CC BY
177
Химия растительного сырья. 2011. №1. С. 39-44.
УДК: 577.114:581.192:574.917:633.88
ПЕКТИНОВЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ РЯБИНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ SORBUS AUCUPARIA L.
© А.А. Злобин1, Е.А. Мартинсон1, С.Г. Литвинец1, И.А. Овечкина1, Е.А. Дурнев1, Р.Г. Оводова2
1 Вятский государственныйуниверситет, ул. Московская, 36, Киров, 610601 (Россия) e-mail: biotech.vgu@gmail.com
2Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, ул. Первомайская, 50, Сыктывкар, 167982 (Россия) e-mail: ovoys@phisiol.komisc.ru
Из плодов рябины обыкновенной Sorbus aucuparia L. экстракцией водой и 0,7%-ным водным раствором оксалата аммония с суммарным выходом 4,2% выделены фракции водорастворимых полисахаридов. Показано, что они представлены пектиновыми полисахаридами, в состав углеводных цепей которых входят остатки галакгуроновой кислоты (до 68%), арабинозы и галактозы в качестве главных компонентов.
Гельфильтрацией пектиновых полисахаридов плодов рябины на сефакриле S-500 показано, что они достаточно гомогенны по молекулярным массам, а результаты их ферментативного гидролиза экЭо-полигалактуроназой свидетельствуют о том, что в состав их углеводных цепей входят протяженные линейные области галактуронана (рамногалакту-ронана). Согласно результатам метилирования пектиновых полисахаридов рябины их боковые углеводные цепи образованы 1,5-связанными остатками арабинофуранозы, 1,4-связанными остатками глюкопиранозы, 1,6-связанными остатками галактопиранозы, 1,3,6-связанными остатками маннопиранозы и 1,3,6-связанными остатками галактопиранозы. На невосстанавливающихся концах этих боковых цепей находятся остатки глюкопиранозы.
Показано, что антиоксидантная активность водных растворов пектиновых полисахаридов рябины обыкновенной S. aucuparia L. (0,5 мг/мл) составляет 37-53% от активности тролокса, принятой за 100%.
Ключевые слова: Sorbus aucuparia L., водорастворимые полисахариды, пектиновые полисахариды, моносахаридные остатки, гельфильтрация, метилированные сахара, хромато-масс-спектрометрия, ферментативный гидролиз, антиоксидантная активность.
Работа выполнена при поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические
кадры инновационной России на 2009-2013 годы (ГК№02.740.11.0294).
Введение
Рябина обыкновенная Sorbus aucuparia L. распространена на всей территории европейской части России, а также на Дальнем Востоке, Камчатке и в Сибири. Одно растение может дать до 80-100 кг плодов, в которых содержатся макро- и микроэлементы, витамины (С, Р, Вь В2, РР, Е, К, каротиноиды и фолиевая кислота), рутин, дубильные вещества, гликозиды, антоцианы, фосфолипиды, углеводы (глюкоза, фруктоза и сахароза) и органические кислоты.
Благодаря такому богатому комплексу биологически активных веществ настои, отвары и сок плодов рябины обыкновенной широко используются в народной медицине в качестве диуретических и гемостатиче-ских средств, а также при расстройствах пищеварения, гепатите, гепатохолецистите и затрудненном желчеотделении. Препараты на основе плодов рябины применяют при анемии, отеках, диспепсии, подагре, диатезе, а также в качестве средств, нормализующих обмен веществ. Кроме того, экстракты и сиропы на основе плодов рябины используют в пищевой и спиртоводочной промышленности [1, 2].
Пектиновые вещества, содержание которых в плодах рябины достаточно высоко, могут применяться при профилактике отравлений солями тяжелых металлов и поражениях радиоактивными элементами. Они также могут быть использованы в качестве вспомогательных компонентов (стабилизаторы суспензий и эмульгаторы) при производстве лекарственных препаратов.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Растительный материал. Плоды рябины обыкновенной были собраны в окрестностях Кирова (Кировская область) в 2010 г.
Общие аналитические методы. Количественное содержание гликуроновых кислот в выделенных фракциях полисахаридов определяли спектрофотометрическим методом реакцией с 3,5-диметилфенолом [3], по калибровочному графику, построенному по D-галактопиранозилуроновой кислоте. Степень метилэтерифи-цирования (СМ) остатков гликуроновых кислот определяли по методу [4]. Содержание сопуствующего белка во фракциях водорастворимых полисахаридов определяли по методу Лоури [5], по калибровочному графику, построенному по бычьему сывороточному альбумину.
Спектрофотометрические определения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-mini 1240 (Япония).
Моносахаридный состав выделенных фракций водорастворимых полисахаридов определяли после их гидролиза 2М раствором трифторуксусной кислоты (ТФУ), содержащей в качестве внутреннего стандарта .мио-инозит (0,1 мг/мл). Кислотный гидролиз проводили в течение 3 ч при 100 °С. Свободные моносахариды восстанавливали боргидридом натрия и переводили в перацетаты полиолов [6]. Количественное определение ацетатов полиолов проводили с помощью хромато-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС). Для расчета содержания моносахаридных остатков использовали соответствующие коэффициенты отклика детектора.
ГЖХ-МС ацетатов полиолов проводили на газовом хроматографе G2589A (Agilent Tech., США) с масс-селективным детектором 5973 INERT (Agilent Tech., США) на капиллярной колонке HP-5MS (0,2 мм 0 30 м, Hewlett-Packard, США) при следующих условиях: температура термостата колонки 175^-250 °С с градиентом 3 °С/мин; температура испарителя - 250 °С; газ-носитель - гелий (скорость потока 1 мл/мин, деление потока 60 : 1); развертка - от m/z 44 до m/z 500; энергия ионизирующих электронов - 70 eV; частота сканирования - 1 скан/сек; количество вводимой пробы - 1 мкл.
Идентификацию остатков гликуроновых кислот в составе фракций водорастворимых полисахаридов осуществляли после их кислотного гидролиза 2М раствором ТФУ в течение 5 ч при 100 °С методом ГЖХ-МС в виде триметилсилильных (ТМС) производных [7]. ГЖХ-МС ТМС производных гликуроновых кислот проводили при температуре термостата колонки 180^250 °С с градиентом температуры - 3 °С/мин. Температура испарителя - 260 °С. Газ-носитель - гелий (скорость потока 1 мл/мин, деление потока 60 : 1); развертка - от m/z 44 до m/z 500; энергия ионизирующих электронов - 70 eV; частота сканирования - 1 скан/сек; количество вводимой пробы - 1 мкл.
ГЖХ-МС метилированных производных сахаров проводили при температуре термостата колонки 130—^250 °С со скоростью подъема температуры 5 °С/мин. Температура испарителя - 250 °С. Газ-носитель -гелий (скорость потока 1 мл/мин, деление потока 20 : 1); развертка - от m/z 44 до m/z 500; энергия ионизирующих электронов - 70 eV; частота сканирования - 1 скан/сек. Количество вводимой пробы - 1 мкл.
Качественный состав моносахаридов в ферментативных гидролизатах полисахаридов плодов рябины определяли методом нисходящей распределительной бумажной хроматографии (БХ). БХ проводили на бумаге Filtrak FN-12 в системе растворителей н-бутанол - пиридин - вода (6 : 4 : 3 по объему). Для индикации пятен моносахаридов использовали раствор кислого анилинфталата при 105 °С в течение 5 мин [8]. Идентификацию моносахаридов проводили сравнением со стандартными образцами.
Метилирование полисахаридов. 5-7 мг полисахаридов обезвоживали в пистолете Фишера под вакуумом над Р205. К сухому образцу добавляли 1 мл диметилсульфоксида и перемешивали в атмосфере азота при комнатной температуре до полного растворения. К раствору приливали 0,5 мл 2М раствора метилсульфи-нилкарбаниона (CH3SOCH2-Na) и перемешивали в токе азота при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь замораживали, добавляли 1 мл йодистого метила (CH3I) и перемешивали в атмосфере азота в течение 6 ч [9]. Затем смесь диализовали, лиофильно высушивали и дополнительно обезвоживали над Р205. Частично метилированные полисахариды повторно обрабатывали CH3SOCH2-Na+ и CH3I, как описано выше. Смесь диализовали, метилированные полисахариды экстрагировали хлороформом и высушивали под вакуумом. К сухому остатку приливали 1 мл 2М раствора ТФУ и проводили гидролиз при 100 °С в течение 5 ч. Избыток кислоты отгоняли с метанолом и переводили метилированные моносахариды в соответствующие ацетаты с помощью уксусного ангидрида в пиридине [6].
Все водные растворы и пробы для ГЖХ и ГЖХ-МС-анализа упаривали под вакуумом при 40-45 °С. Центрифугирование растворов проводили в течение 10 мин при 6000-9000 об/мин.
Выделение водорастворимых полисахаридов. Для выделения полисахаридов из свежих плодов рябины использовали метод последовательной экстракции водой при 68 °С и 0,7%-ным водным раствором оксалата
аммония при 68 °С [9]. Свежие плоды рябины (100 г) измельчали и обрабатывали 0,4%-ным раствором формалина при 40 °С в течение 1 ч для фиксации полифенольных соединений и белка. Остаток растительного материала обрабатывали порциями дистиллированной воды (2 л, 68°С) до отрицательной качественной реакции на углеводы по методу Смита [11]. Объединенные экстракты упаривали под вакуумом, диализовали в течение двух суток через целлофановую пленку и осаждали добавлением четырехкратного объема 96%-ного этанола. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды и лиофильно высушивали. Получили фракцию SAI.
Остаток сырья обрабатывали водой (0,5 л, 50 °С, pH 3,8-4,0) и после отделения раствора фильтрованием проводили экстракцию пектиновых полисахаридов, входящих в состав протопектина, 0,7%-ным водным раствором оксалата аммония (2 л, 68 °С) до отрицательной качественной реакции на углеводы. Экстракты объединяли, концентрировали упариванием под вакуумом, диализовали и осаждали полисахариды добавлением четырехкратного 96%-ного этилового спирта. Осадок растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды и высушивали лиофильно (фракция SAII).
Выход и состав полученных фракций полисахаридов приведены в таблице 1.
Гелъфилътрация полисахаридов. Гельфильтрацию водорастворимых полисахаридов плодов рябины проводили на колонке (41^1,6 см) с сефакрилом S-500 (Fluka). Свободный объем колонки - 32 мл. Количество наносимых на колонку полисахаридов - 31-32 мг. Элюирование проб проводили 0,01 М раствором NaCl со скоростью потока элюента 20 мл/ч. Отбирали фракции объемом по 3 мл. Выход полисахаридов из колонки контролировали с помощью качественной реакции по фенол-сернокислотному методу [11]. Фракции, соответствующие отдельным пикам, объединяли, диализовали и лиофильно высушивали. В результате гель-фильтрации исходных полисахаридов SAI и SAII получены фракции SAIS и SAIIS соответственно. Характеристика фракций приведена в таблице 2.
Ферментативный гидролиз. Ферментативный гидролиз полисахаридов проводили пектиназой (Rhizopus sp. E.C. 3.2.1.15). Полисахариды SAI (271 мг) и SAII (270 мг) растворяли в дистиллированной воде и добавляли 1 мл ферментного раствора, содержащего 2,3 мг энЭо-полигалактуроназы. Гидролиз проводили с одновременным диализом при 30 °Св течение 24 ч. Затем растворы нагревали на водяной бане при 100 °С в течение 2 мин и удаляли осадок белка центрифугированием. К растворам полисахаридов повторно приливали по 1 мл раствора пектиназы (2,3 мг) и проводили ферментативный гидролиз с одновременным диализом в течение 24 ч при 30 °С. Затем фермент дезактивировали нагреванием на водяной бане и после удаления белка центрифугированием осаждали полисахариды добавлением четырехкратного объема 96%-ного этилового спирта. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в минимальном количестве воды и высушивали лиофильно. Получили фракции SAIF (160 мг) и SAIIF (149 мг) (табл. 4).
Антиоксидантную активность водных растворов полисахаридов рябины (0,5 мг/мл) определяли спектрофотометрическим методом по реакции с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразидом при pH 7,9 (трис-HCl буфер). В качестве положительного контроля использовали тролокс [12].
Обсуждениерезультатов
Извлечение водорастворимых полисахаридов из свежесобранных плодов рябины обыкновенной S. aucuparia L. проводили по методу, позволяющему выделять водорастворимые полисахариды из расти -тельного материала в нативном состоянии [10]. Характеристика полученных фракций полисахаридов приведена в таблице 1.
Анализируя данные таблицы 1, можно отметить, что фракции SAI и SAII представлены кислыми полисахаридами (содержание остатков гликуроновых кислот - 62-68%) с достаточно высокой степенью метилэте-рифицирования (49-51%).
Таблица 1. Состав фракций водорастворимых полисахаридов рябины обыкновенной
Фракция Выход, CM, Содержание, %
%* % Гликуроновые кислоты Ara Gal Rha Xyl Man Glc Белок
SAI 0,9 51 62 4,7 2,8 0,5 0,3 0,3 2,8 16
SAII 3,3 49 68 12,3 3,0 0,6 Сл Сл 1,3 8
* - выход в пересчете на сухой растительный материал; Сл - следовые количества.
Как видно из результатов, представленных в таблице 1, в составе водорастворимых полисахаридов плодов рябины обыкновенной содержатся остатки нейтральных моносахаридов: арабинозы (Ara), галактозы (Gal), глюкозы (Glc), ксилозы (Xyl), рамнозы (Rha) и маннозы (Man). Их общее количество составляет 11,4 и 17,2% для фракций SAI и SAII соответственно. Основными из них являются остатки арабинозы, галактозы и глюкозы. При этом фракция полисахаридов SAII, выделенная из протопектинового комплекса клеточных стенок плодов рябины обыкновенной с помощью 0,7%-ного раствора оксалата аммония, характеризуется высоким содержанием остатков арабинозы (до 12,3%). Это характерно для пектинов плодов и ягод некоторых видов растений. Так, например, пектиновые полисахариды, входящие в состав протопектина клеточных стенок плодов шиповника морщинистого, могут содержать от 14,9 до 18,3% арабинозы (в зависимости от степени созревания плодов) [13].
Для определения гомогенности фракций исходных полисахаридов SAI и SAII, а также очистки их от сопутствующих примесей с целью дальнейшего изучения их состава и строения углеводных цепей проведена их гельхроматография на сефакриле S-500.
В результате гельхроматографии исходных полисахаридов SAI и SAII получены фракции SAIS (Kav - 0,55) и SAIIS (Kav - 0,79) соответственно (табл. 2).
Небольшие значения Kav говорят о том, что полисахариды плодов рябины являются относительно низкомолекулярными, а наличие одного пика на хроматограммах и высокий выход (54-70%) указывают на то, что фракции SAI и SAII достаточно гомогенны по молекулярным массам полисахаридов, входящих в их состав (табл. 2).
Методом ГЖХ-МС триметилсилильных производных (после гидролиза 2 М полисахаридов раствором TFA) из гликуроновых кислот в составе фракций SAIS и SAIIS идентифицированы только остатки галакту-роновой кислоты (GalA). Их количество во фракциях полисахаридов SAI и SAII составляет 52 и 65% соответственно. Такое высокое содержание галактуроновой кислоты свидетельствует о принадлежности водо -растворимых полисахаридов плодов рябины обыкновенной к пектиновым полисахаридам. Более низкое содержание остатков глюкозы во фракциях SAIS и SAIIS, а также арабинозы в SAIIS, по сравнению с исходными SAI и SAII, можно объяснить тем, что хроматографией на сефакриле S-500 они были освобождены от примесей низкомолекулярных резервных глюканов и арабинанов. Вместе с тем количество остатков галактозы и рамнозы в полученных с помощью гельфильтрации полисахаридах возрастает (табл. 1 и 2). Это может свидетельствовать о том, что данные моносахаридные остатки входят в состав боковых и основных углеводных цепей пектинов рябины.
Фракции SAIS и SAIIS содержат незначительное количество веществ белковой природы, которые не удаляются при гельфильтрации. Вероятно, они образуют с полисахаридами прочно связанные агрегаты.
Для определения размеров окисных циклов и порядка связей нейтральных моносахаридов, входящих в состав боковых углеводных цепей пектиновых полисахаридов рябины, был использован классический метод метилирования (метод Хеуорзса) и проведено исчерпывающее метилирование фракций SAIS и SAIIS по методу Хакомори [9].
В составе гидролизатов метилированных полисахаридов SAIS и SAIIS после восстановления и ацетилиро-вания производных моносахаридов с помощью ГЖХ-МС идентифицированы 1,5-связанные остатки арабино-фуранозы, 1,4-связанные остатки глюкопиранозы, 1,6-связанные остатки галактопиранозы, 1,3,6-связанные остатки маннопиранозы и терминальные остатки глюкопиранозы. В составе гидролизатов метилированного полисахарида SAII также идентифицированы 1,3,6-связанные остатки галактопиранозы (табл. 3).
Наличие 1,3,6-связанных остатков маннопиранозы и 1,3,6-связанных остатков галактопиранозы может указывать на то, что разветвление боковых углеводных цепей пектиновых полисахаридов рябины происходит по данным остаткам. На нередуцирующих концах боковых углеводных цепей расположены остатки глюкопиранозы.
Таблица 2. Состав фракций водорастворимых полисахаридов рябины обыкновенной после гельфильтрации на сефакриле S-500
Фракция Выход, CM, % Содержание, %
%* GalA Ara Gal Rha Xyl Man Glc Белок
SAIS 54 42 52 5,6 5,1 0,8 0,4 0,3 1,1 10
SAIIS 70 24 65 8,6 6,0 3,0 0,5 0,3 0,9 5
* - выход от количества материала, нанесенного на колонку; ** - см. примечание к таблице 1.
Можно отметить, что состав нейтральных моносахаридов и строение боковых углеводных цепей полисахаридов SAIS и SAIIS плодов рябины S. aucuparia L. типично для рамногалактуронана-I (RG-I), входящего в состав многих пектиновых полисахаридов [14].
Для доказательства наличия в пектиновых полисахаридах SAI и SAII цепей галактуронана был проведен их ферментативный гидролиз пектиназой (Rhizopus sp., 3.2.1.15), обладающей эндо-пот-галактуроназной активностью. Методом нисходящей распределительной БХ в водных растворах продуктов ферментативного гидролиза SAI и SAII обнаружена смесь свободной галактуроновой кислоты и олигосахаридов, а при добавлении к водным растворам продуктов ферментолиза четырехкратных объемов 96%-ного этанола получены фрагменты SAIF и SAIIF, устойчивые к действию фермента, состав которых приведен в таблице 4.
Существенная деградация полисахаридов SAI и SAII эндо -полигалактуроназой (выход фракций SAIF и SAIIF 59 и 55% соответственно) указывает на то, что в составе главных углеводных цепей пектиновых полисахаридов рябины содержатся протяженные участки, образованные 1,4-связанными остатками a-D-галакто-пиранозилуроновой кислоты. Значительное содержание остатков галактуроновой кислоты (44-52%) в полученных фрагментах можно объяснить наличием метоксильных групп. Степень метилэтерифицирования остатков галактуроновой кислоты во фрагментах SAIF и SAIIF значительно выше (70-73%), чем в исходных пектинах SAII и SAII (табл. 1 и 4). В то же время известно, что наличие метоксильных групп и разветвлений в углеводных цепях снижает полноту гидролиза пектиновых полисахаридов энЭо-полигалактуроназой [15].
Следует также отметить, что образующиеся в результате ферментативного гидролиза фракций SAI и SAII фрагменты SAIF и SAIIF характеризуются повышенным содержанием остатков нейтральных моносахаридов (до 29,9 и 26,2% для фракций SAIF и SAIIF соответственно) с преобладанием остатков арабинозы. Это указывает на то, что боковые углеводные цепи пектиновых полисахаридов рябины содержат участки, образованные 1,5-связанными остатками арабинофуранозы (табл. 4). Относительно небольшое содержание остатков рамнозы как в исходных полисахаридах SAI и SAII, так и в продуктах их ферментативного гидролиза SAIF и SAIIF может свидетельствовать о низкой разветвленности основных углеводных цепей пектиновых полисахаридов рябины.
Таким образом, данные гельфильтрации и ферментативного гидролиза показывают, что водорастворимые полисахариды плодов рябины обыкновенной представлены пектиновыми полисахаридами, основные углеводные цепи которых содержат протяженные линейные области галактуронана (рамногалактуронана) и разветвленные области, состоящие из нейтральных моносахаридных остатков, характерных для RG-I. В состав боковых цепей входят участки, состоящие из 1,5-связанных остатков арабинозы. Как следует из результатов, приведенных в таблице 1, общее содержание пектиновых полисахаридов в плодах рябины обыкновенной составляет 4,2% на сухой вес растительного материала. При достаточно высокой урожайности рябины такое количество позволяет рассматривать данное растение как перспективный источник пектинов.
При изучении физиологической активности пектиновых полисахаридов рябины обыкновенной
S. aucuparia L. SAIF и SAII показано, что антиоксидантная активность их водных растворов при концентрации 0,5 мг/мл составляет 53 и 37% соответственно от активности тролокса, принятой за 100% [11].
Таблица 4. Состав фракций пектиновых полисахаридов рябины обыкновенной после ферментативного
гидролиза
Выход, TM % Содержание, %
%* GalA Ara Gal Rha Xyl Man Glc Белок
SAIF 59 70 52 24,0 3,5 0,6 0,9 0,3 0,6 9
SAIIF 55 73 44 18,7 4,1 1,0 1,0 0,3 1,1 7
* - выход от количества полисахарида, взятого на ферментативный гидролиз.
Таблица 3. Результаты анализа пектиновых полисахаридов рябины методом метилирования
Положение метильных групп Связь
2,3-0-Me2-Ara/ ^5)-Ara/-(1^
2,4-0-Me2-Man/> ^3,6)-Man^-(1^
2,3,4,6-0-Me4-Glcp Glcp-(1^
2,3,6-0-Me3-Glcp ^4)-Glcp-(1^
2,3,4-0-Me3-Galp ^6)-Galp-(1^
2,4-0-Me2- Galp ^3,6)- Galp -(1^
Выводы
1. Из плодов рябины обыкновенной с суммарным выходом 4,2% выделены пектиновые полисахариды. Показано, что в их состав в качестве основного компонента входят остатки галактуроновой кислоты. Из нейтральных моносахаридов преобладают остатки арабинозы, галактозы и глюкозы, а остатки рамнозы, ксилозы и маннозы присутствуют в минорных количествах.
2. С помощью ферментативного гидролиза эндо-полигалактуроназой показано, что основные углеводные цепи пектиновых полисахаридов плодов рябины содержат протяженные линейные области гомогалактуронана (рамногалактуронана) и разветвленные области, содержащие нейтральные моносахаридные остатки, характерные для рамногалактуронана-I.
3. С помощью метода метилирования определены размеры окисных циклов нейтральных моносахарид -ных остатков, а также показано, что боковые углеводные цепи пектиновых полисахаридов плодов рябины содержат 1,5-связанные остатки арабинофуранозы, 1,4-связанные остатки глюкопиранозы, 1,6-связанные остатки галактопиранозы, 1,3,6-связанные остатки маннопиранозы и 1,3,6-связанные остатки галактопира-нозы. На нередуцирующих концах углеводных цепей находятся остатки глюкопиранозы.
4. Показано, что водные растворы пектиновых полисахаридов плодов рябины обыкновенной проявляют выраженную антиоксидантную активность.
Список литературы
1. Турова А.Д. Лекарственные растения СССР и их применение. М., 1974. 424 с.
2. Шнайдман Л.О., Кущинская И. Н., Мительман М. К. и др. Биологически активные вещества плодов рябины обыкновенной и перспективы их промышленного использования // Растительные ресурсы. 1971. Т. 7, №1. С. 68-71.
3. Usov A.I., Bilan M.I., Klochkova N.G. Polysaccharides of algae. 48. Polysaccharide composition of several calcareous red algae: isolation of alginate from Corallinapilulitara // Bot. Marina. 1995. V. 38, N 3. Pp. 43-51.
4. Wood P.J., Siddiqui I.R. Determination of methanol and its application to measurement of pectin ester content and pectin methyl esterase activity // Analyt. Biochem. 1971. V. 39. Pp. 418-428.
5. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Pholin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. Pp. 265-275.
6. York W.S., Darvill A.G., McNeil M.A., Stevenson T.T., Albersheim P. Isolation and characterization of plant cell walls and cell-wall components // Meth. Enzymol. 1985. V. 118. Pp. 3-40.
7. Костенко В.Г. Хроматографический анализ сахаров, получаемых в процессе переработки растительного сырья. М., 1984. 44 с.
8. Чармс Ш., Фишбейн Л., Ватман Дж., Вейнстейн М., Каулинг Г., Дольфин Д., Харборн Дж., Ледерер М., Янак Я., Адлард Э. Хроматография. Практическое приложение метода. М., 1986. Т. 2. 422 с.
9. Hakomori S. A rapid per methylation of glycolipid and polysaccharide catalyzed by methyl sulfoxide // J. Biochem. 1964. V. 55, N2. Pp. 205-208.
10. Патент РФ №2149642. Способ получения из растительного сырья полисахаридов, обладающих иммуностимулирующим действием / Р.Г. Оводова, О.А. Бушнева, В.В. Головченко, С.В. Попов, Ю.С. Оводов / БИ., 2000. №15.
11. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebera P.A., Smith F. Colorimetric method for determinated sugar and related substances // Analyt. Chem. 1956. V. 28, N2. Pp. 350-356.
12. Yang S.S., Cheng K.T., Lin Y.S., Liu Y.W., Hou W.C. Pectin hydroxamic acid exhibit antioxidant activities in vitro // J. Agric. Food Chem. 2004. V. 52. Pp. 4270-4273.
13. Злобин A.A., Оводова Р.Г. Водорастворимые пектины в процессе созревания плодов Rosa rugosa (Rosaceae) // Растительные ресурсы. 2007. Т. 43, Вып. 2. С. 52-59.
14. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность // Биоорганическая химия. 1998. Т. 24, №7. С. 483-501.
15. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М., 2000. 512 с.
Поступило в редакцию 17 мая 2010 г.
