CC BY
38
1. Л1СОВЕ ТА САДОВО-ПАРКОВЕ ГОСПОДАРСТВО
УДК 630*174.754:631.544 Докторант М.М. Лковий, канд. с.-г. наук -
НЛТУ Украти, м. Львiв
ОСОБЛИВОСТ1 СТЕРИЛ1ЗАЦН ТА ВВЕДЕННЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO ЕКСПЛАНТ1В TAXUSBACCATA L.
Проведено критичний ан^з та стислий огляд лтературних джерел, як стосують-ся дослщжувано! тематики. Детально описано застосовану методику проведених досль джень: вихiдний рослинний матерiал, який застосовували як експланти пiд час мшрок-лонування Taxus baccata L.; черговiсть використання хiмiчних реагентiв, i'x концентра-цп та тривалiсть обробiтку пiд час стершшацп; види та модифжацп живильних середо-вищ. Встановлено оптимальну схему деконтамшацп вихiдного рослинного матерiалу дослщжуваного виду та виявлено оптимальний склад середовища та комбшацп фто-гормонiв для проведения усшшноi' iнiцiацii експланпв. Узагальнено та прошалiзовано отриманi результати.
Ключовi слова: Taxus baccata L., in vitro, експлант, стерилiзацiя, гшщащя, жи-вильне середовище, деконтамiнадiя.
Вступ. Taxus baccata L. (тис япдний) - хвойне вiчнозелене дерево або великий чагарник (родина тисових (Taxaceae), який е релiктовим видом мезо-зойсько! ери. В умовах природного ареалу може сягати висоти 10-25 м [4-6, 1213]. Дослiджуваний вид занесено до Червоно! книги Украши з присвоеним при-родоохоронним статусом - "вразливий". Окрш цього, популяцп тиса ягiдного занесено до Зелено!' книги Украши, ят охороняють у Карпатському БЗ, Кримському, Ялтинському прсько-лковому ПЗ та низцi заказникiв [13].
Завдяки сво'й мiцнiй та важкш деревинi, iз чорно-бурою серцевиною, тис япдний дуже цiниться у меблевш промисловостi, машинобудуваннi, шд-водному будiвництвi тощо. Для Taxus baccata L. властива наявнiсть значно! кiлькостi декоративних форм (внутрiшньовидовий полiморфiзм), що робить його досить поширеним в озелененш та садово-парковому господарствi. Також тис япдний мае протипухлинну, цитостатичну дда та збуджуе дихання. Тому у медициш застосовують хвою, пагони та кору до^джуваного виду як джерело бюмаси для отримання таксотеру, що е складовою протипухлинних препаратов [7, 12]. Все це i зумовлюе актуальнкть та необхiднiсть удосконалення шляхш розмноження цiнних генотипiв Taxus baccata L.
Огляд лггератури. Мiкроклонування рослин дослвджено у багатьох на-укових працях. Проте статей, яш стосуються розмноження in vitro тиса япдно-го, е обмежена кшьккть. Так, Л.Г. Фшонова (1999) у сво'й роботi вводила в культуру in vitro рiзнi тканини та органи тиса япдного та вивчала динашку на-копичення таксолу у калюсь Експланти стерилiзували 9 %-м розчином гшохло-риту натрда (NaClO) тривалктю опрацювання 60 хв для сегменпв пагонiв дов-жиною 1,5-2,0 см, 15 хв - для вегетативних бруньок та очищених вiд насшно! оболонки макрогаметофiтiв та 4-5 хв - для пилякш i арилусш. Рослинний мате-
рiал помщали в чашки neTpi дiаметром 120 мм на агаризоваш живильш сере-довища SH (Schenk, Hilderbrandt, 1972); MS (Murashige, Skoog, 1962); LP (von Arnold, Eriksson, 1982); B5 (Gamborg et al., 1968); DBM2 - РР (Gresshoff, Doy, 1972) з додаванням iнозиту (50 мкМ), нiкотиновоí кислоти (0,8 мкМ), шридок-сину-HCl - В6 (0,5 мкМ), памшу-ИО - В1 (3 мкМ), 2,4-дихлорфеноксиоцтово! кислоти (2,4-Д; 10 мкМ), кшетину (5 мкМ), 3 % сахарози i 0,7 % агару [7]. D. Ewald (2007) як експланти тиса япдного використовував верхiвковi та бiчнi бруньки, яю стерилiзувались розчином хлориду (0,25 %) та мийним засобом тривалiстю 15 хв, пiсля чого промивали дистильованою водою. Потiм експланти пасажували на наступнi модифiкованi живильнi середовища: WPM (Lloyd & McCown, 1981) та L9 (Linsmaier & Skoog, 1965) [9]. A. Zhiri та ш. (1994) дост-джували проростання наанних зародюв "у пробiрцi" та отримали 100 % про-ростання внаслiдок промивання експлантiв протiчною водою протягом семи днiв та пророщуванням ix на живильному середовищi Murashige and Skoog чи Heller [10]. Paula P. Chee (1994) проводив культивування зиготних ембрiонiв на-сшня на живильних середовищах B5, Litvay та Murashige and Skoog [11]. Z. Ab-basin та ш. (2010) як експланти застосовували бруньки та ембрюни тиса япдно-го. Найкращий рiст експлантiв спостережено на середовишд Murashige and Skoog з додаванням 2 мг/л БАП, а укоршення - на половит цього середовища з додаванням 8 мг/л 1ОК [8].
Матерiали та методи. Yd дослвдження щодо введення в культуру in vitro експланлв тиса ягiдного здшснено у лабораторп культури тканин кафедри лiсовиx культур i лково! селекцп НЛТУ Украши, для чого застосовано таи ма-терiали: пiнцети, скальпел^ препарувальнi голки, чашки Петрi, пробiрки (50 мл), колби (1000 мл), рН-метр, кондицiонер, люксметр, апарат для струшу-вання, стерилiзатор вертикальний (автоклав), електрофотокалориметр, ламiнар 70-БВ, стiл для ламшару, дозатор А-2, термостат TL-80, стерилiзатор, повиря-ний, гiдродистилятор, ультрафiолетовi лампи.
Отримання асептично! культури е найважливiшим моментом, вiд якого залежить подальший результат розмноження рослин мжроклонуванням. Тому дезшфекцп придiляли значну увагу. Стерилiзацiю посуду та iнструментiв здшснювали сухим жаром у сушильнiй шафi за температури 180 оС протягом 1 -1,5 год, попередньо загорнувши !х в алюмшеву фольгу. Перед початком садш-ня експлантатав iнструменти знову стерилiзували, замочивши !х у 96 %-й ета-нол та профламбувавши над спиртавкою. Yсi роботи проводили у ламшарнш кiмнатi, яку стерилiзували за допомогою бактерицидних ультрафiолетовиx ламп протягом 1,5-2,0 год [1, 3].
Щд час проведения дослщжень використано три базових живильнi середовища, яю найчастiше, за даними лiтературниx джерел, застосовують для шк-роклонального розмноження хвойних видiв: MS (Murashige and Skoog medium), RW (Risser and White medium), LM (Litvay medium). Середовища були модифь коваш з допомогою рiзниx концентрацiй та комбшацш фiтогормонiв: 2,4-D (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота), НОК (а-нафтилоцтова кислота) та БАП (6-бензоламiнопурин) (табл. 1). Yсi живильш середовища готували за загальноп-рийнятими методиками, а !х стерилiзацiю виконували автоклавуванням за температури 120 °С пiд тиском 0,75-1,0 кг/см2 упродовж 20 хв [1-3].
Табл. 1. МодифЫацп живильних середовищ
Варiант дослiду Середовище Застосований фiтогормон, мг/л
2,4-Б НОК БАП
1 М8 - 0,1 0,1
2 0,2 - 0,1
3 0,2 0,1 -
4 RW - 0,1 0,1
5 0,2 - 0,1
6 0,2 0,1 -
7 ЬМ - 0,1 0,1
8 0,2 - 0,1
9 0,2 0,1 -
Як експланти використовували верхiвковi бруньки, заготовлен! се-редньо! частини крони вщносно молодих рослин тиса япдного (4-6 рокш), роз-множених вегетативним способом. У лабораторц проводили стерил!зацда заго-товленого рослинного матер!алу такими реагентами: пропчна вода (Н2О) з детергентом, Н2О2, С2Н5ОН, №СЮ, AgNOз р!зно1 концентрацц та експозицц об-роб!тку. Пкля кожного х^шчного агента експлантати трич! промивали стерильною дистильованою водою (табл. 2).
Табл. 2. Способи сmерилiзацn вихгдних експлантатiв
й о «и Застосований реагент (у порядку використання)
Вода з милом Н2О2 С2Н5ОН ШСЮ AgNOз
тривалють, год. концентрация, % трива-лють, хв. концентрация, % трива-лiсть, хв. концентрация, % трива-лiсть, хв. концентрация, % трива-лiсть, хв.
1 8 3 5 50 10 10 3 0,1 5
2 8 6 5 70 10 20 3 0,2 5
3 8 9 5 96 10 30 3 0,3 5
4 12 3 10 50 20 10 5 0,1 10
5 12 6 10 70 20 20 5 0,2 10
6 12 9 10 96 20 30 5 0,3 10
7 24 3 15 50 30 10 7 0,1 15
8 24 6 15 70 30 20 7 0,2 15
9 24 9 15 96 30 30 7 0,3 15
Провшши стерил!зацда вс!х необхвдних об'екпв, пасажували приготовлен! експланти на живильш середовища та помщали !х на культивування у штучш умови: 16-годинний фотоперюд штенсивнктю 3 кЛк температурою 21-23 оС та вщносною волопстю повиря 30-35 %.
Результати. У кожному вар!аш! проведеного дослщу, для достов!рност! даних, використано по 30 експланпв. Результати стерил!зацп вихщного рослинного матер!алу були досить вар!абельними, що залежало вщ застосованих хь м!чних реагентш та !х концентрацц (табл. 3).
Дан! табл. 3. св!дчать, що найбшьша кшьккть заражених експлантш на-явна у вар!ант! досл!ду № 1 (100 %), що спричинила низька концентращя усх застосованих реагентш. У дослщах № 3, 6 та 9 практично вс експланти були некротичними, тобто спален! х^шчними агентами високо! концентрацп. Найкрашд результати отримано у вар!антах дослщу № 5 та 8-93 та 97 % ввдпо-
вщно асептичних експлантiв. Простерилiзованi експланти пiдсаджували на жи-вильне середовище та спостерп^али за ними протягом 10 дшв. У частини клонiв на 7-8-й день спостер^али початок росту, тобто Ыщацш. В окремих варiантах дослщжень iнiцiацií не було (табл. 4).
Табл. 3. Результати стерилiзaцu експлантат1в
Варiант дослщу Юльюстъ експлантапв через 12 дшв
заражеш асептичш некротичш
шт. % шт. % шт. %
1 30 100 - - - -
2 18 60 12 40 - -
3 4 13 о 3 10 23 77
4 24 80 6 20 - -
5 1 3 28 93 1 3
6 2 7 1 о 3 27 90
7 24 80 6 20 - -
8 - - 29 97 1 3
9 - - 3 9 27 90
Табл. 4. Результант введення експлaнтiв в культуру
Варiант дослщу Кшькють пригшчених експланпв Кшькють шщшованих експланпв
шт. % шт. %
1 18 60 12 40
2 10 33 21 70
о 3 16 53 14 47
4 22 73 8 27
5 19 63 11 37
6 21 70 9 30
7 17 57 13 44
8 4 13 26 87
9 11 37 19 64
Отримаш результати (див. табл. 4) свщчать, що для введення в культуру т уНго експланпв тиса япдного найбiльш придатним виявилось живильне середовище ЬМ, модифiковане фiтогормонами 2,4-0 (0,2 мг/л) + БАП (0,1 мг/л), де отримали 87 % життездатних експланлв на 10-й день культивування (рис.).
Рис. Експлант тиса ягiдного на 10-й день культивування:
а) пригтчений (до^д № 5); б) шцшований (до^д № 8)
Також придатним для м^оклонування дослiджуваного виду можна вва-жати середовище i3 варiанта дослiду № 2 - MS модифшоване такими ж самими фггогормонами: 2,4-D (0,2 мг/л) + (БАП 0,1 мг/л). У разi застосування живиль-ного середовища RW (варiанти дослiду № 4-6) отримано найгiршi результати iнiцiацií дослiджуваних експлантш - 63-73 % пригшчених клонiв.
Отже, можна зробити висновок, що для першого етапу мiкроклонування тиса япдного найкраще застосовувати живильнi середовища LM або MS, моди-фiкованi з допомогою додавання до них 2,4-D та БАП. Також, очевидно, що застосування як стимулятора НОК у вах варiантах достду негативно впливае на цей етап мiкроклонування.
Висновки. Результати стерилiзацií вихiдного рослинного матерiалу нап-ряму залежать вiд концентрацц застосованих хiмiчних реагештв та тривалосп експозицií. Найбiльший вiдсоток асептичних експланпв тиса ягiдного (97 %) отримали внаслiдок íх дезiнфекцií за такою схемою: пропчна вода з милом -24 год, Н2О2 (концентращя 6 %) - 15 хв, С2Н5ОН - 30 с, NaClO (концентрацiя 20 %) - 7 хв, AgNO3 (концентрацiя 0,2 %) - 15 с.
Живильнi середовища LM або MS, модифiкованi фггогормонами 2,4-D (0,2 мг/л) + БАП (0,1 мг/л), забезпечують життездатнiсть дослщжуваних експлантiв у 87 та 70 % випадюв вiдповiдно.
Лiтература
1. Гожан М.Я. Протокол деконтамшаци експлантв культивар1в роду Picea в умовах in vitro / М.Я. Гожан, Р.М/ Гречаник // Проблеми сшьського господарства на сучасному еташ та шляхи ix виршення : матер. наук.-практ. 1нгернет-конференцц (Украша, м. Миколахв: 29 жовтня 2012 року). - МиколаХв : Вид-во МиколаХв. ДСДС 133, 2012. - С. 59-61.
2. Гожан М.Я. Особливост реал1зацн етапу шщацн експланпв культивар1в роду Picea А. Dietr in vitro / М.Я. Гожан, М.М. Гузь, Р.М. Гречаник, М.М. Люовий // Науковий вюник НЛТУ Украши : зб. наук.-техн. праць. - Льв1в : РВВ НЛТУ Украши. - 2014. - Вип. 24.07. - С. 37-42.
3. Калинин Ф.Л. Технология микроклонального размножения растений : монография / Ф.Л. Калинин, Г.П. Кушнир, В.В. Сарнацкая. - К. : Изд-во "Наук. думка", 1992. - 232 с.
4. Жсовий М.М. Полшорф1зм та особливост автовегетативного розмноження Taxus bacca-ta L. / М.М. Жсовий // Науковий вюник НЛТУ Украши : зб. наук.-техн. праць. - Льв1в : РВВ НЛТУ Украши. - 2014. - Вип. 24.1. - С. 57-63.
5. Жсовий М.М. Автовегетативне розмноження декоративних форм тиса япдного / М.М. Жсовий // 64-а науково-техшчна конференцш професорсько-викладацького складу, науко-вих пращвниюв, докторанпв та асшрантпв за шдсумками науковох д1яльност1 у 2013 рощ. -Льв1в : Вид-во НЛТУ Украши. - 2014. - С. 74-77.
6. Лисовый Н.Н. Размножение некоторых декоративных форм Taxus baccata L. черенкованием / Н.Н. Лисовый // Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений : матер. XVII Междунар. науч. конф. - Красноярск : Изд-во СибГТУ, 2014. - С. 82-84.
7. Фшонова Л.Г. Введения в культуру in vitro тису япдного (Taxus baccata L.) i отримання таксол-продукуючих калюсних лшш : автореф. дис. на здобуття наук. ступеня канд. бюл. наук: спец. 03.00.22 / Л.Г. Фшонова; НАН УкраХни. 1н-т клiтии. бiологii i генет. шженери. - К. : Вид-во "Либщь", 1999. - 19 с.
8. Abbasin Z. In vitro Micro-propagation of Yew (Taxus baccata) and Production of Plantlets / Z. Abbasin. [Electronic resource]. - Mode of access http://scialert.net/abstract/?doi=biotech.2010.48.54.
9. Mohan Jain S. Protocols for Micro-propagation of Woody Trees and Fruits / S. Mohan Jain, H. Häggman. [Electronic resource]. - Mode of access http://www.springer.com
10. Springer. [Electronic resource]. - Mode of access http://link.springer.com/article/10.1007/B F00035979
11. Paula P. Chee In vitro Culture of Zygotic Embryos of Taxus Species / P. Chee Paula. [Electronic resource]. - Mode of access http://hortsci.ashspublications.org/content/29/6/695.short
12. MaTepiai з Вшпеди. [Електронний ресурс]. - Доступний з http://uk.wikipedia.org/wiki/ Тис_ягщний
13. Червона книга Украши. [Електронний ресурс]. - Доступний з http://redbook-ua.org/item/ taxus-baccata-l/
Лисовый Н.Н. Особенности стерилизации и введения в культуру in vitro эксплантов Taxus baccata L.
Проведен критический анализ и краткий обзор литературных источников, касающихся исследуемой тематики. Подробно описана примененная методика проведенных исследований: исходный растительный материал, который применяли как эксплан-ты при микроклонировании Taxus baccata L.; очередность использования химических реагентов, их концентрации и продолжительность обработки при стерилизации; виды и модификации питательных сред. Установлена оптимальная схема деконтаминации исходного растительного материала изучаемого вида, подобраны оптимальный состав среды и комбинации фитогормонов для проведения успешной инициации эксплантов. Обобщены и проанализированы полученные результаты.
Ключевые слова: Taxus baccata L., in vitro, эксплант, стерилизация, инициация, питательная среда, деконтаминация.
Lisoviy М.М. Features of Sterilization and Introduction to the Culture in vitro of Explants of Taxus Baccata L.
The critical analysis and a brief review of the literature concerning the studied subjects. Described in detail the methodology of the research applied: the initial plant material used as explants in micropropagation of Taxus baccata L.; sequence use of chemical reagents, their concentration and duration of soaking in sterilization; types and modifying nutrient media. An optimal scheme of decontamination initial plant material studied species and found optimal composition environment and phytohormones combination for a successful initiation explants. Summarized and analyzed the results.
Keywords: Taxus baccata L., in vitro, explants, sterilization, initiation, nutrient medium decontamination.
УДК 630*187 Директор 1.Ф. Коляджин, канд. с.-г. наук -
ДП "Брошшвське лкове господарство "
ДИНАМ1КА СКЛАДУ М1ШАНИХ ЯЛИЦЕВИХ ДЕРЕВОСТАН1В БАСЕЙНУ Р1ЧОК ЛУКВА I Л1МНИЦЯ
Простежено динамжу складу мшаних ялицевих деревосташв у 7 масивах волого! буково-смереково! суяличини Передкарпаття протягом 45 роюв - вщ 1967 до 2012 р. На шсщ шслявоенних зруб1в утворилися природш двоярусш люостани у вщ1 35-50 роюв з перевагою у склад1 ялини (60-80 %). Бук, внаслщок надм1рного зволоження грун-т1в, знаходиться тшьки у шдрост1. Шсля штенсивних саштарних рубок протягом нас-тупних 30-35 рокв сформувалися насадження 1з значною участю, а частше з перевагою ялищ. Оптимальш за породним складом деревостани 5-6Яц 2-3Ял 1-2Бк +Яв та 6-7Яц 1-2Ял 1-2Бк +Яв можна буде сформувати у подальшому 1з застосуванням виб1рко-вих рубок або рубок переформування. У таких насадженнях можливе зрщження намету не нижче з1мкненост1 крон 0,7. При цьому треба постшно регулювати склад деревоста-ну, збшьшуючи частку участ ялищ бука та явора, одночасно зменшуючи участь ялини.
Ключовi слова: ялиця, смереково-буково-ялицев1 деревостани, оптимальний склад, Передкарпаття.
Вступ. Рацiональне лiсокористування передбачае оптимiзацiю просторо-воí' структури лiсових бюгеоценоз1в у межах водозбирання. Оптимiзацiя струк-тури мае враховувати i виходити iз типологiчноí' належностi ценозiв, тобто
