CC BY
162
УДК: 577.114:581.192:574.917:633.88
СОСТАВ И СВОЙСТВА ПЕКТИНОВЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ШРОТА ШИПОВНИКА
© А.А. Злобин1, \Н.А. Жуков, Р.Г. Оводова% С.В. Попов'
1 Вятский государственный университет, ул. Московская, Зв, Киров, 610601 (Россия) E-mail: biotech@vgu.ru
2Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, ул. Первомайская, 50, Сыктывкар, 167982 (Россия) E-mail: ovois@physiol.komisc.ru
Из шрота шиповника экстракцией 0,7%-ным водным раствором оксалата аммония при 68 °С выделена фракция пектиновых полисахаридов. В качестве главных компонентов в их состав входят остатки галактуроновой кислоты (70%), а также остатки нейтральных моносахаридов: арабинозы (5,5%), галактозы (2,5%), рамнозы (1,8%), глюкозы (2,4%), ксилозы (0,4%) и маннозы (0,2%). Ферментативный гидролиз с помощью эндо-полигалактуроназы указывает на то, что основные углеводные цепи пектиновых полисахаридов содержат участки галактуронана, образованного a-1,4-связанными остатками незамещенной D-галактуроновой кислоты. Результаты хромато-масс-спектрометрии метилированных производных свидетельствуют о том, что боковые олигосахаридные цепи пектинов шрота состоят из 1,5-связанных остатков арабинофуранозы, 1,4-связанных остатков ксилопиранозы и глюкопиранозы, а также из 1,б-связанных остатков маннопиранозы и галактопиранозы. На нередуцирующих концах углеводных цепей находятся остатки глюкопиранозы и ксилопиранозы.
ИК-спектры пектиновых полисахаридов шрота содержат характерные для пектиновых веществ полосы поглощения.
Показано, что пектиновые полисахариды шрота шиповника при пероральном введении лабораторным мышам не влияют на число фагоцитирующих клеток периферической крови и фагоцитарную активность нейтрофилов.
Введение
В нашей стране производство пектина основано на использовании яблочных выжимок, свекловичного жома и сердцевины корзинок подсолнечника. В настоящее время особое значение приобретает задача более полного использования местных плодово-ягодных ресурсов. Одним из дополнительных источников пектинов в составе комплексных препаратов могут быть плоды некоторых видов шиповника (Rosa L.)
Промышленная переработка плодов шиповника реализована на ряде предприятий медицинской и пищевой промышленности. Основным недостатком существующих технологий является то, что в них не используется весь комплекс пектиновых веществ плодов шиповника. Так, пектиновые полисахариды, входящие в состав протопектина (до 63% от суммарного количества пектинов плодов [1]) не извлекаются при экстракции их водными растворами и безвозвратно теряются. Нами предложено использовать шрот шиповника (остаток после экстракции масла) как компонент кормовой добавки в рацион пушных зверей, а также проведены зоотехнические испытания, которые показали ее высокую питательную ценность и биологическую активность [2].
Данная работа посвящена изучению состава и свойств пектиновых полисахаридов шрота шиповника для комплексной оценки его использования в качестве составляющей кормовой добавки.
Обсуждение результатов
Ранее из мякоти плодов шиповника морщинистого Rosa rugosa L. последовательной экстракцией водой и
0,7%-ным водным раствором оксалата аммония нами были выделены три фракции пектиновых полисахаридов, названных «розолинанами» [3]. Был изучен их состав и показано, что углеводные цепи розолинанов в основном состоят из а-1,4-связанных остатков галактуроновой кислоты (GalA). Установлено, что розолина-ны мякоти плодов шиповника морщинистого являются нетоксичными соединениями - полулетальная доза LD50 превышает 1000 мг/кг. Они модулируют адгезивность перитонеальных макрофагов мышей и обладают способностью связывать атерогенные липопротеиды низкой плотности в крови человека [3].
* Автор, с которым следует вести переписку.
92 А.А. ЗЛОБиН,
Н.А. Жуков
, Р.Г. Оводова, С.В. Попов
Для выделения пектиновых полисахаридов был использован шрот шиповника, полученный после экстракции масла из остатка водно-спиртовой обработки плодов. Извлечение пектиновых полисахаридов из шрота проводили после предварительной обработки его подкисленной водой (рН 3,8-4,0; 50 °С) 0,7%-ным водным раствором оксалата аммония при 68 °С. Экстракт концентрировали и диализовали с помощью метода ультрафильтрации. Выход и состав фракции пектиновых полисахаридов приведен в таблице 1.
Хромато-масс-спектрометрией триметилсилильных (ТМС) производных [4] в составе пектиновых полисахаридов шрота была идентифицирована галактуроновая кислота, а также остатки нейтральных моносахаридов: арабинозы (Ara), маннозы (Man), галактозы (Gal), глюкозы (Glc), ксилозы (Xyl) и рамнозы (Rha).
Как и розолинаны мякоти плодов шиповника морщинистого, пектиновые полисахариды шрота характеризуются высоким содержанием остатков галактуроновой кислоты (70%) со степенью метоксилирования (DM) - 25%.
Ферментативный гидролиз пектинов шрота эндо-полигалактуроназой (Rhizopus sp.) приводит к образованию свободной галактуроновой кислоты и олигосахаридов, что свидетельствует о наличии в составе их основных углеводных цепей участков незамещенного а-1,4^-галакгуронана [3].
Количественное содержание нейтральных моносахаридов определяли после гидролиза образцов пектиновых полисахаридов шрота 2М водным раствором трифторуксусной кислоты (TFA) и последующим анализом моносахаридов в гидролизатах в виде ацетатов полиолов методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) [3, 5]. По содержанию нейтральных моносахаридных остатков выделенные пектиновые полисахариды идентичны розолинанам мякоти плодов шиповника морщинистого. Можно лишь отметить пониженное, по сравнению с пектинами мякоти плодов, содержание остатков арабинозы (5,5 и 10,9% соответственно) [3]. Это может быть связано с использованием метода ультрафильтрации при выделении пектинов, что привело к удалению из состава фракции низкомолекулярных фрагментов полисахаридов.
Пектиновые полисахариды шрота образуют вязкие водные растворы, что характерно для пектиновых веществ (табл. 1).
ИК-спектроскопия полученных пектиновых полисахаридов показала, что их спектры содержат характерные для пектиновых веществ полосы поглощения. Так, в области 3424-3416 см-1 наблюдается полоса поглощения, обусловленная валентными колебаниями гидроксильных групп. В области 2920 см-1 наблюдается полоса, соответствующая симметричным и асимметричным колебаниям метоксильных групп. В области 1740-1700 см-1 в спектрах образцов наблюдаются полосы поглощения, свидетельствующие о наличии свободных карбоксильных групп, а полоса поглощения при 1550 см-1 указывает на содержание в них метоксильных групп. Полосы валентных колебаний эфирных связей С-О-С при 1236-1200 см-1 могут свидетельствовать о наличии в образцах ацетильных групп, а полосы поглощения в области 1200-1000 см-1 соответствуют валентным колебаниям связей С-С, С-О пиранозных циклов.
Данные по анализу пектиновых полисахаридов шрота шиповника методом метилирования свидетельствуют о том, что их боковые углеводные цепи образованы 1,4-связанными остатками ксилопиранозы, 1,5-связанными остатками арабинофуранозы, 1,4-связанными остатками глюкопиранозы и 1,6-связанными остатками галактопиранозы. На нередуцирующих концах углеводных цепей находятся остатки глюкопиранозы и ксилопиранозы (табл. 2).
Физиологическую активность пектиновых полисахаридов шрота шиповника определяли по их влиянию на фагоцитирующие клетки периферической крови мышей при пероральном введении [6, 7].
При этом показано, что количество лейкоцитов в периферической крови мышей, получавших пектиновые полисахариды в течение 30 суток (суммарная доза 13,7 г/кг), не имеет достоверных различий по сравнению с контролем. Установлено также, что пероральное введение пектинов шрота в указанных количествах не влияет на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови (табл. 3).
Таблица 1. Характеристика пектиновых полисахаридов шрота
Выход, %* П, дл/г DM, % Содержание, %
GalA Ara Gal Rha Xyl Man Glc
2,1 1,80 25 70 5,5 2,5 1,8 0,4 0,2 2,4
Примечание: выход в пересчете на сухую массу обезжиренного материала; характеристическая вязкость.
Таблица 2. Результаты метилирования пектиновых полисахаридов шрота
Положение метилированных групп Связь
2,3-O-Ме2-Ara/ ^5)-Ara/-(1^
2,3,4-O-Mc3-Xylp Xylp-(1^
2,3-O-Mc3-Xylp ^4)-Xylp-(1^
2,3,4^^^^^ Gkp-(1^
2,3^-O-Me^Gkp ^4)-Gkp-(1^
2,3,4-O-Me3-Galp ^5)-Galp-(1^
Таблица 3. Характеристика физиологической активности пектиновых полисахаридов шрота шиповника
Группа мышей Количество лейкоцитов в крови,клетки/мл Содержание нейтрофилов в крови,% Фагоцитарный индекс, %
Контрольная группа (n=7) 2300±750 30±12 4б±12
Опытная группа (n=8) 2850±920 33±8 43±9
-------------*----------------------------------------
Примечание: содержание от общего числа лейкоцитов
Таким образом, пектиновые полисахариды шрота шиповника не обладают выраженной иммуномодулирующей активностью в отношении количества и функциональной активности фагоцитирующих клеток периферической крови мышей.
Экспериментальная часть
Растительный материал. Для выделения пектиновых полисахаридов был использован шрот плодов шиповника с содержанием мякоти и семян 22 и 78% соответственно. Шрот был получен после выделения масла дифтордихлорметаном из остатка водно-спиртовой обработки плодов шиповника на Слободском спиртоводочном заводе (Кировская обл.).
Общие аналитические методы. Количественное содержание галактуроновой кислоты определяли по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии концентрированной серной кислоты [8], по калибровочному графику для D-галактопиранозилуроновой кислоты, а содержание метоксильных групп - по реакции с пен-тан-2,4-дионом [9] и калибровочному графику для метанола. Спектрофотометрические определения проводили на спектрофотометре Ultrospec 3000 (Швеция).
Обзорные ИК-спектры образцов снимали в таблетках КВг в диапазоне волновых чисел 4000-400 см-1 на ИК-Фурье спектрометре Scimitar FTS 2000 (Австралия).
Идентификацию галактуроновой кислоты и нейтральных моносахаридов в гидролизатах фракции пектиновых полисахаридов проводили методом ГЖХ-МС в виде ТМС-производных [4, 5] на газовом хроматографе G2589A (Agilent Tech., США) с масс-селективным детектором 5973 INERT (Agilent Tech., США) на капиллярной колонке HP-5MS (0,2 мм 0 30 м, Hewlett-Packard, США). Температура термостата колонки 180^250 °С с градиентом температуры - 4 °С/мин. Температура испарителя - 260 °С. Газ-носитель - гелий (скорость потока 1 мл/мин, деление потока 60 : 1). Развертка - от m/z 44 до m/z 500. Количество вводимой пробы - 1 мкл.
Количественное содержание нейтральных моносахаридов проводили в виде соответствующих ацетатов полиолов методом ГЖХ [3, 5]. ГЖХ выполняли на хроматографе Hewlett-Packard 4890А (США) с пламенноионизационным детектором (США).
ГЖХ-МС метилированных производных моносахаридов [5] проводили на газовом хроматографе G2589A (Agilent Tech., США) с масс-селективным детектором 5973 INERT (Agilent Tech., США) на капиллярной колонке HP-5MS (0,2 мм 0 30 м, Hewlett-Packard, США). Температура термостата колонки 150^280 °С с градиентом температуры - 5 °С/мин. Температура испарителя - 290 °С. Газ-носитель - гелий (скорость потока 1 мл/мин, деление потока 20 : 1). Развертка - от m/z 44 до m/z 500. Количество вводимой пробы - 1 мкл.
Кислотный гидролиз пектиновых полисахаридов для анализа моносахаридного состава проводили 2 М раствором TFA, содержащей в качестве внутреннего стандарта мио-инозит (0,125-0,250 мг/мл), при 100 °С в течение 3 ч. Моносахариды переводили в ацетаты полиолов или ТМС-производные и анализировали методом ГЖХ и ГЖХ-МС [4, 5].
Распределительную нисходящую бумажную хроматографию (БХ) выполняли в системе растворителей -н-бутанол : пиридин : вода (6 : 4 : 3) на бумаге Filtrak FN 12. Для индикации пятен моносахаридов использовали раствор кислого анилинфталата при 105 °С [3, 5].
Метилирование пектиновых полисахаридов. 30 мг полисахарида растворяли в дистиллированной воде, диа-лизовали против 1%-ного водного раствора гидрохлорида триэтиламина, лиофильно высушивали и дополнительно обезвоживали под вакуумом над Р2О5. К сухому образцу (2-5 мг) добавляли 1 мл тетрагидрофурана, 5 мг LiAlD4 и нагревали раствор в колбе с обратным холодильником при 70 °С в течение 1 ч. Раствор нейтрализовали 10%-ным раствором уксусной кислоты в метаноле, диализовали и лиофильно высушивали. Восстановленный образец обезвоживали под вакуумом над Р2О5 и растворяли в 1 мл диметилсульфоксида. К раствору приливали 1 мл 2 М раствора метилсульфинилкарбаниона (CH3SOCH2-Na+) и перемешивали в токе азота при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь замораживали, добавляли 1 мл йодистого метила (CH3I), перемешивали в атмосфере азота в течение 6 ч, диализовали и лиофильно высушивали. Частично метилированные полисахариды повторно обрабатывали CH3SOCH2-Na+ и CH3I, как описано выше. К полностью метилированным образцам приливали 1 мл 2М раствора TFA и проводили гидролиз при 100 °С в течение 5 ч. Избыток кислоты отгоняли с метанолом и переводили метилированные моносахариды в соответствующие ацетаты [3, 5].
Вязкость водных растворов пектинов определяли с помощью вискозиметра Оствальда с диаметром капилляра
0,56 мм. Измерения проводили при 22,0±0,1 °С. Время истечения растворителя - 1%-ного раствора NaCl составило 91,2 с.
94 А. А. Злобин,
Н.А. Жуков
, Р.Г. Оводова, С.В. Попов
Все водные растворы и пробы для ГЖХ и ГЖХ-МС-анализа выпаривали под вакуумом при 40-45 °С.
Центрифугирование растворов проводили в течение 10 мин при 3000-6000 об/мин.
Выделение пектиновых полисахаридов. Шрот плодов шиповника (500 г) обрабатывали подкисленной с помощью разбавленного раствора HCl водой (2 л, 50 °С, рН 4,0). Пектиновые полисахариды экстрагировали 0,7%-ным водным раствором оксалата аммония (10 л, 68 °С). Контроль полноты экстракции осуществляли фенол-сернокислотным методом [5]. Экстракты объединяли, концентрировали, диализовали на ультра-фильтрационном волоконном аппарате УВА-ПС-20-1040 и высушивали лиофильно. Характеристика пектиновых полисахаридов шрота приведена в таблице 1.
Ферментативный гидролиз. Образцы пектиновых полисахаридов (20 мг) растворяли в 10 мл воды, добавляли 2 мг эндо-полигалактуроназы (Rhizopus sp., E.C. 3.2.1.15) и инкубировали смесь при 37 °С в течение 3 ч. Далее реакционную смесь нагревали в течение 5 мин при 100 °С. Выпавший в осадок белок удаляли центрифугированием. Супернатант концентрировали до 3 мл и добавляли 4-кратный объем 96%-ного этанола. Осадок отделяли центрифугированием, а спиртовый супернатант анализировали методом БХ.
Определение физиологической активности. Изучение физиологической активности пектиновых полисахаридов шрота проводили по общепринятым методикам [6, 7]. Белые лабораторные мыши (половозрелые самцы) получали водный раствор пектинов в поилках в течение 30 суток (суммарная доза составила 13,7 г/кг за весь срок). Опытных (8 особей) и контрольных (7 особей) животных забивали смещением шейных позвонков и собирали кровь из шейного среза. Число лейкоцитов подсчитывали с помощью световой микроскопии в камере Горяева. Процентное содержание нейтрофилов в крови устанавливали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза [7]. Поглотительную способность нейтрофилов определяли в цельной крови, используя латекс в качестве объекта фагоцитоза [6]. Фагоцитарный индекс определяли как процент нейтро-филов, захвативших латекс от их общего числа.
При обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение и среднеквадратичное отклонение. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.
Выводы
1. Из шрота шиповника с выходом 2,1% выделены пектиновые полисахариды. Показано, что их углеводные цепи состоят из остатков галактуроновой кислоты, а также нейтральных моносахаридов: арабинозы, галактозы, глюкозы и рамнозы; в качестве минорных присутствуют остатки ксилозы и маннозы.
2. Показано, что в состав основных углеводных цепей пектиновых полисахаридов шрота шиповника входят участки незамещенного а-1,4-Э-галактуронана.
3. С помощью метода метилирования показано, что боковые углеводные цепи пектиновых полисахаридов шрота содержат 1,5-связанные остатки арабинофуранозы, 1,4-связанные остатки ксилопиранозы и глю-копиранозы, а также 1,6-связанные остатки маннопиранозы и галактопиранозы. На нередуцирующих концах углеводных цепей находятся остатки глюкопиранозы и ксилопиранозы.
4. Найдено, что пектиновые полисахариды шрота не обладают иммуномодулирующей активностью в отношении количества и функциональной активности фагоцитирующих клеток периферической крови мышей при пероральном введении.
Список литературы
1. Ширко Т.С., Радюк А.Ф. Химический состав плодов видов Rosa L., выращиваемых в Белоруссии // Раст. ресурсы. 1991. Вып. 2. С. 59-66.
2. Жуков Н.А., Гребенкина З.И., Мартинсон Е.А., Чигринова О.А. Зоотехническая ценность шротов дикорастущих плодово-ягодных культур // Наука - производство - технология - экология: Мат. региональной научнотехнической конференции. 1998. С. 63-64.
3. Злобин А.А., Оводова Р.Г., Попов С.В. Общая химическая характеристика водорастворимых полисахаридов плодов шиповника морщинистого Rosa rugosa // Химия растительного сырья. 2003. №2. С. 39-44.
4. Костенко В.Г. Хроматографический анализ сахаров, получаемых в процессе переработки растительного сырья. М., 1984. 44 с.
5. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев, 1982. 189 с.
6. Блиндарь В.Н., Зубрихина Г.Н., Круглова Н.Б., Никитина Т.А. Определение поглотительной способности нейтрофилов и моноцитов периферической крови // Клин. лаб. диагн. 1996. №2. С. 18-20.
7. Хант С. Лимфоциты. Методы. М., 1990. С. 15-65.
8. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Analyt. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.
9. Wood P.J., Siddiqui I.R. Determination of methanol and its application to measurement of pectin ester content and pectin methyl esterase activity // Analyt. Biochem. 1971. V. 39. P. 418-428.
Поступило в редакцию 10 июля 2007 г.
