CC BY
76
УДК 547.458:547.458.87:547.458.88
СТРУКТУРНО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АБИЕНАНА -ПЕКТИНА ДРЕВЕСНОЙ ЗЕЛЕНИ ПИХТЫ СИБИРСКОЙ ABIES SIBIRICA L.
© Е.Н. Макарова , Е.Г. Шахматов
Институт химии Коми НЦ УрО РАН, ул. Первомайская, 48, Сыктывкар,
167982 (Россия) e-mail: elena-makarova@chemi.komisc.ru
Из свежесобранной древесной зелени пихты сибирской (Abies sibirica Ledeb.) выделен и охарактеризован пектиновый полисахарид, ранее названный нами абиенаном. Установлено, что макромолекула абиенана, подобно многим пектиновым полисахаридам растений, состоит из линейной и разветвленной областей. Результаты ионообменной хроматографии и частичного кислотного гидролиза свидетельствуют о том, что макромолекула абиенана содержит участки линейного 1,4-а-Б-галактуронана. Боковые углеводные цепи разветвленной области построены, главным образом, из остатков арабинофуранозы и галактопиранозы.
Ключевые слова: пихта сибирская Abies sibirica Ledeb.; полисахариды растений; пектины, структура.
Работа выполнена в соответствии с планами НИР ИХ Коми НЦ УрО РАН на 2009-2011 г. (№ гос. регистр. 01.2.0095077) и при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (госкон-тракт №16.512.11.2012).
Введение
В последние годы значительное внимание исследователей направлено на изучение структуры пектиновых веществ в связи с их ценными физико-химическими свойствами и высокой физиологической активностью [1, 2]. Пектиновые полисахариды присутствуют практически во всех высших наземных растениях, в ряде морских и пресноводных трав и отличаются большим структурным разнообразием.
Лучше других изучены пектины плодов и овощей, пектины древесины и древесной зелени практически не изучены [3-7].
Пихта сибирская (Abies sibirica Ledeb.) широко распространена на северо-востоке европейской части России, в Западной и Восточной Сибири, издавна используется в официальной и народной медицине для профилактики и лечения ряда заболеваний. Экстракт хвои A. sibirica обладает адаптогенным, антибактериальным, антиоксидантным, противовоспалительным действием [8].
Данные по структуре водорастворимых полисахаридов пихты в литературных источниках практически отсутствуют [9-18].
Ранее было установлено, что древесная зелень пихты может служить ценным источником пектина, который обладает биологической активностью, оказывая влияние на всхожесть и скорость прорастания семян, рост корней и проростков пшеницы мягкой Triticum aestivum L [19, 20].
С помощью жесткого кислотного гидролиза (2 М TFA, 100 °С, 5 ч.) установлено, что углеводная цепь абиенана состоит, главным образом, из остатков D-галактуроновой кислоты, а также нейтральных моносахаридов: галактозы, арабинозы и рамнозы, в качестве минорных компонентов присутствуют остатки апиозы, ксилозы, глюкозы и маннозы [20].
При ферментативной обработке абиенана 1,4-а^-полигалактуроназой, наблюдается значительное расщепление его углеводной цепи, которое сопровождается образованием свободной галактуроновой кислоты. Это указывает на наличие в углеводной цепи абиенана 1,4-связанных остатков a-D-галактуроновой кислоты, являющейся, как известно, главным компонентом пектиновых веществ [20].
* Автор, с которым следует вести переписку.
Настоящая работа посвящена предварительному изучению структурно-химической характеристики абиенана - водорастворимого пектинового полисахарида древесной зелени пихты сибирской (Abies sibirica Ledeb.) с помощью методов химии углеводов: ионнобменная хроматография и частичный кислотный гидролиз.
Экспериментальная часть
Общие экспериментальные условия. Общее содержание углеводов в растворах определяли реакцией с фенолом в присутствии концентрированной H2SO4 [21]; содержание гликуроновых кислот - по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии концентрированной H2SO4 [22] (калибровочный график построен для D-галактуроновой кислоты, фотоколориметрирование проводили при двух длинах волн 400 и 450 нм); содержание белка - по методу Лоури [23] (калибровочный график для бычьего сывороточного альбумина, фотоколориметрирование проводили при 750 нм). Количество метоксильных групп определяли по методу [24] и калибровочному графику, построенному для метанола, фотоколориметрирование - при 412 нм. Спектрофотометрические измерения проводили на приборе Ultrospec 3000 (Англия).
Полный кислотный гидролиз. К навеске (2-5 мг) исследуемого образца добавляли 1 мл 2М трифтор-уксусной кислоты (TFA), содержащей мио-инозит (0,5-1,0 мг/мл). Смесь термостатировали 5 ч при 100 °С. Избыток кислоты удаляли многократным упариванием гидролизата досуха с метанолом. Нейтральные моносахариды идентифицировали методом ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов [25].
Идентификацию моносахаридов проводили используя распределительную нисходящую БХ на бумаге Filtrak FN-12 и FN-13 в системе н-бутанол: пиридин: Н2О (6 : 4 : 3, по объему), индикацию пятен моносахаридов осуществляли кислым анилинфталатом при 105 °С.
Оптическое вращение водных растворов полисахаридов определяли на поляриметре Polatronic MHZ (Германия).
ГЖХ выполняли на хроматографе Hewlett-Packard 4890A (США) с пламенно-ионизационным детектором и интегратором HP 3395А на капиллярной колонке RTX-1 (0,25 мм 0 х 30 м, Restek), газ-носитель -He, в программе: от 175 °С (1 мин) до 250 °С (2 мин) со скоростью 3°/мин. Процентное содержание моносахаридов от суммарного содержания препарата вычисляли из площадей пиков, используя коэффициенты отклика детектора [25]. В качестве внутреннего стандарта использовали мио-инозит.
Молекулярно-массовое распределение пектиновых полисахаридов определено методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Образец (3 мг) растворяли в 0,15 М NaCl и фильтровали. Для анализа использовали хроматографическую систему (Shimadzu, Япония), включающую насос LC-20AD, дегазатор DGU-20A3, термостат CT0-10AS, рефрактометр RID-10A, колонки Shodex OH-pak SB-804 HQ (7.6 мм х 30 см) с предколонкой Shodex GS-2G 7B (7,6 мм х 5 см) (Shimadzu, Япония). Элюирование проводили 0,15 M раствором NaCl, содержащим 0,02% NaN3. Хроматографирование проводили при 40 °С, скорость подачи элюента 0,3 мл/мин. В качестве стандартов использовали пуллуланы (Fluka, Германия, Mw 1,3, 6, 12, 22, 50, 110, 200, 400, 800 кДа). Средневесовая молекулярная масса (Mw), среднечисловая молекулярная масса (Mn) и фактор полидисперсности (Mw/Mn) были рассчитаны программой LCsolu-tionGPC (LCsolution, версия 1.24 SP1). Образцы и стандарты были исследованы в двух повторностях.
Все водные растворы концентрировали в вакууме при 40-45 °С, центрифугировали при 4000-6000xg в течение 10-20 мин, образцы лиофилизовали на приборе (Virtis, США).
Экстракция полисахаридов. В качестве исходного материала использовали образцы древесной зелени (охвоенные концы ветвей (лапка) диаметром в отрубе не более восьми миллиметров) пихты сибирской (Abies sibirica Ledeb.), собранные в окрестностях Сыктывкара (Республика Коми, Россия).
Свежесобранный материал измельчали и экстрагировали органическими растворителями (этилаце-тат, хлороформ) в аппарате Сокслета для удаления низкомолекулярных примесей. Полученный обезжиренный воздушно-сухой остаток сырья (100 г) экстрагировали дистиллированной водой (по 2 л) при перемешивании при 70 °С до отрицательной реакции с фенолом в присутствии концентрированной серной кислоты (2 ч х 5) [21]. Остаток сырья отделяли центрифугированием. Супернатанты объединяли, концентрировали и центрифугировали. Полисахариды осаждали 3-кратным объемом 96%-ного этанола. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в воде и диализовали против дистиллированной воды, центрифугировали, концентрировали и лиофилизовали. Получили абиенан AS1.
Ионообменная хроматография водорастворимой полисахаридной фракции на DEAE-целлюлозе. Образец водорастворимого полисахарида массой 50 мг растворяли в 0,01 М NaCl (3 мл), фильтровали, фильтрат наносили на колонку (34,5 х 2,2 см) с DEAE-целлюлозой (Cl-форма) и элюировали со скоростью
60 мл/ч. Колонку элюировали последовательно 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 М водными растворами №С1. Элю-цию полисахаридов контролировали по положительной реакции элюата на углеводы по методу Смита [21]. Объединенные фракции, соответствующие отдельным пикам на выходной кривой, диализовали и лиофилизовали. В результате получили полисахаридные фракции Л8Б^1 и Л8Б^2, которые элюируются 0,2 и
0,3 М растворами хлорида натрия. Состав фракций приведен в таблице 1.
Частичный кислотный гидролиз. К навеске абиенана (200 мг) добавляли 0,05 М ТТЛ (40 мл), смесь термостатировали при 70 °С в течение 4 ч. Гидролизат концентрировали и осаждали 3-кратным объемом 96%-ного этанола. Выпавший осадок отделяли центрифугированием, промывали этиловым спиртом до отсутствия моносахаридов в супернатанте, растворяли в воде и лиофилизовали. Получили фракцию абиенана Л8И-1, выход 168 мг. Полученные спиртовые супернатанты объединяли, концентрировали. Сконцентрированный супернатант осаждали 96%-ным этанолом, выпавший осадок отделяли центрифугированием, промывали этиловым спиртом до отсутствия моносахаридов в супернатанте, растворяли в воде и лиофилизовали. Получили фракцию абиенана Л8И-1-1. Спиртовые экстракты объединяли и упаривали до постоянного веса. Получили фракцию моносахаридов Л8И-1-2.
К полисахаридному фрагменту Л8Н-1 (160 мг) добавляли 0,1 М ТБЛ (32 мл), смесь термостатирова-ли при 70 °С в течение 4 ч. Гидролизат обрабатывали, как описано выше. Получили фракцию абиенана Л8Н-2, выход 124 мг.
К полисахаридному фрагменту Л8Н-2 (114 мг) добавляли 1 М ТБЛ (22 мл), смесь термостатировали при 70 °С в течение 4 ч. Гидролизат обрабатывали, как описано выше. Получили фракции абиенана Л8Н-3 (выход 85 мг) и Л8Н-3-1.
К полисахаридному фрагменту Л8Н-3 (75 мг) добавляли 2 М ТТЛ (15 мл), смесь термостатировали при 100 °С в течение 2 ч. Гидролизат обрабатывали, как описано выше. Получили галактуронан Л8Н-4 (выход 28 мг) и фракцию моносахаридов Л8И-4-2.
Состав фракций приведен в таблице 2.
Спектры ЯМР снимали на приборе «Вгикег-АМ 300», для 3-5%-ных растворов олиго- и полисахаридов в Б20 (99,96% Б) при 55 °С (внутренний стандарт - ацетон, 5н 2,225 м. д., 5с 30,89 м. д.).
Результаты и их обсуждение
Абиенан А8і был выделен из свежесобранной древесной зелени пихты сибирской, заготовленной в сентябре в окрестностях Сыктывкара (Республика Коми, Россия). Свежесобранный растительный материал измельчали и экстрагировали органическими растворителями (этилацетат, хлороформ) для удаления низкомолекулярных примесей. Полученный обезжиренный воздушно-сухой остаток сырья экстрагировали дистиллированной водой, с последующим осаждением 96%-ным этиловым спиртом. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в воде, диализовали и лиофилизовали.
Абиенан А81 характеризуется высоким содержанием Б-галактуроновой кислоты (58,0%), незначительным содержанием сопутствующего белка 4,6%, высокой степенью метилэтерифицирования остатков галактуроновой кислоты (СМ~57%). Данные по определению количественного и качественного моносаха-ридного состава приведены в таблице 1.
Абиенан А81 исследован методом ионообменной хроматографии на БЕЛЕ-целлюлозе (С1-форма) при последовательном элюировании 0,01, 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4 М водными растворами №С1. В результате установлено, что исходная фракция гетерогенна по составу и состоит из пектиновых полисахаридов, отличающихся соотношением остатков галактуроновой кислоты и нейтральных моносахаридов. Абиенан Л81 состоит, главным образом, из двух полисахаридов, элюируемых 0,2 М №С1 (Л8Б1-1, выход 40%) и 0,3 М №С1 (Л8Б1-2, выход 13%), содержащих 59 и 64% остатков галактуроновой кислоты соответственно (табл. 1).
Фрагмент Л8Б1-1 имеет положительное удельное вращение [а]Б° +136° (с 0,1; вода), характерное для пектиновых полисахаридов.
Таким образом, основным компонентом полученных полисахаридов является Б-галактуроновая кислота, что свидетельствует об их принадлежности к классу пектинов. Кроме того, в углеводной цепи полисахаридов присутствуют остатки таких нейтральных моносахаридов, как арабиноза, галактоза и рамноза, типичные для пектинов.
Методом ВЭЖХ установлено, что полисахаридная фракция Л8Б1-1 имеет полидисперсный характер: степень дисперсности составляет 9, средневесовая молекулярная масса 147 кДа.
Таблица 1. Выход и характеристика компонентов абиенана А8ь полученных при фракционировании на ББАБ-целлюлозе
Фракции Выход, %* Содержание, % (вес.)
Б-Оа^А Белок Моносахариды
Ар1 КЬа Ага Ху1 Мап О1с Оа1
А81 * * 40 СЧ 58,0 4,6 1,3 3,0 14,0 0,5 1,9 2,9 8,0
А8Б^1 40,0 59,0 3,6 1,4 1,5 13,1 0,3 0,4 2,0 8,7
А8Б^2 13,0 64,0 3,0 1,4 1,3 11,0 0,4 0,8 2,3 7,5
* Выход от количества А8Ь нанесенного на колонку с ББАБ-целлюлозой. ** Выход абиенана А8Ь от массы воздушно-сухого обезжиренного сырья.
Для установления строения макромолекулы абиенана был проведен частичный кислотный гидролиз полисахарида ТТА различной концентрации.
В результате частичного кислотного гидролиза 0,05 М ТТА пектина АБ1 образуются две полисахаридные фракции А8И-1 и А8И-1-1. Основной по выходу фрагмент А8И-1 характеризуется более высоким содержанием остатков галактуроновой кислоты и более низким содержанием остатков нейтральных моносахаридов, в сравнении с исходной фракцией. В результате отщепления от А81 боковых цепей, общее содержание галактуроновой кислоты во фракции А8И-1 увеличилось до 67%. Содержание нейтральных мо-носахаридных остатков уменьшилось до 26% (табл. 2).
Мягкий гидролиз 0,05 М ТТА приводит к разрушению боковых цепей, образованных, главным образом, остатками арабинозы и галактозы, и появлению в гидролизате моно- и олигосахаридов. Из супернатанта, полученного при осаждении гидролизата абиенана этиловым спиртом, в качестве минорного компонента был выделен фрагмент А8И-1-1, который отличается низким содержанием галактуроновой кислоты (36%). Главными нейтральными моносахаридными остатками данного фрагмента являются арабиноза и галактоза. Вероятно, выделенный фрагмент входит в состав разветвленной области макромолекулы абиенана А8ь
Из спиртового супернатанта также получили смесь моносахаридов А8Н-1-2, содержащую, главным образом, остатки арабинозы (53,0%) (табл. 2). Это говорит о том, что в составе боковых цепей абиенана находятся значительные участки, образованные остатками арабинофуранозы. Относительно высокое содержание остатков арабинозы указывает на фуранозную форму и лабильность связей между остатками данного моносахарида, а также может свидетельствовать о терминальном расположении остатков арабинофуранозы или наличии боковых цепей, состоящих из остатков арабинофуранозы.
При дальнейшей обработке полисахарида более высокой концентрацией ТТА (0,1 М, 1 М) образуются фрагменты А8Н-2 и А8Н-3 соответственно, в которых наблюдается дальнейшее увеличение содержания остатков Б-галактуроновой кислоты (до 72%) и снижение содержания остатков арабинозы (до 5,3%) (табл. 2).
Это подтверждает предположение о том, что главным компонентом углеводной цепи абиенана А81 является 1,4-а-Б-галактуронан, что подтверждает его принадлежность к классу пектиновых полисахаридов.
Из супернатанта, полученного при осаждении гидролизата абиенана (1 М ТТА) этиловым спиртом, в качестве минорного фрагмента была выделена фракция А8Н-3-1, представляющая собой фрагмент гете-рогликаногалактуронана, который отличается повышенным содержанием остатков галактозы (10,1%) и арабинозы (12,6%), и более низким содержанием остатков галактуроновой кислоты (41%).
Таблица 2. Характеристика фрагментов абиенана А81, полученных частичным кислотным гидролизом при
различных концентрациях ТТА
Фракции Выход, %* Содержание, % **
Белок Оа1рА Ар1 Ага Ху1 Мап О1с Оа1 КЬа
А8Н-1 84,0 3,5 67,3 1,3 12 0,4 1,2 3,0 6,5 1,2
А8Н-1-1 3,4 4,8 36 0,6 9,7 0,5 1,0 1,8 3,6 2,0
А8Н-1-2 6,7 1,6 53,0 0,5 0,4 1,5 3,8 2,4
А8Н-2 65,0 3,6 70,0 1,2 11,3 0,2 0,9 3,7 7,9 1,2
А8Н-3 49,0 3,3 72,0 1,0 5,3 0,2 1,1 3,5 8,9 1,4
А8Н-3-1 5,2а 4,5 41,0 0,7 12,6 0,2 1,2 5,5 10,1 2,5
А8Н-4 19,0 3,5 95 сл, сл, сл, 0,4 0,5 0,4 0,1
А8Н-4-2 40,0в 1,7 11,5 0,5 2,1 5,9 19,8 3,4
* От исходного абиенана А81. ** Весовые проценты. а От фракции А8Н-2. в От фракции А8Н-3. сл. - Следовое количество.
1 1 1 1 1 1 1 170 160 150 140 130 120 і і | і і 110 100 90 і , | . і 80 70
ррт(Н)
13С ЯМР-спектр фрагмента Л8Н-4
При гидролизе фрагмента Л8И-3 2 М ТТЛ. в течение 2 ч при 100 °С, наряду со свободными моносахаридами (Л8Н-4-2), образуется галактуронан Л8И-4, содержаший 95% Б-галактуроновой кислоты, высокий положительный угол удельного вращения [а]Б° +250° (с 0,1, И20) которого свидетельствует об а-конфигурации гликозидных связей остатков Б-галактуроновой кислоты.
Характерной особенностью полученного галактуронана является низкая степень метоксилирования карбоксильных групп остатков Д-галактуроновой кислоты (СМ 7,6%).
Положение сигналов в спектре 13С-ЯМР фрагмента Л8И-4 указывает на наличие в углеводной цепи участков из 1,4-а-связанных остатков Б-галактопиранозилуроновой кислоты, которые дают сигнал ано-мерного углеродного атома при 100,0 м.д. Положения сигналов остальных атомов (С2 68,7, С3 69,1, С4 78,7, С5 71,5, С6 174,7 м.д.) остатков Б-галактуроновой кислоты соответствуют таковым для 13С-ЯМР-спектров заведомого 1,4-а-Б-галактопиранозилуронана [26].
Кроме того, сигнал С6-атома остатков галактуроновой кислоты (174,7 м.д.) в спектре 13С ЯМР галактуронана Л8Н-4 указывает на то, что остатки галактуроновой кислоты преимущественно не несут ме-токсильных групп.
Из спиртового супернатанта получили смесь моносахаридов Л8Н-4-1, содержащую, главным образом, остатки арабинозы (11,5%) и галактозы (19,8%) (табл. 2.). Это свидетельствует о том, что выделенный фрагмент входит в состав разветвленной области абиенана Л8Ь
Выводы
На основании полученных результатов установлено, что, подобно многим пектиновым полисахаридам растений, макромолекула абиенана состоит из линейной и разветвленной областей.
Результаты ионообменной хроматографии, частичного кислотного гидролиза и ЯМР-спектроскопии указывают на то, что линейная область макромолекулы абиенана представлена участками 1,4-а-О-галакто-пиранозилуронана, разветвленная область - участками рамногалактуронана I. Боковые углеводные цепи разветвленной области абиенана образованы, главным образом, из остатков галактопиранозы и арабино-фуранозы.
Авторы выражают благодарность сотрудникам лаборатории гликологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН В.В. Головченко, О.А. Патовой за определение молекулярно-массового распределения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Список литературы
1. Оводов Ю.С. Современные представления о пектиновых веществах // Биоорганическая химия. 2009. Т. 35, №3. С. 293-310.
2. Оводов Ю.С., Оводова Р.Г., Попов С.В. Биогликаны - иммуностимуляторы. Строение и свойства // Фитотерапия, биологически активные вещества естественного происхождения. Черноголовка, 2004. С. 348-363.
3. Комисаренко С.Н. Пектины - их свойства и применение // Растительные ресурсы. 1998. Вып. 1. С. 111-119.
4. Дадашев М.Н. Перспективы производства и применения пектиновых веществ // Хранение и переработка сельхозсырья. 2000. №9. С. 46-50.
5. Донченко Л.В. Технология пектина и пектинопродуктов. М., 2000. 255 с.
6. Иванова Н.В., Оводова Р.Г., Бабкин В.А. Общая характеристика полисахаридов коры лиственницы // Химия растительного сырья. 2006. №1. С. 15-19.
7. Ефремов А.А., Кондратюк Т.А. Выделение пектина из нетрадиционного растительного сырья и применение его в кондитерском производстве // Химия растительного сырья. 2008. № 4. С. 171-176.
8. Костеша Н.Я., Лукьяненок П.И., Стрелис А.К. Экстракт пихты сибирской «Абисиб» и его применение в медицине. Томск, 1997. 160 с.
9. Левин Э.Д., Репях С.М. Переработка древесной зелени. М., 1984. 117 с.
10. Робакидзе Е.А. Динамика углеводов в хвое ели сибирской в зависимости от экологических факторов: авто-реф. дис. ... канд. биол. наук. Сыктывкар, 2001. 24 с.
11. Робакидзе Е.А., Патов А.И. Количественный и качественный состав углеводов в формирующейся хвое ели сибирской // Физиол. растений. 2000. Т. 47, №2. С. 248-254.
12. Барабаш Н.Д., Чупрова Н.А., Репях С.М. Углеводы хвои сосны // Лесной журнал. 1983. №3. С. 124-126.
13. Новицкая Ю.Е., Чикина П.Ф., Софронова Г.И., Габукова В.В., Макаревский М.Ф. Физиолого-биохимические основы роста и адаптации сосны на Севере. Л., 1985. 156 с.
14. Новицкая Ю.Е. Физиолого-биохимические исследования сосны на Севере. Петрозаводск, 1978. 135 с.
15. Оводова Р.Г., Кушникова Е.А., Попов С.В., Бушнева О.А. Выделение, характеристика и физиологическая активность полисахаридов из хвои // Проблемы химии древесины и лесохимии: Тр. Коми НЦ УрО РАН. Сыктывкар, 1997. С. 15-21.
16. Пелевина Н.И. Особенности углеводного обмена в культурах ели // Восстановление и защита леса на площадях избыточного увлажнения / под ред. А.И. Стратонович и др. Л., 1974. С. 139-145.
17. Судачкова Н.Е., Метаболизм хвойных и формирование древесины. Новосибирск, 1977. 228 с.
18. Васильев С.Н., Кушникова Е.А., Артемина Н.А. Динамика содержания экстрактивных веществ в древесной зелени Picea abies L. Karst // Растительные ресурсы. 2001. Т. 1. С. 49-59.
19. Макарова Е.Н., Бушнева О.А., Демин В.А. Моносахаридный состав полисахаридов древесной зелени пихты (Abies sibirica) // Химия и технология растительных веществ: Тр. Коми НЦ УрО РАН. Сыктывкар, 2005. С. 49-59.
20. Макарова Е.Н., Патова О.А. (Бушнева), Демин В.А. Полисахариды древесной зелени пихты сибирской (Abies sibirica) // Химия растительных веществ и органический синтез. Сыктывкар, 2009. С. 71-73.
21. Dubois M., Qilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Analyt. Chem. 1956. V. 28. Pp. 350-356.
22. Usov A.I., Bilan M.I., Klochkova N.G. Polysaccharide Ciomposition of Several Calcareous Red Algae: Isolation of Alginate from Corallina pilutitara // Bot. Marina. 1995. V. 38. Pp. 43-51.
23. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. Pp. 265-275.
24. Wood P.Y., Siddiqui I.R. Determination of methanol and its applicationto measurement of pectic ester content and pectin methyl esterase activity // Anal. Biochem. 1971. V. 39. Pp. 418-423.
25. York W.S., Darvill A.G., McNeil M.A., Stevenson T.T., Albercheim P. Isolation and Characterization of Plant Cell Walls and Cell-Wall Components // Methods Enzymol. 1985. V. 118. Pp. 3-40.
26. Catoire L., Pierron M., Morvan C., du Penhoat C.H., Goldberg R. Investigation of the action patterns of pect-inmethylesterase isoforms through kinetic analyses and NMR spectroscopy: implications in cell wall expansion. // J. Biol. ^em. 1998. V. 273. Pp. 33150- 33156.
Поступило в редакцию 11 февряля 2011 г.
После переработки 18 апреля 2011 г.
