CC BY
67
УДК 634.51:581.143
ОСОБЛИВОСТ1 РОЗМНОЖЕННЯ PINUS SYLVESTRIS L.
В УМОВАХ IN VITRO М.М. Лковий1
Проведено ан^з низки лггературних джерел, як стосуються тематики проведених дослiджень. Подано перелiк найпоширенiших у садово-парковому rocTO^apCTBi декора-тивних вщмш Pinus sylvestris L. Описано детальну характеристику застосовшо! методики проведених експериментальних дослiджень: ступiнчасту схему проведения декон-тамшаци експлаитiв; склад живильних середовищ для шщаци та укоршення отрима-них клонiв дослiджуваиого виду в умовах in vitro. Наведено отримаш результати експериментальних дослщжень з розмноження мiкроклонуваниям Pinus sylvestris L. Узагаль-нено та проаналiзовано отримаиi результати.
Ключовi слова: Pinus sylvestris L., in vitro, експлант, стерилiзацiя, iнiцiацiя, укоршен-ня, живильне середовище.
Вступ. Рвд Сосна (Pinus L.) н^чуе близько 100 видiв, якi ростуть у лках noMipHoro поясу Швшчно1 пiвкулi i в горах швденних широт. В УкраМ наль чуеться 17 видiв сосен, з яких найпoшиpенiшoю е сосна звичайна (Pinus sylvestris L.). Це лiсoтвipна порода, яка мае важливе лiсoгoспoдаpське та лкоме-лiopативне значения. Бiльше 30 % плошд лiсiв нашо! краши формуе дослщжува-ний вид. Оскшьки сосна звичайна характеризуеться високою морозостшкктю, пoсухoстiйкiстю, вiдиoсиoю иевибагливiстю до родючосп грунту, значним ге-нетичним пoлiмopфiзмoм та стiйкiстю до уpбаиiзoваиих умов, то вона стае не-замшною у садово-парковому будiвиицтвi [2, 5, 6].
Для дослщжуваного виду видшено такi декopативиi вiдмiии, яш е щнними для озеленення та, в перспектив^ можуть бути poзмиoжеиi дослщжуваним способом [5]: за габиусом крони: 'Anguina', 'Ascensa', 'Austrian Hills', 'Balenise', 'Beacon Hill', 'Bennett Compact', 'Beuronensis', 'Calle', 'Cerik', 'Columnaris', 'Columna-ris compacta', 'Compressa', 'Condensata', 'Cuffy Sark', 'Doone Valley', 'Fastigiata' ('Pyramidalis'), 'Genevensis', 'Glauca Nana', 'Globosa', 'Globosa viridis', 'Helen Bergman', 'Hillside creeper', 'Hibernia Nana', 'Juto', Katakeimens', 'Little Ann', 'Little Brolly', 'Mitch's Weeping', 'Nana', 'Nana Compressa', 'New Katherine', 'Nis-bet's Gold', Pendula', 'Peve Miba', 'Pixie', 'Repens', 'Riverside Gen', 'Sandringham', 'Saxatilis', 'Skjak', 'Slim Jim', 'Vinney Ridge', 'Zatec', 'Drath ', 'Bexel WB', 'Bexel Seeding', 'Fairy Nuff, 'Gem', 'Minima', 'Viridis Nana Compacta', 'Hesley Hall', 'St. Geore', 'Peve Hamert', 'Zoelen', 'Wenstrobit'; за poзмipами та забарвленням хво!: 'Alba', 'Alderly Eage', 'Argentea', 'Argentea Compacta', 'Aurea', 'Auvergne', 'Barrie Bergman', 'Bialogon', 'Bonna', 'Brevifolia', 'Buchanon's Gold', 'Chantry Blue', 'Clumber hump', 'Gaker's Blue', 'Gold Coin', 'Inverleith', 'Latifolia', 'Mount Vernon Blue', 'Micropylla', Moseri', 'Nivea', 'Spaans Slow Column', 'Variegata'; за комбшовани-ми ознаками: 'Albyns', 'Frensham', 'Glauca Nana', 'Jeremy', 'Kamon Blue', 'Klus Pyramid', Norska', 'Tortuosa', 'Pumila', 'Pygmaea', 'Pyramidalis Glauca', Umbracu-lifera','Watereri' тощо.
Вщомо, що декopативиi вiдмiии дoслiджуваиoгo виду, у бшьшосп випад-кiв, е анеупло'дами, а тому важко розмножуються генеративним способом. Та-
1 докторант М.М. Люовий, канд. с.-г. наук - НЛТУ Украши, м. Львгв
кож дослщжено, що стебловi живцi володiють низькою здатнiстю до ризогенезу [5], а розмноження щепленням потребуе значних затрат кошпв та часу на виро-щування пiдщепного матерiалу. Все це i зумовлюе потребу вдосконалення су-часних методiв розмноження щнних генотишв сосни звичайно!' до яких нале-жить розмноження в умовах in vitro. Цей метод забезпечуе вщтворення генетич-но iдентичного до материнського оргашзму клону, що е важливим у розмно-женнi плюсових дерев, еколопчних та морфологiчних форм тощо.
Огляд лiтератури. В.В. Шлапак та М.В. Небиков (2011) дослщжували особливосп насiнного розмноження сосни звичайно!' в умовах in vitro. Як експланти автори використовували насiння молодих дерев (25-30 роюв). Найкращi результати стерилiзацií вихiдного рослинного матерiалу отримали шд час деконтамiнацií його 0,1 %-м водним розчином дихлориду ртутi (експо-зицiею 1 хв), а найефектившшим живильним середовищем виявилось MS моди-фiковане 6-БАП (2,0 мг/л) [6]. И.П. Филиппова (2010) рекомендуе для калюсо-генезу сосни звичайно!' використовувати як експланти молодi проростки та зрш зиготичнi зародки пасажованi на живильне середовище '/г MS модифжоване до-даванням 2,4-Д (2 мг/л) та 6-БАП (1 мг/л). Активне утворення адвентивних бруньок спостерiгалось у дослвджуваних експлантiв на середовищi % MS моди-фiковане цитокiнiнами [7]. Робота U. Andersone та G. Ievinsh (2008) присвячена дослiдженню рН живильного середовища пiд час мжроклонуваннясосни зви-чайно!'. Встановлено, що у процес культивування експланти (бруньки) спричи-няють окисления середовища. Вiдповiдно, зроблено припущення про доцшь-нiсть зниження вихiдного рiвня рН для устшного розмноження дослiджувано-го виду в умовах in vitro [8].
Загалом, можна зробити висновок про обмежену кiлькiсть наукових праць з дослщжувано1 тематики, що пiдтверджуе актуальшсть проведених дослi-джень.
Матерiали та методи дослвдження. Усi експериментальнi дослвдження з мiкроклонального розмноження сосни звичайно1 проведено у лабораторií куль-тури тканин кафедри лiсових культур i лiсовоí селекцií НЛТУ Укра1'ни за за-гальноприйнятими у бiотехнологií методиками [1, 3].
Для приготування живильних середовищ та виконання певних операцш з мiкроклонування дослiджуваного виду використано таю матерiали та обладнан-ня: пiнцети, скальпелi, препарувальнi голки, чашки Петр^ пробiрки (50 мл), колби (1000 мл), рН-метр, кондицiонер, люксметр, апарат для струшування, стерилiзатор вертикальний (автоклав), електрофотокалориметр, ламiнар 70-БВ, стш для ламiнару, дозатор А-2, термостат TL-80, стерилiзатор, повiтряний, гiд-родистилятор та ультрафiолетовi лампи.
Стерилiзацiю шструменпв здiйснювали сухим жаром у сушильнш шафi за температури 180 °C упродовж 1,0-1,5 год. Перед пасажуванням кожного експлантата iнструменти стерилiзували фламбуванням, попередньо обробивши 1х 96 % С2Н5ОН, пiсля чого промивали стерильною дистильованою водою. Усi роботи проводили у ламшарнш кiмнатi, попередньо простерилiзованiй бактери-цидними ультрафiолетовими лампами протягом 1,5-2,0 год [3]. Як експланти використано вегетативш бруньки, отриманi з молодих рослин сосни звичайно!'
(вшом 5-7 ротв), вирощенi i3 насшня в умовах вдаритого грунту, в перюд початку вегетацп. З ввдбраного рослинного матерiалу вiддiляли конус наростання (апекс), який i слугував експлантом.
Загалом, увесь процес розмноження сосни звичайно! в умовах in vitro, у проведених дослiдженнях, можна умовно подшити на три послiдовнi етапи: де-контамiнацiя (стерилiзацiя) вихiдних ексиланпв, iнiцiацiя !х росту та ризогенез (укоршення) отриманих рослин-регенераштв.
Першочерговим завданням мiкроклонування е отримання асептично! куль-тури. Для цього виxiднi експланти пiддавали ступiнчастiй стеришзаци, яка по-лягала у почерговому обробiтку рослинного матерiалу такими стерилiзацiйни-ми агентами рiзноi концентраций протiчна Н2О з детергентом; С2Н5ОН; NaClO; та AgNO3 з рiзною експозицiею обробiтку. Пкля кожного реактиву експланти тричi промивали стерильною дистильованою Н2О по 4-5 хв та помщали на жи-вильне середовище MS без фгтогормошв, щоб вибрати кращу схему стерилiза-цп [4]. Простерилiзованi експланти, для етапу шшдаци та укоршення пасажува-ли на три найбшьш придатнi для хвойних рослин типи живильних середовищ MS (Murashige and Skoog medium), RW (Risser and White medium), LM (Litvay medium), ят модифшували рiзним складом та концентращею фiтогормонiв.
Культивування експлантiв проводили у культуральнш кiмнатi за таких умов: температура пов^я 20-22 °С, вiдносна вологiсть повiтря 30-35 % та 16-годинний фотоперiод (3 кЛк).
Результати дослщження. Спостереження за результатами стерилiзацil ексиланпв проводили протягом 10-15 днiв, тсля чого !х вiзуально класифжува-ли таким чином: контамiнованi (зараженi); некротичнi (пошкодженнi хгшчними агентами); асептичнi (стерильнi) (табл. 1).
Табл. 1. Результати деконтамтацй експлантiв сосни звичайноЧ
к % Застосований реагент (у послщовносп використання) Отримано експланти, %
С2Н5ОН* Н2О + детергент NaClO С2Н5ОН AgNO3
концентра-цiя, % .5" ц S it о и к ° о к ч> .5" и " 3 О о к ^ о к ч> концентра-цiя, % .5" ц к К я О X к о к ч> концентра-щя, % .Я ц S it о « к ° о к ч> концентра-щя, % .5" ц к К я О X к о к ч> - о к 11 Ё я о к асептичш некротичт
1 - - 24 30 5 50 10 0,1 5 100 - -
2 - - 50 5 70 10 0,2 5 96 4 -
3 - - 70 5 96 10 0,3 5 86 - 14
4 70 5 30 5 - - 0,1 5 78 22 -
5 70 10 50 5 - - 0,2 5 67 10 23
6 70 15 70 5 - - 0,3 5 36 30 34
7 96 5 - - 50 10 0,1 5 82 18 -
8 96 10 - - 70 10 0,2 5 76 22 2
9 96 15 - - 96 10 0,3 5 65 6 29
10 96 5 30 5 50 10 0,1 5 34 66 -
11 96 10 50 5 70 10 0,2 5 2 98 -
12 96 15 70 5 96 10 0,3 5 - 84 16
* Застосовували до початку видшення меристем (розбирання бруньок).
Отриманi результати (див. табл. 1) свщчать, що найефективнiшою вияви-лась така схема деконтамшацп вихiдного рослинного матерiалу дослщжуваного виду: С2Н5ОН (96 % 10 с) пропчна Н2О з детергентом (24 год); КаСЮ (5 % 5 с); С2Н5ОН (70 % 10 с) та ЛвКОз (0,2 % 5 с), яка забезпечила 98 % асептичних ексиланлв (варiант дослiду № 11). Також встановлено, що вщсутшсть першо-чергового обробггку експлантiв С2Н5ОН забезпечуе найбiльший вщсоток конта-мiнованих експлантiв (86-100 %, варiанти дослiду № 1-3) (рис. 1-2).
1шщащю експлантiв сосни звичайно'' проводили на живильних середови-щах МБ, RW та ЬМ, яю модифiкували з допомогою таких фггогормошв у рiз-них комбiнацiях та концентращях: 2,4-0 (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота), НОК (а-нафтилоцтова кислота) та БАП (6-бензоламшоиурин). Спостереження проводили протягом 50 дiб. До iнiцiйованих експлантiв вiдносили п, якi у три та бтьше разiв збтьшили сво'1 лiнiйнi розмiри (табл. 2) (рис. 3).
Рис. 1. КонтамЫований експлант Рис. 2. Асептичний експлант Табл. 2. Результати иищаци експлантгв сосни звичайног_
№ з/п Живильне Застосований фiтогормон, мг/л 1нщшоваш
середовище 2,4-Б НОК БАП експланти, %
1 - 0,5 0,1 42
2 МБ 0,2 0,1 20
о 3 0,2 0,5 — 88
4 0,2 0,5 0,1 92
5 - 0,5 0,1 54
6 RW 0,2 0,1 32
7 0,2 0,5 - 70
8 0,2 0,5 0,1 72
9 — 0,5 0,1 32
10 ЬМ 0,2 0,1 26
11 0,2 0,5 - 64
12 0,2 0,5 0,1 78
Отримаш результати (див. табл. 2) свщчать, що найвищий вщсоток шщь ац11 експлантiв спостерiгався на живильних середовищах iз вмютом усiх трьох
фiтогормонiв. Найгiршi результати отримували за вiдсутностi у середовищi стимулятора НОК. Загалом, найбтьше iнiцiйованих експлантiв отримали у варiан-тах дослiду № 4 та 12-92 та 78 % вщповщно.
Для ризогенезу отриманих клошв, врахувавши попереднi результати, було застосовано живильш середовища МБ та ЬМ iз вдвiчi зменшеною концентра-щею мiнеральних солей. 1х модифiкацiю проводили ттьки ауксинами НОК та 1ОК, осктьки вони, як вiдомо, стимулюють коренеутворення Спостереження проводили протягом 50-60 дiб (табл. 3) (рис. 4).
Даш табл. 3 свщчать, що найбiльша кiлькiсть укорiнених експлантiв спос-терiгалась на живильному середовищi 1/2 МБ + 0,5 мг/л НОК + 1,0 мг/л 1ОК -86 %. Також, задовiльними можна вважати результати, отримаш у варiантах дослiду № 4 та 8, де устшшсть становила 72 та 78 % вщповщно. Отриманi результати свщчать, що для укоршення клонiв дослiджуваного виду важливим е наявшсть у складi живильного середовища 1ОК.
Табл. 3. Результатиукортення експлaнтiв сосни звичайног
№ з/п Живильне середовище Застосований фкогормон, мг/л Укоршеш експланти, %
НОК 1ОК
1 1/2 МБ 0,5 1,0 86
2 1,0 0,5 58
3 1,0 - 52
4 - 1,0 72
5 1/2 ЬМ 0,5 1,0 66
6 1,0 0,5 60
7 1,0 - 48
8 - 1,0 78
Я
Рис. 3.1нщшований експлант Рис. 4. Укортений клон
Висновки. Унаслщок проведених експериментальних дослiджень можна зробити таю висновки: найефектившшою виявилась ступiнчаста схема деконта-мiнацií вихiдного рослинного матерiалу дослiджуваного виду, яка полягала у почерговому обробiтку вихiдного рослинного матерiалу такими хiмiчними агентами: С2Н5ОН (96 % 10 с) пропчна Н2О з детергентом (24 год); №00 (5 %
5 с); С2Н5ОН (70 % 10 с) та AgNO3 (0,2 % 5 с); найбшьший вщсоток шщшова-них експлантш спостер1гався на живильному середовишд MS + 0,2 мг/л 2,4-D + 0,5 мг/л НОК + 0,1 мг/л БАП; найкраще укоршення дослвджуваних клошв вщ-бувалось на середовищд 1/2 MS + 0,5 мг/л НОК + 1,0 мг/л 1ОК.
Лггература
1. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе : учебн. пособ. / Р.Г. Бутенко. - М. : Изд-во ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.
2. Кохно М.А. Дендрофлора Украши. Дикороап та культивоваш дерева й кущi. Голонасш-ш: довiдник / М.А. Кохно, В.1. Гордiшко, Г.С. Захаренко та ш.; за ред. М.А. Кохна, С.1. Кузнецова; Нац. бот. сад iM. М.М. Гришка. - К. : Вид-во "Вища шк.", 2001. - 207 с.
3. Калинин Ф.Л. Технология микроклонального размножения растений : монография / Ф.Л. Калинин, Г.П. Кушнир, В.В. Сарнацкая. - К. : Изд-во "Наук. думка", 1992. - 232 с.
4. Жсовий М.М. Деконтамшацш експланпв Pinus sylvestris L. при розмноженш в умовах in vitro / М.М. Жсовий // Лю, наука, молодь : матер. IV Всеукр. наук.-практ. конф. студенпв, мапс-трiв, астранпв i молодих вчених, присвячено! 15^ччю факультету лiсового господарства. -Житомир : Вид-во ЖНАЕУ, 2016. - С. 22-24.
5. Жсовий М.М. Особливост полiморфiзму, використання у озеленены та щеплення деко-ративних форм Pinus sylvestris L. / М.М. Жсовий // Науковий вюник НЛТУ Украши : зб. наук.-техн. праць. - Львш : РВВ НЛТУ Украши. - 2013. - Вип. 23.18. - С. 17-22.
6. Шлапак В.В. Особливост насшневого розмноження Pinus sylvestris L. в умовах in vitro / В.В. Шлапак, М.В. Небиков // Науковий вюник НЛТУ Украши : зб. наук.-техн. праць. - Львш : РВВ НЛТУ Украши. - 2011. - Вип. 21.14. - С. 43-48.
7. Филипова И.П. Адвентивное почкообразование и каллусогенез у сибирских видов хвойных в культуре in vitro / И.П. Филипова. [Электронный ресурс]. - Доступный с http://www.dissercat.com/content/adventivnoe-pochkoobrazovanie-i-kallusogenez-u-sibirskikh-vidov-khvoinykh-v-kulture-vitro
8. Andersone U. Medium pH aff ects regeneration capacity and oxidative enzyme activity of Pinus sylvestris in tissue culture / U. Andersone. [Electronic resource]. - Mode of access http://eeb.lu.lv/EEB/2008/Andersone.pdf
Надг'йшла доредакцп 21.12.2016р.
Лисовый Н.Н. Особенности размножения Pinus sylvestris L. в условиях in vitro
Проведен анализ ряда литературных источников, касающихся тематики проводимых исследований. Представлен перечень наиболее распространенных в садово-парковом хозяйстве декоративных форм Pinus sylvestris L. Приведена подробная характеристика примененной методики проведенных экспериментальных исследований: ступенчатая схема деконтаминации эксплантов; состав питательных сред для инициации и укоренение полученных клонов изучаемого вида в условиях in vitro. Представлены полученные результаты экспериментальных исследований по размножению микроклонированием Pinus sylvestris L. Обобщены и проанализированы полученные результаты.
Ключевые слова: Pinus sylvestris L., in vitro, эксплант, стерилизация, инициация, укоренение, питательная среда.
Lisoviy М.М. Some Features of Pinus Sylvestris L. Reproduction under In Vitro Conditions
The analysis of a number of references concerning the subject of the research is made. The list of the most common ornamental forms of Pinus Sylvestris L. in landscaping is composed. We provide a detailed description of the applied methodology of experimental research that is the following: step pattern of explants decontamination; composition of culture media for initiation and rooting of derived species clones investigated under conditions in vitro. The results of experimental studies of micropropagation of Pinus Sylvestris L. are presented. The results are ummarized and analyzed.
Keywords: Pinus sylvestris L., in vitro, explants, sterilization, initiation, rooting, nutrient medium.
УДК 635.82
ГЛИВА ЗВИЧАЙНА (PLEUROTUS OSTREATUS) У СИСТЕМ1 БЮЦЕНОТИЧНИХ СТОСУНК1В 13 ШК1ДНИКАМИ В.П. Кучерявий1, В.В. Попович2, М.М. Лесь3
Глива звичайна (Р1еиго(ш оз1геа1ш) - цшний 1ст1вний гриб в умовах екстенсивного вирощування у пришських зелених насадженнях Львова, часто опиняеться поживою для слимаюв, з якими й пов'язують т1сш бюценотичш стосунки. Шд час дослщження на експериментальнш дшянщ з вирощування гливи звичайно! на вщрубках дерев листяних порщ у Страдчанському лкнищв неподалш Львова встановлено пошкодження плодо-вих тш слимаком великим та личинками мухи-горбатки. Виявлено зб1г оптимальних клшатичних умов гливи звичайно! 1 слимака, який використовуе цей перюд для жив-лення плодовими тшами гриба. Личинки мухи-горбатки, вогнищем розмноження яко! е сховище, що знаходиться неподалш, пошкоджують вщ 5,0 до 5,7 % плодових тш.
Ключовi слова: бюценотичш стосунки, глива звичайна, слимак, муха-горбатка, личинка, плодове тшо.
Вступ. Дослiдження бiотичних стосункiв охоплюють еколопчш зв'язки, якi спостерiгаються у простих дво- або юлькавидових системах. Таю досль дження видаляють низку закономiрностей динамiки чисельностi, пов'язаних зi ствжиттям у природi. Бiоценотичний ршень стосункш характеризуеться пере-важно дизкооперацiйними коакщями мiж окремими популяциями з домшуван-ням зв'язкiв експлуатацiйного типу, тобто таких, за яких одна з популяцш (експлуатована) втрачае, а шша (експлуатуюча) користуеться такою ситуацiею. Абсолютна бшьшкть популяцiй-консументiв, якi входять до складу бюценозу, одночасно експлуатують i е експлуатованими, що забезпечуе обк речовини i енергií, а отже - i тривалiсть життя.
У процес екстенсивного вирощування гливи звичайно1 (Р1еигогт о$гге-аШй), яке вщбуваеться в межах лiсового бiогеоценозу, остання виступае в ролi експлуатовано1 популяцн, а ц шкiдники - слимак Птах тахтш i муха-горбатка Нуросега 1пегазза1а (товстобедрова) - е експлуататорними популящями. Представники обох видш виступають в ролi експлуатованих, коли стають жертвами землерийок, жакш, птахш, а мухи-горбатки - в основному птанв.
Слимаки - збiрна група наземних безраковинних молюскiв iз класу равли-кiв. Довжина повзучо1 тварини вiд 1,5 до 20 см. 1хня шкiра покрита чисельними слизистими залозами. У листяних лках живе близько 60 видш слимакш [1].
Програма дослiдження. Передбачалося дослiдити розвиток слимака великого i мухи-горбатки у перiод плодоношення гливи звичайно1 (Р1еигогт о^ге-аШй) i виявити пошкодження плодових тiл гриба.
Методи дослщження: систематичнi, мколопчш, фенологiчнi, мшроктма-тичнi, грунтознавч^ статистичш.
Результати дослщження та обговорення. Слимак великий (Ытах тах1-тт) - рослинощний вид, живиться гiфами i плодовими тiлами грибш, листя-ним опадом. На рослинах з'1дае листя (вигризае великi дiрки), соковитi стебла i
1 проф. В.П. Кучерявий, д-р с.-г. наук - НЛТУ Украши, м. Льв1в;
2 доц. В.В. Попович, канд. с.-г. наук - Льв1вський НУ безпеки життедшльнот;
3 астр. М.М. Лесь - НЛТУ Украши, м. Льв1в
