких, как злокачественные новообразования, синдром приобретенного иммунодефицита, некоторые нейродегенеративные и аутоиммунные заболевания, инфекционные процессы и пр. [9].
К настоящему времени выявлен целый ряд веществ, способных индуцировать или ингибировать развитие апоптоза. Проапоптотическое действие
Таблица 1
Динамика изменения массы тела мышей при однократном введении полисахаридов
Полисахариды Доза, мг/кг Масса тела животных, г
Исходная 5 день 10 день 14 день
Из C. litoralis 5 мг/кг 14,8-0,4 15,2-0,4 16,1-0,5 18,9-0,5
50 мг/кг 15,0-0,3 15,4-0,5 16,2-0,6 18,7-0,5
100 мг/кг 15,1-0,2 15,6-0,4 16,2-0,5 18,1-0,4
500 мг/кг 14,7-0,3 15,1-0,5 15,9-0,4 17,9-0,3
Из I. abyssalis 5 мг/кг 15,1-0,4 15,4-0,3 16,2-0,4 18,5-0,5
50 мг/кг 15,2-0,4 15,5-0,4 16,4-0,5 18,8-0,5
100 мг/кг 14,9-0,2 15,7-0,3 16,3-0,4 18,6-0,3
500 мг/кг 14,7-0,2 15,2-0,4 16,0-0,4 18,2-0,5
Из P. nigrifaciens 5 мг/кг 15,1-0,4 15,4-0,3 16,2-0,4 18,5-0,5
50 мг/кг 15,2-0,4 15,5-0,4 16,4-0,5 18,8-0,5
100 мг/кг 14,9-0,2 15,7-0,3 16,3-0,4 18,6-0,3
500 мг/кг 14,7-0,2 15,2-0,4 16,0-0,4 18,2-0,5
Контроль 14,9-0,4 15,3-0,3 16,7-0,2 18,1-0,4
Примечание. М±т - средние показатели массы; п=10 на каждый срок; все значения р>0,05 (различия не являются статистически значимыми по отношению к контролю)
различных сульфатированных ПС, выделенных из морских гидробионтов (фукоиданов) в отношении злокачественных клеток хорошо известно и является объектом интенсивного изучения [2, 10].
Мы исследовали влияние ПС из морских бактерий на процесс апоптоза нормальных имму-нокомпетентных клеток периферической крови человека. При оценке интенсивности апоптоти-
Это говорит о том, что все исследуемые образцы ПС, выделенных из морских бактерий, не индуцировали апоптоз клеток крови и свидетельствует о сохранении структурной и функциональной активности иммунокомпетентных клеток под влиянием этих ПС в данной концентрации. Следует отметить, что концентрация 100 мкг/мл является оптимальной для оценки иммуномодулирующего действия биополимеров ПС природы в экспериментах in vitro.
Заключение
Таким образом, было показано, что полисахариды, выделенные из морских грамотрицательных бактерий Cobetia litoralis KMM 3890T, Idiomarina abyssalis КММ 227T и Pseudoalteramonas nigrifaciens, не оказывают токсического действия на организм экспериментальных животных в широком диапазоне доз и не обладают способностью индуцировать апоп-тоз иммунокомпетентных клеток периферической крови человека. Полученные результаты открывают перспективы для дальнейшего изучения биологической активности этих химических соединений.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kwak J.-Y. Fucoidan as a Marine Anticancer Agent in Preclinical Development. Mar. Drugs. 2014; 2 (2): 851-870.
2. Fitton J.H. Therapies from fucoidan ; multifunctional marine polymers. Mar. Drugs. 2011; 9: 17311760.
3. Беленёва И.А., Агаркова В.В., Кухлевский А.Д., Звягинцева Т.Н. Распространение ферментов угле-
ческого процесса в культурах клеток крови было установлено, что инкубирование лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови человека с исследуемыми образцами ПС в концентрации 100 мкг/мл не вызывало статистически значимого увеличения количества гиподиплоидных клеток относительно показателей в контрольной культуре клеток (табл. 2).
водного обмена среди морских микроорганизмов в японском и южно-китайском морях. Микробиология. 2010; 6:793-800.
4. Kokoulin M.S., Kuzmich A.S., Kalinovsky A.I., Tomshich S.V., .Romanenko L.A., Mikhailov V.V., Kom-androva N.A. Structure and anticancer activity of sulfated O-polysaccharide from marine bacterium Cobetia litoralis KMM 3880T. Carbohydrate Polymers. 2016; 154: 55-61.
5. Senni K., Pereira J., Gueniche F., Delbarre-Ladrat C., Sinquin C., Ratiskol J., Godeau G., Fischer A.-M., Helley D., Colliec-Jouault S. Marine Polysaccharides: A Source of Bioactive Molecules for Cell Therapy and Tissue Engineering. Mar. Drugs. 2011; 9:1664-1681, doi:10.3390/md9091664.
6. Kokoulin M.S., Komandrova N.A., Kalinovsky A.I., Tomshich S.V., Romanenko L.A., Vaskovsky A.B. Structure of the O-specific polysaccharide from the deep-sea marine bacterium Idiomarina abyssalis КММ 227T containing a 2-O-sulfate-3-N-(4-hydroxybutanoyl)-3,6-dide-oxy-d-glucose. Carbohydrate Research. 2015; 41:100-106.
7. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков А.А. и др. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonashaloplanktis KMM156. Биоорганическая химия. 1993; 19 (3): 327-336.
8. Ярилин А.А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии. В кн. Актуальные проблемы патофизиологии. М.: Медицина; 2001; с. 13-56.
9. Maniati E., Potter P., Rogers N.J., Morley B.J. Control of apoptosis in autoimmunity. J. Pathol. 2008;214: 190-198, doi:10.1002/path.2270.
10. Запорожец Т.С., Ермакова С.В., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. Противоопухолевые эффекты сульфатированных полисахаридов из морских водорослей. Успехи современной биологии. 2013; 4: 378-391.
Таблица 2
Влияние ПС из морских бактерий на апоптоз лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови доноров (%)
Контроль ПС из C. litoralis ПС из I. abyssalis ПС из P. nigrifaciens
Клетки крови Me (LQ-UQ) Me (LQ-UQ) Me (LQ-UQ) Me (LQ-UQ)
Лимфоциты 61 (5,4-6,4) 6Z (5,6-7,2) p=0,21 M (6,3-7,1) p=0,07 69 (5,8-7,7) p=0,06
Нейтрофилы 54,4 (53,0-55,2) 57,3 (51,6-58,2) p=0,52 55,7 (54,2-56,4) p=0,15 55,5 (53,8-58,2) p=0,09
Примечание. Показатели (%): Ме - медиана, LQ-UQ - нижний и верхний квартили, Р - значимость различий по сравнению с контролем, п=6.
Сведения об авторах
Гажа Анна Константиновна, к.м.н., старший научный сотрудник лаб. иммунологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П.Сомова, г. Владивосток, ул. Сельская 1, тел. 8(914)732-5581, e-mail: angazha@ mail.ru;
Кузнецова Татьяна Алексеевна, д.м.н., главный научный сотрудник лаб. иммунологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П.Сомова, г. Владивосток, ул. Сельская 1;
Смолина Татьяна Павловна, к.б.н., ведущий научный сотрудник лаб. иммунологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П.Сомова, г. Владивосток, ул. Сельская 1;
Кокоулин Максим Сергеевич, к.х.н., научный сотрудник лаб. химии углеводов и липидов, Тихоокеанский институт биоорганической химии им Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостока, 159.
