CC BY
20
НЛТУ
УКРЛ1НИ
Hl/IUB
Науковий BicHMK НЛТУУкраТни Scientific Bulletin of UNFU
http://nv.nltu.edu.ua https://doi.org/10.15421/40270905 Article received 7.11.2017 р. Article accepted 28.11.2017 р.
УДК 630*[174.754+544]
ISSN 1994-7836 (print) ISSN 2519-2477 (online)
[^1 Correspondence author M. М. Lisoviy [email protected]
М. М. Л^овий
Нацюнальний лкотехтчний утверситет Украши, м. Львiв, Украта
ОСОБЛИВОСТ1 ОТРИМАННЯ АСЕПТИЧНО1 КУЛЬТУРИ THUJA OCCIDENTALIS L. В УМОВАХ IN VITRO
Наведено огляд та аналз лггературних джерел, яю стосуються мжроклонального розмноження Thuja occidentalis L. в умовах in vitro. Коротко охарактеризовано господарську цшшсть дослщжуваного виду та, на оснж цього, обгрунтовано до-цiльнiсть проведення запланованих дослiджень. Подано список найпоширешших у садово-парковому господарствi декора-тивних форм Thuja occidentalis L. Детально охарактеризовано застосовану методику проведення експериментальних досль джень з отримання асептично! культури Thuja occidentalis L. тд час розмноження in vitro: хiмiчнi реактиви, якими викону-вали деконтамшащю вихiдних експланлв, !х концентрацп та комбшацп. Протестовано низку схем виконання деконтамша-цп експлантш дослiджуваного виду iз застосуванням одного хiмiчного агента та рiзних !х комбiнацiй. Визначено оптималь-ну схему проведення ступшчасто! стеритзацп вихiдних експлантiв Thuja occidentalis L. для розмноження in vitro, яка забез-печила вихiд 87,67±1'00 % життездатного рослинного матерiалу i полягае у почерговому його обробгжу такими хiмiчними агентами: С2Н5ОН (96 %; 5 с) + Н2О з детергентом (6 год) + Н2О2 (3 %; 10 хв) + С2Н5ОН (70 %; 5 с) + AgNO3 (0,2 %; 10 хв) + HgCl2 (1 %; 10 хв). Узагальнено та проаналiзовано отриманi результати.
Krnuoei слова: Thuja occidentalis L.; in vitro; експлант; деконтамшащя; живильне середовище.
Вступ. Туя захвдна (Thuja occidentalis L.) - в1чнозеле-не дерево або чагарник, який в умовах природного ареалу може сягати висоти до 30 м (Bilous, 2003; Brodovych & Brodovych, 1979; Kriussman, 1986; Lisovyi, 2015; Lisov-yi, & Huz, 2015). Для дослвджуваного виду харакгерш вузько кошчна крона га галуження гшок у горизонтально площинг Кора завтовшки 0,5-1,0 см, в1д червонува-гого до аро-коричневого кольору, др1бногрщинувага, волокниста, злущуегься гонкими пасмами (Kriussman, 1986). Треба зазначиги, що гую захвдну широко кульги-вуюгь по всш £врош га в Укрш'т ще 1з к1нця XVIII сг.
Дослвджуваному виду пригаманний значний гене-гичний пол1морф1зм, що дае змогу широко викорисго-вуваги його в садово-паркових композищях як регулярного, гак i пейзажного планування. Найпоширешшими в озелененш населених пункпв е гак1 декорагивш в1д-мши гу! захщно!: 'Columna'; 'Malonyana'; 'Holmstrup'; 'Brabant'; 'Rosenthalii'; 'Fastigiata' ('Stricta'); 'Douglassii pyramidalis'; 'Viridis'; 'Ellwangeriana'; 'Theodonensis'; 'Wareana'; 'Asplenifolia'; 'Filiformis'; 'Recurvata'; 'Ellwangeriana'; 'Robusta'; 'Pendula'; 'Ohlendorfii'; 'Wagneriana'; 'Globosa'; 'Globosa nana'; 'Cristata'; 'Plictata'; 'Hilside'; 'Woodwardii'; 'Brobeck's Tower'; 'Recurvata nana'; 'Erico-ides'; 'Compacta'; 'Stolwijk'; 'Globosa Compacta'; Fillico-ides'; 'Umbraculifera'; 'Plicata pigmaea'; 'Lutea'; 'Aurea'; 'Aureospicata'; 'Aurea-variegata'; 'Semperaurea'; 'Lutes-cens'; 'Yellow Ribbon'; 'Alba'; 'Variegata'; 'Albospica'; 'Ri-versii'; 'Amber Glow'; 'Vervaeneana'; 'Recurvata arqenteo-variegata'; 'Smaragd Light'; 'Rheingold'; 'Ellwangeriana aurea'; 'Columbia'; 'Pendula glauca'; 'Aureo spicata'; 'Aures-
cens'; 'Europe Gold'; 'Frieslandia'; 'Hoveyi'; 'Lutea nana'; 'Filips Magic Moment'; 'Golden Globe'; 'Hoseri'; 'Golden Tuffet'; 'Barabits'; 'Cerviconis'; 'Cherry Valley'; 'Conica' 'Compacta'; 'Corley'; 'Darling Susie'; 'Fastigiata'; 'Globosa' 'Himmel Broom'; 'Julian's Weeper'; 'Kellermanii' 'Kralovstvi'; 'Karsten'; 'Kornik'; 'Krejci'; 'Lakatos Gömb' 'Lanarck'; 'Liliput'; 'Multicaulis'; 'Paper Lanterns'; 'Pendula' 'Pendulina'; 'Pit van Geet'; 'Puli'; 'Pyramidalis'; 'Repens' 'Spacek'; 'Virgata'; 'Breburda'; 'Glauca'; 'Laxa'; 'Little Bogle'; 'Lombarts'; 'Nukmitz'; 'Paula'; 'Pesek'; 'Autumn Gold Weeping' тощо (Brodovych & Brodovych, 1979; Kokhno et al., 2001; Zaiachuk, 2008; Kalinichenko, 2003; Kolesni-kov, 1974; Kriussman, 1986; Lisovyi, 2015; Lisovyi & Huz, 2015; Lisovyi & Mykhatska, 2012).
1з врахуванням господарсько! цiнносгi дослщжува-ного виду можна зробити висновок про доцшьшсть удосконалення сучасних методик його розмноження, зокрема м^оклонування, першочерговим завданням якого е отримання асептично! культури (Butenko, 1999; Butenko, 1986).
Анaлiз останшх досл1джень та публшацш. Ka-bir M. H. та in як експланти застосовували ашкальш па-гони завдовжки близько 2 см, яю сгерилiзували пропч-ною водою з мийним засобом (15 хв), 40 %-м препаратом "Clorox" (5 хв), 0,1 %-м розчином хлориду ртуп (5 хв), тсля чого промивали стерильною дистильова-ною водою. Культивування проводили на живильному середовищi MS, яке модифшували фiгогормонами BA та Kn iз додаванням NAA. Для укорiнення застосовували 1/2 MS iз додаванням IBA, IAA та NAA. На вшьному ввд
1нформащя про aBTopiB:
Лковий Микола Миколайович, канд. с.-г. наук, доцент, доцент кафедри лiсових культур i лково' селекцп, докторант. Email: [email protected]
Цитування за ДСТУ: Лковий М. М. Особливостi отримання асептично' культури Thuja Occidentalis L. в умовах in vitro. Науковий
вкник НЛТУ Укра'ни. 2017. Вип. 27(9). С. 27-29. Citation APA: Lisoviy, M. М. (2017). Some Features of Obtaining Aseptic Culture of Thuja Occidentalis L. Under in vitro Conditions. Scientific Bulletin of UNFU, 27(9), 27-29. https://doi.org/10.15421/40270905
гормошв середовищi спостерiгали так1 результати: се-редня к1льк1сть naroHÎB на експлант 6,57±0,45 шт.; середня довжина пагошв 4,5±0,27 см. Найкраще укорiнення отри-мали на середовищi 1/2 MS + 1,0 мг/л IBA: середня шль-шсть коренiв 3,92±0'28 шт.; середня довжина 3,64±0,38 см (Kabir, Roy & Ahmed, 2006). Nour K. A. та Thorpe T. A. отримали 10-14 пазушних пагошв тд час культивування експлантiв на середовищi 1/2 Quiorin and LePoivre i3 до-даванням 10 мМ стерилiзованоrо зеатину (Nour & Thorpe, 1993). Indra S. Harry та ш. дослвджували соматичний ембрюгенез ту1 захiдноï. Iндукцiю зародк1в отримано пiд час культивування експлантiв (20-25 даб) на живиль-ному середовищi Quoirin and Le Poivre iз додаванням ВА та 2-iзопентиладенiну. Автори зазначають, що цим способом можна отримати бiльше 250 рослин з одного ембрюна (Harry et al., 1987). Загалом дослвдження пер-спективи розмноження методом in vitro туï захiдноï ви-конано у досить обмеженш кiлькостi наукових праць, що i зумовлюе актуальнiсть проведених дослвджень.
Матерiали та методи досл1дження. Експеримен-тальнi дослвдження з отримання асептичноï культури туï захiдноï проведено у лаборатори культури тканин кафед-ри люових культур i лiсовоï селекци НЛТУ Украïни за загальноприйнятими бютехнолопчними методиками (Musiienko & Paniuta, 2005). Як експланти застосовували невелик! частинки верхiвок паrонiв (4-6 мм завдовжки), заrотовленi !з ввдносно молодих рослин (вшом 4-7 рок1в).
Для деконтамшацп вихвдних експлантiв застосовували стутнчасту схему стерилiзацiï, яка полягала у по-черговому обробгтку рослинного матерiалу такими сте-рилiзацiйними агентами р!зно1' концентрацiï та у р!зних комбшащях: протiчна вода (Н2О) з детергентом ("Твш 80"); пероксид водню (Н2О2); медичний етиловий спирт (С2Н5ОН); гшохлорид натрiю (NaClO); нiтрат срiбла (AgNO3) та сулема (HgCl2). Шсля кожного реактиву експланти трич! промивали стерильною дистильованою водою у вах вар!антах дослщв по 4-5 хв (Bilous, 2003; Brodovych & Brodovych, 1979; Butenko, 1986; 1999; Ka-taeva & Butenko, 1983; Kushnir & Sarnatska, 2005) (табл. 1). Для подолання внутршшх шфекцш вихвдт експланти перед пасажем обробляли 0,1 %-м водним розчином антибютика "1манш" (Imaninum). Ус! роботи виконували у максимально стерильних умовах.
Табл. 1. Застосоваш стерилянти для деконтамшацп" експлантiв
№ з/п Стеритзацшний агент Концентращя Експозищя
1 протачна Н2О + детергент + "Твш 80" 10 + 5 г/л 2, 4, 6 год
2 Н2О2 1; 2; 3 % 3; 5; 10 хв
3 С2Н5ОН' 50; 70; 96 % 5; 10; 15 с
4 NaClO 10; 20; 30 % 3; 5; 7 хв
5 AgNO3 0,1; 0,2; 0,3 % 5; 10; 15 хв
6 HgCl2 1; 2; 3 % 5; 10; 15 хв
Примгжа: * ус! вар!анти дослду також проведено !з першочерго-
вим обробгтком експланпв етанолом, для видалення смоляного нальоту.
Простерилiзованi експланти, за наведеними у табл. 1 схемами, пасажували на живильне середовище за рецептом MS (Murashige and Skoog) без фггогормошв та проводили спостереження впродовж 10-15 дiб. П1сля цього, експланти класифжували на двi групи: асептичнi (стерильнi) та зараженi патогенами (шфшоваш, конта-мiнованi). На основi отриманих результатiв визначали так1 показники стерилiзацп: ефективнiсть стерилiзацп
(ЕС) (ЕС = nC/N х100 %, де: nC - к1льк1сть отриманих асептичних експланпв, шт.; N - загальна к1льк1сть простерил!зованих експланпв, шт. та життездатшсть експланпв (ЖЕ), (ЖЕ = пЖ/N х100 %, де пЖ - шль-к1сть отриманих живих експланпв (без некротичних та шфшованих), шт.
Результати досл1дження та ïx обговорення. Досль дження з деконтамшацп вихвдних експланпв ту1' захщ-но1' виконували у два етапи: "первинна стерил!защя" та "модифшована стерил!защя". Перший полягав в обро-бпку рослинного матер!алу пропчною водою з детергентом, пероксидом водню та етиловим спиртом у наве-дених вище концентращях та комбшашях. Найбшьшу к1льк1сть асептичного рослинного матер!алу (52,9 %) отримано за тако1' схеми стерил!зацп: С2Н5ОН (96 %; 5 с) + Н2О з детергентом (6 год) + Н2О2 (3 %; 10 хв) + С2Н5ОН (70 %; 5 с). У вах шших вар!антах дослвду цей показник був нижчим за 50 %.
Оск1льки, на нашу думку, "первинна стеритзащя" не забезпечила задовшьних результапв, додатково було зас-тосовано "модифшовану стерил!защю", яку виконували такими х1м!чними агентами: гшохлорид натрш, шграт ср!бла та сулема. Кожен !з наведених агенпв спочатку використовували окремо. Найвищ! результати отримано за концентрацш та експозицш, наведених у табл. 2.
Табл. 2. Результати застосування стерилянтiв-модифiкаторiв
№ з/п Характеристика застосованого стерилянта ЕС, % ЖЕ, %
1 AgNO3 (0,2 %; 10 хв) 80,0 76,7
2 NaClO (20 %; 5 хв) 73,3 73,3
3 HgCl2 (1 %; 10 хв) 83,3 83,3
Дан! табл. 2 свщчать, що найвищу ефектившсть сте-рил!зацп та життездатшсть експланпв (по 83,3 %) забезпечила модифжащя "первинно1' стерил!зацй" реагентом HgCl2 концентрашею 1 % та експозишею 10 хв. Незначно нижч! результати зафжсовано в раз! викорис-тання як модифжатори AgNO3 та NaClO, у наведених характеристиках: 80,0 % (ЕС) i 76,7 % (ЖЕ) та по 73,3 % кожного показника ввдповщно.
Для тдвищення отриманих результапв протестова-но схему деконтамшацп, яка включала в себе обов'язко-ве застосування "первинно1' стерил!зацй" та комбшацш уах трьох стерилянпв-модифжатор!в, а також почерго-ве 1'х виключення. Найвищ! дослвджуваш показники (ЕС - 89,33±0,83 % ЖЕ - 87,67±1,00 %) отримано за стери-л!зацп експланпв ту1' зах!дно1' почерговим 1'х обробпком такими стерилянтами: С2Н5ОН (96 %; 5 с) + Н2О з детергентом (6 год) + Н2О2 (3 %; 10 хв) + С2Н5ОН (70 %; 5 с) + AgNO3 (0,2 %; 10 хв) + HgCl2 (1 %; 10 хв).
Висновки. За результатами проведених дослвджень можна зробити висновок про значний вплив концентра-ц!!^ тривалосп обробпку, комбiнацiï та типу застосова-них х!м!чних агенпв на результати стерил!зацп вихщ-ного рослинного матер!алу Thuja occidentalis L. тд час розмноження in vitro. Найдоцшьшшою виявилась така стутнчаста схема деконтамiнацiï експланпв дослвджу-ваного виду. Найбшьшу к1льк1сть асептичних експланпв забезпечила така схема деконтамшацп: С2Н5ОН (96 %; 5 с) + Н2О з детергентом (6 год) + Н2О2 (3 %; 10 хв) + С2Н5ОН (70 %; 5 сек) + AgNO3 (0,2 %; 10 хв) + HgCl2 (1 %; 10 хв), застосування якоï забезпечило вихщ 87,67±100 % життездатного рослинного матер!алу.
Kolesnikov, A. I (1974). Dekorativnaia dendrologiia. Moscow: Les-
naia promyshlennost. 700 p. [in Russian]. Kriussman, G. (1986). Khvoinye porody: per. s nem. Moscow: Les-
naia promyshlennost. 256 p. [in Russian]. Kushnir, H. P., & Sarnatska, V. V. (2005). Mikroklonalne rozmnoz-
hennia roslyn. Kyiv: Nauk. dumka. 450 p. [in Ukrainian]. Lisovyi, M. M, & Huz, M. M. (2015). Polimorfizm ta osoblyvosti ve-hetatyvnoho rozmnozhennia zhyvtsiuvanniam dekoratyvnykh form Thuja occidentalis L. Lisivnytstvo i ahrolisomelioratsiia, 126, 132— 138. [in Ukrainian]. Lisovyi, M. M., & Mykhatska, L. V. (2012). Polimorfizm tui zakhid-noi. Zakhyst navkolyshnoho seredovyshcha. Zbalansovane pryrodo-korystuvannia: materialy piatoi studentskoi naukovo-praktychnoi konferentsii. Lviv: DUONS, 69-72. [in Ukrainian]. Lisovyi, N. N. (2015). Avtovegetativnoe razmnozhenie nekotorykh dekorativnykh form Thuja occidentalis L. Plodovodstvo, semeno-vodstvo, introduktciia drevesnykh rastenii: materialy XVII Mezhdu-narodnoi nauchnoi konferentcii. Krasnoiarsk: SibGTU. 40-43. [in Russian].
Musiienko, M. M., & Paniuta, O. O. (2005). Biotekhnolohiia roslyn.
Kyiv: VPTs "Kyivskyi universytet". 114 p. [in Ukrainian]. Nour, K. A., & Thorpe, T. A (1993). In vitro shoot multiplication of eastern white cedar (Thuja occidentalis). In Vitro Cell Dev Biol-Plant, 29, 65-71.
Zaiachuk, V. Ya (2008). Dendrolohiia. Lviv: Apriori. 656 p. [in Ukrainian].
Н. Н. Лисовый
Национальный лесотехнический университет Украины, г. Львов, Украина
ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ АСЕПТИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ THUJA OCCIDENTALIS L. В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Приведены обзор и анализ литературных источников, касающихся микроклонального размножения Thuja occidentalis L. в условиях in vitro. Кратко охарактеризована хозяйственная ценность исследуемого вида и, на основе этого, обоснована целесообразность проведения запланированных исследований. Представлен список наиболее распространенных в садово-парковом хозяйстве декоративных форм Thuja occidentalis L. Подробно охарактеризована примененная методика проведения экспериментальных исследований по получению асептической культуры Thuja occidentalis L. при размножении in vitro: химические реактивы, которыми выполняли деконтаминацию выходных эксплантов, их концентрации и комбинации. Протестирован ряд схем выполнения деконтаминации эксплантов изучаемого вида с применением одного химического агента и различных их комбинаций. Определена оптимальная схема проведения ступенчатой стерилизации исходных эксплантов Thuja occidentalis L. для размножения in vitro, которая обеспечила выход 87,67±1,00 % жизнеспособного растительного материала и заключается в последовательной его обработке следующими химическими агентами: С2Н5ОН (96 %, 5 с) + Н2О с моющим средством (6 ч) + Н2О2 (3 %, 10 мин.) + С2Н5ОН (70 %, 5 с) + AgNO3 (0,2 %, 10 мин) + HgCl2 (1 %, 10 мин). Обобщены и проанализированы полученные результаты.
Ключевые слова: Thuja occidentalis L.; in vitro; эксплант; деконтаминация; питательная среда.
M. М. Lisoviy
Ukrainian National Forestry University, Lviv, Ukraine
SOME FEATURES OF OBTAINING ASEPTIC CULTURE OF THUJA OCCIDENTALIS L.
UNDER IN VITRO CONDITIONS
Thuja occidentalis L. has been widely cultivated in Europe and Ukraine since the end of 18th century. The considerable economic value of the investigated species predetermines expediency of improvement of modern reproduction methodologies, in particular in the in vitro conditions. Experimental researches on obtaining of sterile culture of western Thuja were conducted in laboratory of tissue culture at the Forestry and Forest Selection Department of UNFU according to generally accepted methods in biotechnology. Decontamination of explants was executed by till of vegetable material by the next sterilizing agents of different concentration and in different combinations: Н2О with "Twin 80"(2, 4, 6 hours); Н2О2 (1, 2, 3 %; 3, 5, 10 minutes); С2Н5ОН (50, 70, 96 %; 5, 10, 15 seconds); NaClO (10, 20, 30 %; 3, 5, 7 minutes); AgNO3 (0.1, 0.2, 0.3 %; 5, 10, 15 minutes); HgCl2 (1, 2, 3 %; 5, 10, 15 minutes). For elimination of internal infections of explants before seating processed 0.1 % water solution to the antibiotic of Imaninum, sterile explants were placed on the nourishing environment of MS (Murashige and Skoog). On the basis of the results obtained we determined the efficiency of sterilization and viability of explants. Decontamination of explants was executed in two stages: "primary sterilization" and "modified sterilization". We got most of aseptic vegetable material (52.9 %) on the first stage at the next chart of sterilization: С2Н5ОН (96 %, 5 seconds) + Н2О (6 hours) + Н2О2 (3 %, 10 minutes) С2Н5ОН (70 %, 5 seconds). In order to increase the results obtained there was the tested chart of decontamination, that included for itself obligatory application of "primary sterilization" and combinations all three chemical agents (NaClO, AgNO3, HgCl2), and there by turn exception. The greatest investigated indexes (efficiency of sterilization - 89.33±083 % and viability of explants - 87.67±100 %) were obtained during sterilization of explants of western Thuja according to the following scheme: С2Н5ОН (96 %, 5 seconds) + Н2О (6 hours) + Н2О2 (3 %, 10 minutes) + С2Н5ОН (70 %, 5 seconds) + AgNO3 (0.2 %, 10 minutes) + HgCl2 (1 %, 10 minutes). As a result of undertaken studies it is possible to draw conclusion about considerable influence, concentrations, duration of till, combination and type of the applied chemical agents on the results of sterilization of vegetable feedstock of Thuja occidentalis L. at reproduction in vitro.
Keywords: Thuja occidentalis L.; in vitro; explants; decontamination; the culture medium.
nepe^ÏK BHKopHcraHHx g»epe.n
Bilous, V. I (2003). Lisova selektsiia. Uman: Umanske vydavnycho-
polihrafichne pidpryiemstvo. 534 p. [in Ukrainian]. Brodovych, T. M., & Brodovych, M. M. (1979). Dereva i chaharnyky zakhodu URSR. Atlas. Lviv: Vyshcha shkola. 251 p. [in Ukrainian]. Butenko, R. G. (1986). Kultura kletok rastenii i biotekhnologiia. Moscow: Nauka. 285 p. [in Russian]. Butenko, R. G. (1999). Biologiia kletok vysshikh rastenii in vitro i bi-otekhnologii na ikh osnove. Moscow: FBK-PRESS. 160 p. [in Russian]. Harry, I. S., Thompson, M. R., Chin-Yi, Lu., & Thorpe, T. A. (1987). In vitro plantlet formation from embryonic explants of eastern white cedar (Thuja occidentalis L.). Tree Physiol, 3(3), 273-283. https://doi.org/10.1093/treephys/3.3.273 Kabir, M. H., Roy, P. K., & Ahmed, G. (2006). In vitro Propagation of Thuja occidentalis. Through Apical Shoot Culture Plant Tissue Cult. & Biotech, 16(1), 5-9.
https://doi.org/10.3329/ptcb.v16i1.1099 Kalinichenko, O. A (2003). Dekoratyvna dendrolohiia. Kyiv:
Vyshcha shkola. 199 p. [in Ukrainian]. Kataeva, N. V., & Butenko, R. G. (1983). Klonalnoe mikrorazmnoz-
henie rastenii. Moscow: Nauka. 96 p. [in Russian]. Kokhno, M. A., (Ed.), Hordiienko, V. I., Zakharenko, H. S. et al. (2001). Dendroflora Ukrainy. Dykorosli ta kultyvovani dereva y kushchi. Holonasinni: dovidnyk, NAN Ukrainy, Nats. bot. sad im. M. M. Hryshka. Kyiv: Vyshcha shkola. 207 p. [in Ukrainian].
