CC BY
98
Химия растительного сырья. 2003. №2. С. 39-44
УДК: 577.114:581.192:574.917:633.88
ОБЩАЯ ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ПЛОДОВ ШИПОВНИКА МОРЩИНИСТОГО ROSA RUGOSA
© А.А. Злобин1, Р.Г. Оводова2, С.В. Попов2
1 Вятский государственный университет, ул. Московская, Зв, Киров,
610601 (Россия) e-mail: bioteh@riac.ru
2Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, ул. Первомайская, 50, Сыктывкар, 167982 (Россия)
Из мякоти плодов шиповника морщинистого Rosa rugosa Thunb последовательной экстракцией водой и 0,7%-ным водным раствором оксалата аммония выделены три фракции пектиновых полисахаридов, названных розолинанами. Полученные полисахариды очищены методами гельфильтрации, ионообменной хроматографии. Показано, что розолинаны характеризуются высоким содержанием галактуроновой кислоты (до 69%). Кроме того, в их состав входят нейтральные моносахариды, характерные для пектинов: арабиноза, галактоза и рамноза; в минорных количествах присутствуют остатки ксилозы и маннозы.
Работа выполнена при поддержке Министерства промышленности, науки и технологий РФ (грант № G2-42G1).
Введение
Интерес к изучению состава, свойств и структуры полисахаридов растений обусловлен тем, что некоторые из них проявляют ярко выраженную физиологическую активность. Фитополисахариды способны выводить из организма соли тяжелых металлов и радионуклидов, обладают выраженным гастропротективным эффектом, оказывают влияние на эндокринную и иммунную системы [1].
Плоды ряда видов шиповника Rosa L, широко используются в медицине и пищевой промышленности. Они содержат витамины С (в некоторых видах более 2%), В1 и В2, К1, фолиевую кислоту, фенольные соединения, в том числе флавоноиды, обладающие Р-витаминной активностью (до 3-4%), каротиноиды, значительное количество моно- и олигосахаридов, органических кислот, пектиновых и дубильных веществ, а также микро- и макроэлементы [2]. Однако состав и свойства полисахаридов плодов шиповника мало изучены. Вероятно, это связано с тем, что основными продуктами их переработки являются комплексные витаминные препараты: водные настои, экстракты, сиропы, масло шиповника и т.д. [3].
Данная работа посвящена выделению и общей химической характеристике водорастворимых полисахаридов мякоти плодов шиповника морщинистого Rosa rugosa Thunb.
Предлагаем для водорастворимых полисахаридов плодов шиповника Rosa L. общее название «розолинаны».
* Автор, с которым следует вести переписку.
Обсуждение результатов
Для выделения полисахаридов из мякоти плодов шиповника морщинистого был выбран метод истощающей последовательной экстракции растительного материала водой при 20 и 68 °С и
0,7%-ным водным раствором оксалата аммония при 68 °С после предварительной обработки сырья подкисленной водой (рН 3,8-4,0) при 50 °С (рис. 1) [4]. Выход и характеристика выделенных фракций представлены в таблице 1.
Суммарное содержание полисахаридных фракций в мякоти плодов составляет 12,4%. Наибольший выход наблюдается для фракций, растворимых в холодной и горячей воде (табл. 1). Мякоть плодов шиповника морщинистого может содержать от 2 до 6% пектиновых веществ (в пересчете на сырой растительный материал) [2].
Содержание гликуроновых кислот в выделенных полисахаридных фракциях - 41-69%, а метоксильных групп - до 3,6% (RR2).
Все три фракции розолинанов имеют идентичный качественный состав моносахаридов, характерный для пектиновых веществ, и незначительно отличаются по содержанию моносахаридных остатков. Основными моносахаридными остатками являются арабиноза (Ara), галактоза (Gal) и рамноза (Rha). Кроме того, в минорных количествах присутствуют ксилоза (Xyl) и манноза (Man).
Рис. 1. Схема выделения розолинанов
Таблица 1. Характеристика полисахаридов из плодов Rosa rugosa
Фракция Выход, %* П Содержание,%
Гликуроновые кислоты Ara Gal Rha Xyl Man Glc OMe
RR1 7,7 0,4S 41 8,0 2,4 1,5 0,5 сл 9,6 2,4
RR2 1,8 1,32 5S 8,6 4,0 1,7 0,4 сл 4,6 3,6
RR3 2,9 0,20 69 10,9 4,8 3,4 0,3 0,2 0,6 0,3
* Выход от абсолютно-сухого вещества. Сл. - следовые количества. п - характеристическая вязкость.
Достаточно высокое содержание глюкозы во фракциях КЯ1 и КЯ2 (9,6 и 4,1% соответственно) говорит о возможном наличии в их составе резервных полисахаридов. В то же время йод-крахмальный тест дает отрицательный результат, что указывает на отсутствие сопутствующего крахмала. Во фракции КЯ3 глюкоза практически отсутствует (табл. 1).
Выделенные полисахариды образуют вязкие водные растворы, что характерно для пектинов (табл. 1).
Плоды шиповника содержат антоцианы, лейкоантоцианы, катехины, флавонолы и другие соединения фенольной природы [2], которые экстрагируются совместно с полисахаридами. Содержание фенольных соединений в исходных фракциях розолинанов КЯ1, КЯ2 и КЯ3 составляет 7,5; 6,6 и 0,8% соответственно.
Присутствие в полисахаридных фракциях достаточно большого количества фенольных соединений не позволило определить содержание белка по методу Лоури [5]. Поэтому был определен его аминокислотный состав после предварительного гидролиза фракций 6 н водным раствором НС1.
Суммарное содержание аминокислот белка, входящего в состав полисахаридных фракций, находится в пределах от 2,7 (КЯ3) до 3,1% (КЯ2). Преобладающими аминокислотами являются: аспарагиновая, глутаминовая, а также гистидин, лизин и аргинин (табл. 2).
При ферментативной обработке розолинанов КЯ1, КЯ2 и КЯ3 полигалактуроназой (Rhizopus sp.) происходит значительное расщепление полисахаридов с образованием олигогалактуронидов и свободной галактуроновой кислоты (ва1Л). Это указывает на то, что в их углеводных цепях имеются линейные участки, образованные а-1,4-связанными остатками Б-галактуроновой кислоты.
Для очистки и разделения полисахаридов был использован метод гельфильтрации. В результате гель-хроматографии на сефакриле 8-500 розолинана КЯ1 выделена фракция КЯЫб (Ка„-0,57). Розолинаны КЯ2 и КЯ3 были разделены на фракции КЯ2-^ (Ка„-0) и КЯ2-2б (Ка„-0,31), КЯ3-18 (Ка„-
0,11) и КЯ3-2$ (Ка„-0,32) соответственно. Характеристики выделенных полисахаридных фракций представлены в таблице 3.
Содержание Б-галактуроновой кислоты в очищенных гель-фильтрацией полисахаридах составляет 61-72%. По составу нейтральных моносахаридов они близки розолинанам КЯ1, КЯ2 и КЯ3. Водные растворы их имеют высокие значения положительного удельного вращения, характерные для пектинов (табл. 3).
Снижение содержания глюкозы во фракциях КЯЫб, КЯ2-^ и КЯ2-2б, по сравнению с исходными КЯ1 и КЯ2, можно объяснить тем, что хроматографией на сефакриле 8-500 они были освобождены от примесей низкомолекулярных резервных глюканов (табл. 1 и 2).
Фракции КЯ2-15 и КЯ2-2б идентичны по содержанию Б-галактуроновой кислоты и нейтральных моносахаридов и отличаются лишь величиной молекулярных масс или/и надмолекулярных комплексов, образуемых ими в водных растворах. Фракция КЯ3-1$ характеризуется повышенным содержанием остатков арабинозы и галактозы (табл. 3).
Таблица 2. Содержание аминокислот, входящих в состав белка полисахаридных фракций
Содержание,%
£ Л8р 1Ъг 8ег 01и Рго 01у Л1а Су 8 Уа1 Ме1 11е Ьеу Туг РИе НІ8 Тгр Ьу8 Лгg
0,3 0,1 0,2 0,3 0,1 0,1 0,1 сл сл сл сл 0,1 сл 0,2 0,3 0,1 0,1 0,4
Ж2 0,3 0,1 0,1 0,3 0,1 0,1 0,2 сл 0,1 0,1 0,1 0,2 0,1 0,2 0,4 сл 0,3 0,3
0,3 0,1 0,1 0,3 0,1 0,2 0,2 сл 0,1 0,1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,3 сл 0,3 сл
Таблица 3. Характеристика полисахаридных фракций после разделения на сефакриле 8-500
Фракции Выход, %* [а]20/ Содержание,%
Оа1Л Лга Оа1 ЫИа Ху1 Мап О1о Белок
52 +172,5 65 13,0 4,0 2,5 сл сл 1,3 6,6
Ж2-18 34 +176,5 67 12,3 5,3 2,2 0,9 сл 1,9 7,4
Ж2-28 32 +184,5 67 12,6 5,5 2,4 1,4 сл 2.5 6,7
20 +180,4 61 17,9 7,3 3,0 сл сл 0,7 7,3
№3-28 65 +200,5 72 10,1 4,7 1,9 сл сл 0,5 4,0
* Выход от количества нанесенных на колонку фракций КЯ1, КЯ2 и ЯЯ3 соответственно.
Все фракции содержат определенное количество белка (табл. 3), который не удаляется при гельфильтрации. Вероятно, белковые примеси имеют близкую к полисахаридам молекулярную массу или образуют с ними достаточно прочно связанные агрегаты.
Содержание остаточных фенолов в очищенных гельфильтрацией полисахаридных фракциях колеблется в пределах 0,5-0,9%.
Ионообменной хроматографией розолинанов на БЕЛЕ-целлюлозе при элюировании водными растворами №С1 возрастающей концентрации выделены кислые полисахариды. Основные фракции элюировались из колонки 0.2 М (КЯ1-1, КЯ2-1, КЯ3-1) и 0.3М (КЯ1-2, КЯ2-2, КЯ3-2) растворами №С1 (табл. 4).
Содержание Б-галактуроновой кислоты в полученных фракциях колеблется от 53 до 84%. Преобладающими нейтральными моносахаридными остатками в них являются арабиноза, галактоза, рамноза и глюкоза. Для фракций, элюируемых 0,2 М раствором №С1, характерно более высокое содержание остатков арабинозы, галактозы и глюкозы (табл. 4).
Содержание остаточных фенолов составляет 0,2-0,7%, возможно, они имеют кислую природу или образуют с полисахаридами прочные комплексы.
Таким образом, на основании полученных данных можно считать, что розолинаны, выделенные из мякоти плодов шиповника морщинистого, являются пектиновыми полисахаридами и входят в состав пектиновых веществ данного вида растений.
При изучении физиологической активности пектиновых полисахаридов плодов шиповника морщинистого выявлено, что они являются нетоксичными соединениями: при однократном внутрибрюшинном введении их лабораторным мышам ЬБ50, определенная экспресс-методом [6], превышает 1000 (КЯ2) и 1360 (КЯ1 и КЯ3) мг/кг.
Розолинаны модулируют адгезивность перитонеальных макрофагов мышей. В диапазоне концентраций 100-500 мкг/мл фракция КЯ2 на 80-130% усиливает, а КЯ3 на 23-75% снижает адгезивную способность клеток.
Показано, что розолинаны обладают способностью связывать атерогенные липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови человека. Гиполипидемическая активность исходных полисахаридных фракций КЯ1, КЯ2 и КЯ3 составляет 12, 43 и 33% соответственно от активности гепарина, принятой за 100%.
Экспериментальная часть
Растительный материал. Плоды шиповника морщинистого собирали в августе в окрестностях Кирова. Плоды измельчали, отделяли семена и высушивали их мякоть.
Общие аналитические методы. Содержание галактуроновой кислоты определяли по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии конц. серной кислоты, по калибровочному графику для Б-галактопиранозилуроновой кислоты [7], белка - по методу Лоури с использованием калибровочного графика для бычьего сывороточного альбумина [5], метоксильных групп - по реакции с пентан-2,4-дионом и по калибровочному графику для метанола [8]. Общее содержание фенольных соединений определяли по методу [9, С. 128-129], используя калибровочный график для фенола. Спектрофотометрические измерения проводили на приборе иИгоБрес 3000 (Швеция).
Оптическое вращение водных растворов полисахаридов (с 0,05) определяли на приборе Ро1а1готс МЖ (Германия).
Таблица 4. Характеристика полисахаридных фракций после хроматографии на ББЛБ-целлюлозе
Фракции Выход, %* Содержание,%
Оа1Л Лга Оа1 ЫИа Ху1 Мап О1о Белок
№1-1 17 62 12,3 5,1 4,1 сл сл 2,4 7,2
№1-2 30 78 3,2 4,5 2,0 сл сл 1,4 5,7
№2-1 30 57 12,6 5,3 2,6 0,7 0,9 2,6 4,8
№2-2 20 81 4,0 2,0 1,5 0,3 0,2 1,1 2,8
№3-1 18 53 11,6 5,2 3,5 сл 0,4 1,3 2,7
№3-2 43 84 5,8 3,2 1,5 0,3 сл 0,3 1,0
* См. примечание к таблице 3.
Распределительную нисходящую бумажную хроматографию (БХ) проводили в системе растворителей н-бутанол - пиридин - вода (6 : 4 : 3) на бумаге Filtrak FN-12. Для индикации моносахаридов использовали раствор кислого анилинфталата при 105 °С [10].
Количественное содержание моносахаридов определяли методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) в виде соответствующих ацетатов полиолов [10]. ГЖХ выполняли на хроматографе Hewlett-Packard 4890A (США) с пламенно-ионизационным детектором. Разделение ацетатов полиолов проводили на капиллярной колонке RTX-1 (0,25 ммх30 м) при температурном режиме 175—> 250 °С с градиентом температуры 3 °С /мин. Газ-носитель - аргон.
Кислотный гидролиз полисахаридов проводили 2 М трифторуксусной кислотой в течение 3 ч при 100 °С. В качестве внутреннего стандарта использовали мио-инозит (0,125-0,250 мг/мл). Избыток кислоты удаляли под вакуумом с добавлением метанола. Состав моносахаридов гидролизата определяли методами БХ и ГЖХ [10].
Кислотный гидролиз белка, входящего в состав полисахаридных фракций, проводили 6н. раствором HCl при 125 °С в течение 6 ч. Содержание аминокислот в пробах определяли на аминокислотном анализаторе Biotronic LC5001 (Германия).
Вязкость водных растворов полисахаридов определяли с помощью вискозиметра Оствальда с диаметром капилляра 0,56 мм. Измерения проводили при 22±0,1 °С. Время истечения растворителя -1%-ного раствора NaCl составляет 71,4 сек [11].
Все водные растворы и пробы для ГЖХ-анализа упаривали под вакуумом при 40-45 °С.
Центрифугирование растворов проводили в течение 10 мин при 6000-8000 об /мин.
Выделение полисахаридов. Для удаления низкомолекулярных примесей и дезактивации ферментов сухую мякоть плодов подвергали обработке метанолом и хлороформом в аппарате Сокслета. Последовательную истощающую экстракцию полисахаридов из воздушно-сухого остатка сырья (100 г) проводили по ранее описанному методу [4]. Контроль полноты экстракции осуществляли фенол-сернокислотным методом [10].
Экстракты концентрировали под вакуумом, осаждали свободный белок, диализовали и выделяли полисахариды добавлением четырехкратного объема 96%-ного этилового спирта. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в небольшом количестве дистиллированной воды, диализовали и лиофилизовали (рис. 1) [4]. Выход и характеристики выделенных фракций приведены в таблице 1.
Гельфильтрация. Исходные розолинаны (20-25 мг) растворяли в 0,01 М растворе NaCl и наносили на колонку (41х1,6 см) с сефакрилом S-500. Элюирование проводили 0,01 М раствором NaCl со скоростью растворителя 18 мл/ч. Отбирали фракции объемом по 3 мл. Свободный объем колонки - 32 мл. Выход полисахаридов из колонки контролировали фенол-сернокислотным методом [10]. Фракции, соответствующие отдельным пикам, объединяли, концентрировали, диализовали и лиофильно высушивали. Характеристики фракций представлены в таблице 3.
Ионообменная хроматография. Ионообменную хроматографию проводили на DEAE-целлюлозе (Cr-форма). Навески полисахаридов (30-35 мг) в 0,01 М растворе NaCl наносили на колонку (37х1,5 см). Элюирование проводили последовательно 0,01, 0,1, 0,2, 0,3 и 0,5 М растворами NaCl со скоростью растворителя 30 мл/ч. Отбирали фракции объемом по 10 мл. Выход полисахаридов из колонки контролировали с помощью фенол-сернокислотного метода [10]. Фракции, соответствующие отдельным пикам, объединяли, концентрировали, диализовали и лиофильно высушивали (табл. 4).
Ферментативный гидролиз. Ферментативный гидролиз полисахаридов проводили пектиназой (Rhizopus sp., E.C. 3.2.1.15). Образцы розолинанов RR1 (30,4 мг), RR2 (30,2 мг) и RR3 (29,9 мг) растворяли в 9 мл дистиллированной воды и добавляли 1 мл раствора, содержащего 1,2 мг полигалактуроназы. Гидролиз проводили в течение 3 ч при 37° С. Фермент дезактивировали нагреванием на водяной бане при 100° С в течение 5 мин. Белок, выпавший в осадок, удаляли центрифугированием, а супернатант концентрировали до 0,5 мл и добавляли 96%-ный этанол (четырехкратный объем). Осадок отделяли центрифугированием и промывали метанолом до отрицательной реакции на моносахариды [10]. Спиртовый супернатант концентрировали и анализировали методом БХ [10]. Осадок растворяли в 3 мл дистиллированной воды, добавляли 1 мл раствора полигалактуроназы (1,5 мг) и повторно проводили гидролиз в течение 3 ч. Далее смесь обрабатывали, как описано выше. Остаток растворяли в небольшом объеме воды и лиофильно высушивали. Полученные полисахаридные фракции (15,1; 17,2 и 6,9 мг соответственно)
анализировали на содержание галактуроновой кислоты [7] и нейтральных моносахаридов методами БХ и ГЖХ [10].
Определение физиологической активности. Острую токсичность определяли с помощью экспресс-метода Прозоровского при однократном внутрибрюшинном введении растворов полисахаридов лабораторным мышам [6].
Гиполипидемическую активность полисахаридов (0,5%-ный водный раствор) определяли турбидиметрическим методом, используя гепарин в качестве положительного контроля [12].
Для определения влияния полисахаридов плодов шиповника на адгезивность фагоцитирующих клеток использовали перитонеальные макрофаги белых лабораторных мышей. Суспензию макрофагов (2 млн. кл/мл) в среде Хенкса, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, инкубировали в лунках плоскодонного планшета (ICN Biomedicals, США) с растворами полисахаридов (100-500 мкг/мл) в течение 20 мин при 37 °С. Количество прикрепившихся клеток определяли колориметрическим методом, используя краситель Романовского-Гимза [13, С. 147-148]. Оптическую плотность растворов измеряли с помощью спектрофотометра Power Wave 200 (США).
Достоверность различий результатов при обработке данных по физиологической активности оценивали по t-критерию Стьюдента.
Выводы
1. Из мякоти плодов шиповника морщинистого Rosa rugosa Thunb. последовательной экстракцией выделены с суммарным выходом 12,4% три фракции пектиновых полисахаридов, названных розолинанами.
2. Выделенные полисахаридные фракции очищены методами гельфильтрации и ионообменной хроматографии.
3. Показано, что углеводные цепи пектиновых полисахаридов шиповника преимущественно состоят из а-1,4-связанных остатков D-галактуроновой кислоты, а также из остатков следующих нейтральных моносахаридов: арабинозы, галактозы, рамнозы; в качестве минорных присутствуют остатки ксилозы и маннозы.
4. Найдено, что пектины плодов шиповника морщинистого являются нетоксичными соединениями, проявляют гиполипидемическую активность и оказывают влияние на адгезивность перитонеальных макрофагов.
Авторы глубоко признательны канд. биол. наук В.В. Роману за помощь, оказанную при определении содержания аминокислот, входящих в состав белка полисахаридных фракций.
Список литературы
1. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность // Биорганическая химия. 1998. Т. 42. №7. С. 483-501.
2. Ширко Т.С., Радюк А.Ф. Химический состав плодов видов Rosa L., выращиваемых в Белоруссии // Растительные ресурсы. Вып. 2. 1991. С. 59-66.
3. Шнайдман А.О. Производство витаминов. М., 1973. 440 с.
4. Бушнева О.А., Оводова Р.Г., Мишарина Е.А. Силенаны-полисахариды смолевки обыкновенной // Химия растительного сырья. 1999. №1. С. 27-32.
5. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Pholin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.
6. Прозоровский В., Прозоровская М., Демченко В. // Фармакол. токсикол. 1978. №4. С. 497-502.
7. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances // Analyt. Chem. 1956. Vol. 28. P. 350-356.
8. Wood P.J., Siddiqui I.R. Determination of Methanol and Its Application to Measurement of Pectin Ester Content and Pectin Methyl Esterase Activity // Analyt. Biochem. 1971. Vol. 39. P. 418-428.
9. Асатиани В.С. Биохимический анализ. Тбилиси, 1964. Ч. 1. 289 с.
10. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев, 1982. 189 с.
11. Голубев В.Н., Шелухина Н.П. Пектин: химия, технология, применение. М., 1995. 387 с.
12. Климов А.Н., Ловягина Т.Н., Баньковская Э.Б. Турбидиметрический метод определения Р-липопротеидов и хиломикронов в сыворотке крови и тканях // Лабораторное дело. 1966. Т. 5. С. 276-279.
13. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. М., 1995. 219 с.
Поступило в редакцию 1 августа 2003 г.
